一种五味子中5-羟甲基糠醛的含量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药材化学成分的检测，特别涉及五味子中的检测方法。
【背景技术】
[0002] 五味子[Schisandra chinensis(Turcz. )Baill.]为木兰科五味子属 (Schisandra)多年生左旋落叶木质藤本植物，其成熟果实干燥后作药用，因其果实甘、酸、 辛、苦、咸五味俱全，故名五味子，主产于黑龙江、吉林、辽宁等地，习称"北五味子"。具有收 敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能。用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、 盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等症。五味子多为9月前后成熟，为浆果，果 实含水量较高，采收后需及时加工干燥以利于贮存保证药材品质。传统多采用阴干、晒干等 方式，因其需要大量劳动力且受天气情况影响干燥过程不易控制，现多采用烘干的方式进 行干燥。但是不同的干燥时间和干燥温度对药材品质具有重要影响。
[0003] 5-羟甲基糠醛（5-HMF)，又称5-羟甲基-2-糠醛，是由葡萄糖等单糖化合物在高 温或弱酸等条件下产生的一个醛类化合物，是Maillard反应的典型产物之一。文献中表述 该化合物对人体横纹肌和内脏有损害，具有神经毒性，能与人体蛋白质结合产生积蓄中毒， 2010年版中国药典二部中明确规定了它在含葡萄糖注射液中的限量。此外，近年来也有 研究表明，它具有抗氧化、抗心肌缺血、改变血液流变学等对人体有益的作用。目前5-HMF 测定主要为UV法和HPLC法，五味子应用广泛，在加工干制的过程中会产生5-HMF，但是五 味子药材中5-HMF的含量测定未见文献报道，因此本实验采用HPLC-UV建立五味子药材中 5-HMF的含量测定方法，对于研究炮制作用机理，规范炮制工艺，控制饮片炮制质量具有一 定意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确、重复性好的五味子中5-羟甲基糠 醛的含量检测方法。
[0005] 本发明提供的五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，包括以下步骤
[0006] (A)供试品溶液的制备；
[0007] (B)对照品溶液的制备；
[0008] (C)高效液相色谱法测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色 谱仪，按照一定的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
[0009] 上述步骤(A)为取过60目筛的五味子药材粉末，冰浴超声或冰浴振摇提取，将得 到提取离心，过滤，定容，过〇. 45 y m滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0010] 进一步的，上述步骤（A)为取过60目筛的五味子药材粉末0. 5-1. 5g，精密称定，置 离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声或冰浴振摇提取，每次20-30min，共提取3-4次，合并提 取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0. 45 y m滤膜，取续滤液作为 供试品溶液。
[0011] 更进一步的，上述步骤(A)为取过60目筛的五味子药材粉末约l.OOg，精密称定， 置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取3次，合并提取液，离心，过 滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0. 45 y m滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0012] 上述步骤（B)为精密称取5-HMF对照品，加甲醇溶解，定容，摇匀即得。
[0013] 进一步的，取5-HMF对照品5. 00-8. OOmg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并 定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得，4°C储藏 备用。
