的电极，所述电极上固定有组胺包被原。
[0047]所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝(Fe4[Fe (CN) 6]3)的摩尔浓度比为1:400，壳聚糖含量为0.01%
一种上述免疫生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
S1.将0.0lg壳聚糖溶于100 mL 1.0%的醋酸溶液中，室温下搅拌2 h，使壳聚糖完全溶解，配制成 0.01% 壳聚糖溶液。将 0.0163 gFeCl3，0.0329 g K3 [Fe (CN)6], 0.7455 g KCl以及I mL浓盐酸加入100 mL上述壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的暗绿色分散液；再将制备好的I mL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散0.5 h至完全溶解，制备得到沉积液；
将丝网印刷电极分别在乙醇和超纯水中超声处理lmin，氮气吹干，再将丝网印刷电极在+0.4V电压下浸在配制好的沉积液中，沉积时间为120 s ;
电极浸在0.1 M KC1/0.1 M HCl溶液中在-0.6 V到+0.8V之间扫描循环伏安图直至图像稳定，使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。
[0048]S2.在电极表面滴涂用0.1 M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释后浓度为10 ug/mL的包被原，使其在微碱的环境下能更好地将包被原固定在纳米膜修饰的电极表面，4°C孵育14 h0
[0049]S3.滴涂5%脱脂奶粉以封闭电极表面非特异性位点，37°C孵育lh，用0.01 M磷酸盐冲洗、风干，制备得到所述免疫生物传感器。
[0050]进一步地，分别配制浓度为0.001，0.01, 0.1, I, 10, 100 ng/mL的组胺标准液，按照上述制备方法进行循环伏安扫描，得到该免疫传感器检测范围为0.044-1.91 ng/mL(IC20~IC80)及检测限为 0.00818 ng/mL (IC10)，R2=0.996，见图 5。
[0051]对比例I
本对比例所述免疫生物传感器及其制备方法基本与实施例1相同，不同之处在于本对比例采用如下几种复合膜电极:处理①采用表面有壳聚糖-普鲁士蓝复合膜的电极；处理②采用表面有壳聚糖-纳米金复合膜的电极；处理③采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-多壁碳-纳米金复合膜的电极。
[0052]按上述①处理得到的免疫生物传感器，电流响应值较小，且对0.001~100ng/mL不同比例组胺标准品检测无法获得标准曲线，原因可能是蛋白与传感器界面间的电子传递局部受阻，使得电流响应值变小，传感器灵敏度下降。按上述②处理得到的免疫生物传感器，电沉积后电极表面负载纳米金的量比较少，电流响应值较小，且膜易脱落，原因可能是小粒径纳米金不适合单组分修饰电极，且在实验操作容易被冲洗离开电极表面。处理③的电化学表征结果说明多壁碳纳米管并不能高效修饰在电极表面，原因可能是它不适合通过电沉积的方法来修饰在电极表面，而含多壁碳纳米管的复合膜在传感器的准确性及灵敏度并无明显优势。
[0053]对比例2
本对比例所述免疫生物传感器及其制备方法基本与实施例1相同，不同之处在于本对比例复合膜中普鲁士蓝、壳聚糖、纳米金采取如下几种比例:处理①普鲁士蓝和纳米金的比例与实施例1相同，壳聚糖质量浓度为20% ;处理②纳米金与普鲁士蓝(Fe4[Fe (CN)6]3)的摩尔浓度比为1:2，壳聚糖浓度与实施例1相同。
[0054]按上述①处理得到的免疫生物传感器，很难溶解制备均一稳定的电沉积溶液，且生物膜晾干后易脱落，原因可能是虽然壳聚糖具有粘度成膜性好，但是浓度过高超出电极表面的负载能力。按上述②处理得到的免疫生物传感器，电沉积后对电极表面进行循环伏安测试，表征显示峰电流值与原比例对比并不会持续变大，且有变小的趋势，不能实现信号放大，因此在检测过程中无法提高系统的灵敏度。
[0055]对比例3
本对比例所述免疫生物传感器及其制备方法基本与实施例1相同，不同之处在于本对比例所述电沉积步骤采用如下处理方式:处理①首先在电极表面电沉积壳聚糖-普鲁士蓝，然后按同样的方法电沉积壳聚糖-纳米金；处理②首先在电极表面电沉积壳聚糖-纳米金，然后按同样的方法电沉积壳聚糖-普鲁士蓝。
