一种同时制备伏马毒素b1,b2和b3标准品的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农产品安全检测技术领域，具体地说涉及一种同时制备伏马毒素B1， B2和B3标准品的方法。
【背景技术】
[0002] 伏马毒素是由串珠镰刀菌（Fusariummoniliforme)在一定温度和湿度条件下繁 殖产生的水溶性次级代谢产物，其中最为重要的是伏马毒素Bl，B2和B3,能够广泛污染玉 米、小麦、大米等农作物，具有神经毒性、肺毒性、肝毒性、肾毒性、致癌性，并具有一定的免 疫毒性、胚胎毒性和植物毒性，给人畜的生命健康和财产安全带来了严重的危害。
[0003] 由于伏马毒素的较强的毒性及广泛分布的特性，已经引起了世界范围内的高度重 视，目前已经开展了伏马毒素Bl、B2和B3的检测技术的研宄。其中，标准品是计量活动尤 其是化学计量活动的重要载体。研制伏马毒素标准品，对确保各级、各部门检测数据的量值 统一、准确和可溯源性，继而实现测量结果的国际互认和为政府决策提供准确依据具有重 要意义，并且其在促进社会发展和推动经济建设中也将发挥着越来越重要的作用。此外，开 展伏马毒素的筛查、形成机理、代谢规律及危害评估等方面的研宄，也必须用到大量的伏马 毒素标准品。
[0004] 但是，关于伏马毒素标准品的制备技术研宄非常薄弱，现有的商品化的伏马毒素 B1，B2和B3标准品主要由国外进口，价格非常昂贵，其中伏马毒素B1的价格即上千元每毫 克，而伏马毒素B3甚至达到了近万元每毫克。以最为便宜的小鼠毒理学实验为例，假如单 次灌胃给药20毫克，一次实验的成本即近10万元，这显然是不可实现的。标准品价格的昂 贵导致很多科学研宄无法继续下去。
[0005] 国内外现有伏马毒素分离纯化的文献报道较少，主要是通过硅胶层析柱结合薄层 色谱法和离心分配色谱法进行粗分离，但这些方法都存在着一次处理样品量少、纯度较低、 回收率不高和制备效率较低等缺点。因此，建立一种能够用于多种伏马毒素的同时制备方 法具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种同时制备伏马毒素Bl，B2和B3标准品的方法，该方法 包括如下步骤：
[0007] 样品提取：将样品先米用有机溶剂和水的混合溶液提取；
[0008] 固相萃取柱净化：提取液经过正离子交换前处理固相小柱粗净化；
[0009] 中压制备：分别通过反相和正相制备色谱柱分离制备伏马毒素B1、B2和B3的标准 品。
[0010] 该方法十分适合小麦、玉米、大米、PDA等谷物基质中伏马毒素B1、B2和B3标准品 的纯化制备。
[0011] 具体的说：
[0012] (1)提取样品为能够被伏马毒素B1、B2和B3污染的谷物样品，如玉米、小麦、大米、 PDA或其它谷物样品；
[0013] (2)提取液为有机溶剂和水的混合液，其中有机溶剂为甲醇、乙腈或其它性质 相似的有机溶剂；有机溶剂与水的比例为：5/95-95/5(v/v);提取溶剂与样品的比例为： 0. l/l-100/l(v/m);提取方式为：超声、震荡、均质或者其它，提取时间为10min-4h ;
[0014] (3)用于粗净化的前处理固相小柱为阳离子交换柱，其填料为阳离子交换材料，如 MAX小柱，MultiSep 211Fum小柱或其它类似特征填料的固相净化柱；液体流速（包括上样 液、淋洗液、洗脱液）为〇? l-l〇mL/min ;
[0015] (4)中压制备的第一步为反相制备色谱制备，所采用的制备色谱柱的填料为反相 填料，如Unitary C18制备色谱柱（10mmX 250mm，5 y m)或其它类似制备柱；流动相A相为 乙腈、甲醇或其他有机溶剂，B相为水、或含有甲酸或乙酸的水溶液，甲酸或乙酸与水的比例 为 0? 1 % -5 % (v/v))，进样量为 0? l-5mL ;
[0016] (5)中压制备的第二步为正相制备色谱精制备，所采用的制备色谱柱的填料为正 相填料，如Semi-Preparative SB-CN制备色谱柱（9. 4mmX250mm，5iim)或其它类似制备 柱；流动相A相为乙腈、甲醇或其他有机溶剂，B相为水、或含有甲酸或乙酸的水溶液，甲酸 或乙酸与水的比例为0. 1% -5% (v/v))，进样量为0. l-5mL。