[0014] 更进一步的，精密称取5-HMF对照品6. 00mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至 10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得，4°C储藏备用。
[0015] 上述的步骤（C)中的色谱条件可以采用下述的色谱条件：
[0016] 色谱柱：选自c18或c8柱；
[0017] 流动相：选自体积比为5-15 : 95-85的甲醇-0.5%醋酸水溶液或体积比为 10-15:90-85乙腈-水溶液，等度洗脱；
[0018]流速：0?8-1. 2mL ? mirf1 ;
[0019]检测波长：280-284nm ;
[0020] 柱温：25-35 °C ;
[0021] 进样量：10-20uL;
[0022] 更进一步的，上述的步骤（C)中的色谱条件为
[0023]色谱柱：C18;
[0024] 流动相：选自体积比为15 : 85的甲醇-0. 5%醋酸水溶液
[0025]流速：lmL ? mirf1 ;
[0026]检测波长：284nm ;
[0027]柱温：30°C;
[0028]进样量：10iiL;
[0029] 本发明采用的方法和实验条件是经过筛选获得的，能够达到精确测定的目的，以 下为本发明的筛选过程：
[0030] 检测波长的筛选
[0031] 5-HMF紫外吸收波长有280nm，282nm，284nm等多个，经过200~400nm全波长扫 描，说明本实验5-HMF在284nm下有最大吸收，优选284nm作为测定波长。本试验采用PDA 检测器对样品和对照品进行了峰纯度验证，结果表明在本试验所确定的检测条件下，5-HMF 峰不含其他干扰成分。
[0032] 提取方法的筛选
[0033] 5-HMF的生成与温度密切相关，温度较高可能导致或加速美拉德反应的发生，所以 没有考虑热提取的方法以避免加热过程产生影响。本试验考察了冰浴超声提取法与冰浴振 摇提取取法，结果表明两种方法相差不大。因超声提取法操作简单，优选超声提取法。具体 筛选如下：
[0034] 取五味子干燥果实，粉碎，过60目筛，精密称取1. 0000g于锥形瓶中，加入10ml甲 醇，分别采用冰浴超声提取和振摇提取两次，每次提取15min，平行2次，提取时用锡箔纸包 住锥形瓶。取提取液过滤，定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45um滤膜，进高效液相测定。 记录峰面积，峰面积_的为最佳提取方式，见表1.
[0035]表1不同提取方式的5-HMF峰面积
[0037] 由以上数据可以看出冰浴超声提取5-羟甲基糠醛效果相差不大，由于超声提取 方便，所以选择冰浴超声提取五味子干燥果实中的5-羟甲基糠醛。
[0038] 提取溶剂用量筛选
[0039] 取五味子干燥果实，粉碎，过60目筛。精密称取五味子粉末1. OOOOg于锥形瓶中， 分别加入药材量5、10、15、20、25倍体积的甲醇溶液，所述的倍数是指水的体积和五味子的 质量倍数（v/V)，通常是L/kg、mL/g，以此类推；冰浴超声提取15min，提取一次，平行2次， 提取时用锡箔纸包住锥形瓶。取提取液过滤，定容至25ml容量瓶中，过0. 45um滤膜，进高 效液相测定。记录峰面积，峰面积最高的为最佳溶剂用量，见表2和图3
[0040] 表2不同溶剂用量的5-HMF峰面积
[0042] 由以上数据可以看出随着料液比的增加，5-HMF的含量先增加后减小，当料液比为 1 :10时糠醛含量最高，料液比为1:15和1 :20比1:10略微降低相差不多，当料液比增加为 1:25时峰面积下降。
[0043] 提取时间的筛选
[0044] 取五味子干燥果实，粉碎，过60目筛。精密称取五味子粉末1. OOOOg于锥形瓶中， 加入10ml甲醇溶液，分别冰浴超声提取5min，15min，25min，35min，提取一次，平行2次，提 取时用锡箔纸包住锥形瓶。取提取液过滤，定容至25ml容量瓶中，过0. 45um滤膜，进高效 液相测定。记录峰面积，峰面积最_的为最佳提取时间，见表3和图4
[0045] 表3不同提取时间的5-HMF峰面积
[0046]
[0047] 由以上数据可以看出随着提取时间的增加，糠醛的含量增加，最后趋于平稳。提取 时间为15min, 25min, 35min时5-HMF含量相差不多。
[0048] 提取次数的筛选
[0049] 五味子粉碎，过60目筛。精密称取五味子粉末1. OOOOg于锥形瓶中，加入10ml甲 醇溶液，冰浴超声提取15min，提取时用锡箔纸包住锥形瓶。每提取一次都取提取液过滤，定 容至25ml容量瓶中，过0