[0056] 按上述处理①~②得到的免疫生物传感器电极间差异较大，原因可能是电沉积过程中操作步骤增多，影响了电极沉积的稳定性，整个检测系统的准确度显著降低。
【主权项】
1.一种检测组胺的可抛式一步电沉积免疫生物传感器，其特征在于，采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜的电极，所述电极上固定有组胺包被原；其中，复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩尔浓度比为1:2000-1:20，壳聚糖的质量体积含量为0.01-0.05%。2.根据权利要求1所述的免疫生物传感器，其特征在于，所述电极为丝网印刷电极，所述丝网印刷电极将工作电极、参比电极和辅助电极集为一体。3.根据权利要求2所述的免疫生物传感器，其特征在于，所述工作电极、参比电极和辅助电极的电压及电流通过USB转换线与丝网印刷电极传输连接。4.根据权利要求1所述的免疫生物传感器，其特征在于，所述组胺包被原的包被浓度为 0.001—1 mg/mL。5.一种权利要求1所述免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.制备沉积液，在+0.4V电压下一步电沉积使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜； 52.在电极工作区域固定组胺包被原； 53.滴涂封闭液以封闭电极表面非特异性位点，冲洗、风干，制备得到所述免疫生物传感器。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，SI所述沉积液的制备方法为:将普鲁士蓝加入壳聚糖溶液，超声分散，得到稳定的暗绿色分散液，再向分散液中加入纳米金溶液，超声分散至完全溶解，制得沉积液。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将0.5-5 mM FeCl 3/K3 [Fe (CN) 6]，0.1M KCl以及1~10 mM HCl的复合溶液溶于0.01~0.05%壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，得到稳定的暗绿色分散液；再向分散液中加入纳米金胶使其终浓度为2.5 -25 μΜ，超声分散至完全溶解，制得沉积液。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，SI所述电沉积的方法为:将电极浸在制得的沉积液中，沉积60~300s，再将电极浸于稳定液中，在-0.6V到+0.8V电压下进行循环扫描直至图像稳定。9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，S2所述固定组胺包被原的方法为:用缓冲液稀释组胺包被原，滴涂至电极表面，4°C孵育10~14h。10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S3为在电极表面滴涂封闭液，37°C孵育lh，冲洗电极表面，风干，制备得到所述免疫生物传感器。
【专利摘要】本发明属于生物传感器技术领域，具体公开了一种检测组胺的可抛式一步电沉积免疫生物传感器及其制备方法。本发明免疫生物传感器采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜的电极，所述电极上固定有组胺包被原；其中，复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩尔浓度比为1:2000~1:20，壳聚糖的质量体积含量为0.01~0.05%。并且，采用一步沉积电极的方式使电极表面获得复合膜，沉积步骤比传统高分子聚合物修饰电极制备步骤简便，且更容易暴露抗原结合位点。本发明免疫生物传感器将竞争免疫反应和生物传感器相结合，并可根据需要得到组胺检测工作曲线等一系列性能表征，具有操作简单、灵敏度高、快速方便等优势，可用于样品中组胺的现场快速检测。
【IPC分类】G01N27/26, G01N27/30, G01N33/53
【公开号】CN104897748
【申请号】CN201510287384
【发明人】徐振林, 孙远明, 董秀秀, 梁祖培, 沈玉栋, 杨金易, 王弘, 雷红涛
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日