[0017] 本发明的有益效果主要体现在：
[0018] (1)首次建立了一种能够同时用于伏马毒素B1、B2和B3三种标准品的制备方法；
[0019] (2)与现有的单种伏马毒素制备方法相比，建立的制备方法更加高效快捷，在48h 内即可获得伏马毒素Bl，B2和B3三种标准品各10mg ;
[0020] (3)制备获得的伏马毒素标准品纯度均高于98%，满足实验需要；
[0021] (4)实验流程固定，可重复性强，一般实验人员简单培训即可完成，实用性强；
[0022] (5)制备成本低廉，主要是仪器的消耗，三种标准品（10mg)消耗成本总价不足 2000 元。
[0023] 本发明的伏马毒素Bl、B2和B3的制备方法稳定、成熟，能够适用于玉米、大米、小 麦、PDA等多种谷物基质中的伏马毒素的制备，成本低廉、制备流程高效快捷，标准品纯度 尚，效果好。
【附图说明】
[0024] 图1为实施例一制备获得的伏马毒素B1、B2和B3三种标准品的LC-MS/MS定性分 析结果，A为母离子图，B为子离子碎片图。
[0025] 图2为实施例一制备获得的伏马毒素Bl、B2和B3三种标准品谱图
[0026] 其中：（a):伏马毒素B1的H i普
[0027] (c):伏马毒素B2的H谱
[0028] (e):伏马毒素B3的H谱
[0029] (b):伏马毒素B1的C谱
[0030] (d):伏马毒素B2的C谱
[0031] (f):伏马毒素B3的C谱。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0033] Oasis MAX固相萃取柱（Waters公司，美国）
[0034] Unitary C18制备色谱柱（华谱新创科技有限公司，中国）
[0035] Semi-Preparative SB-CN 制备色谱柱（Agilent 公司，美国）
[0036] Thermo C18 色谱柱（Thermo Fisher 公司，美国）
[0037] 超高效液相色谱仪配二极管阵列检测器（UPLC-PDA) (Waters公司，美国）
[0038] 实施例一伏马毒素B1、B2、B3标准品的制备
[0039] 1、样品提取
[0040] 将烘干后的被伏马毒素污染的大米样本（随机市售大米，筛选出被伏马毒素污染 的样品）放入固体粉碎机中粉碎，通过1mm孔径网筛过滤。取200±0.0 lg样品粉末置于 2000mL广口瓶中，加入1000mL乙腈-水（50:50, v/v)溶液置摇床150rpm振荡过夜，然后以 whatma5滤纸过滤。将滤饼用1000mL乙腈-水（50:50，v/v)重悬，150rpm振荡2h，过滤。 合并两次滤液后置旋转蒸发仪40°C浓缩至提取液中乙腈的含量为10% (v/v)左右。
[0041] 2、固相萃取柱净化
[0042] 取20mL提取液置于50mL离心管中，加入10mL正己烧，3000r/min离心10min，弃 上清液和中间油污，取下层溶液过MAX柱。MAX柱依次用5mL甲醇和5mL甲醇-水（3:1，v/ v)活化，然后加入10mL样品液，再依次加入5mL甲醇-水（3:1，v/v)和5mL甲醇淋洗MAX 小柱，最后用10mL甲醇-乙酸（99:1，v/v)洗脱，收集洗脱液，在40°C氮气吹干，残渣用乙 腈-水（50:50, v/v)定容至lmL，过0. 22 ym滤膜后待用。
[0043] 3、中压制备
[0044] 3. lUnitary 018制备色谱柱制备
[0045] 色谱条件：Unitary C18制备色谱柱（10mmX 250mm，5 y m);流动相A为含0? 1 %甲 酸的水溶液（v/v)，流动相B为乙腈；流速3. OmL/min;进样量1000 y L。洗脱条件设置见表 1〇
[0046] 表1制备液相色谱梯度洗脱条件
[0047]
[0048] 3. 2Unitary C18制备色谱柱馏分采集
[0049] 经Unitary C18制备色谱柱分离使FB ^ FBjP FB 3完全分离，在不同时间段内分别 采集FBp FBJP FB 3馏分，不同样品之间分别设置洗针程序，防止不同样品交叉污染。不同 样品收集及洗针时