底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0051] 洗涤液为含有KH2P04 0? 2mg/ml、Na2HP04 ? 12H20 2. 90mg/ml、NaC18.Omg/ml、KC1 0? 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的pH为 7. 4 的 0? 15MPBS溶液；
[0052] 封闭液为1% -5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[0053] 稀释缓冲液为含 1. 5mg/mLNa2C03、2. 93mg/mlNaHC03的PH为 9. 6 的 0? 05M碳酸 盐缓冲液；
[0054] 酶标抗体为HRP酶标抗体；
[0055] 终止液为：将21. 7ml的2MH2S04定容至200ml的ddH20中；
[0056] 洗脱液为含木瓜蛋白酶的PH为8. 0的0.lmol/LTris-HCL缓冲液；
[0057] 酸化剂为硝酸；
[0058] 上样缓冲液为含有 1MTris-HCl(pH6. 8) 15. 5mL、1 %溴酚蓝 2. 5mL、ddH207mL、甘 氨酸 25mL的Samplebuffer(5X);
[0059] 电泳缓冲液为含Tris3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH为6. 8的ddH20溶液；
[0060] 本发明提供一种铬-白蛋白螯合物，铬离子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残 基螯合而成。
[0061] 本发明还提供一种铬-白蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0062] A)铬与白蛋白的螯合反应：在人源的白蛋白中加入铬离子进行螯合反应，得到反 应溶液；
[0063] B)纯化铬-白蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应 的白蛋白以及多余的铬离子，即得铬-白蛋白螯合物，具体步骤如下：
[0064] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铬-白蛋白螯合 物复溶；
[0065] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与白蛋 白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；所述能与白蛋白特异性结 合的填料为含抗白蛋白抗体的硅胶或树脂；
[0066] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤⑴中样品，然后上柱，白蛋白 与填料特异性结合；
[0067] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0068] (5)收集：收集洗脱液I;
[0069] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0070] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；所述能与铬特异性结合的填 料为含抗铬抗体的硅胶或树脂；
[0071] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0072] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[0073] (10)收集：收集洗脱液II;
[0074] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用2升ddH20透析除盐，换 水三次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铬-白蛋白螯合物；
[0075] C)对铬-白蛋白螯合物的鉴定，具体步骤如下：
[0076] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0077] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬_白蛋白螯合物，加入稀释缓冲液，并混 匀，然后加样于样品槽中；
[0078] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0079] (4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有铬以及检测铬的含量。
[0080] 本发明还提供一种至少包括如上述的铬-白蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。
[0081] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获白蛋白的物质或捕获铬的 物质。
[0082] 在本发明中，能实现本发明目的的试剂盒可以列出以下几种，但并不限于此。
[0083] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括含有捕获白蛋白的物质的包被 液、封闭液、洗涤液、作为二抗的可捕获铬的物质、酶标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、阳 性对照、阴性对照等。
[0084] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括含有捕获白蛋白的物质的包被 液、封闭液、洗涤液、洗脱液、阳性对照、阴性对照等。
[0085] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括含有捕获白蛋白的物质的包被 液、封闭液、洗涤液、洗脱液、酸化剂、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
[0086] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中白蛋白所需提 取试剂、复溶液、含有捕获铬的物质的包被液、封闭液、洗涤液、酶标抗体、底物、终止液、稀 释缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
[0087] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中白蛋白所需提 取试剂、复溶液、阳性对照、阴性对照等。
[0088] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中白蛋白所需提 取试剂、复溶液、酸化剂、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
[0089] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中白蛋白的提取 试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液体、含有捕获铬的 物质的包被液、封闭液、洗涤液、酶标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、阳性对照、阴性对照 等。
[0090] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中白蛋白所需提 取试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液体、阳性对照、 阴性对照等。
[0091] -种检测血样中铬-白蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中白蛋白所需提 取试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液体、酸化剂、过 氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
[0092] 上述几种试剂盒中，所述阳性对照为标准品，即螯合有重金属铬的白蛋白螯合物 或螯合有重金属铬的BSA螯合物；所述阴性对照为不含有标准品的稀释缓冲液。
[0093] 上述试剂盒用于检测螯合铬的白蛋白，以提高检测的准确性，重复性，并使之在临 床中得到推广。
[0094] 本发明还提供一种定量检测铬-白蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述的 铬-白蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫 与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铬-白蛋白螯合 物与酶联免疫结合法、提纯铬-白蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铬-白蛋白螯合 物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体 质谱结合法。在本发明中，用检测铬-白蛋白螯合物的方法可以列出的有以下几种，但并不 限于以下几种。
[0095] 其中，上述定量检测铬-白蛋白螯合物的方法中采用的试剂如下：
[0096] 方法一：酶联免疫法(ELISA法）检测铬-白蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0097] 1)将能够捕获白蛋白的物质，如抗白蛋白抗体（抗HSAAb)包被于固相载体上：用 稀释缓冲液将抗HSAAb至稀释1000-8000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜16-18小时， 或37°C水浴1-3小时，储存冰箱；
[0098] 2)从循环系统取全血，作待检样品，lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
[0099] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以1% -5% 牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗 涤，洗涤完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小时；
[0100] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的铬-白蛋白 螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔中，37°C作用1-2小 时；
[0101] 5)加入可以捕获铬的物质，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗 涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释至5000-40000倍的抗CrAb，37°C作用1-2小时，使抗Cr Ab与白蛋白上的金属铬反应形成抗原抗体复合物；
[0102] 6)酶结合物温育：移去抗铬抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀 释缓冲液稀释的酶标抗体，使稀释的酶标抗体的浓度为2yg/mL，37°C作用1-2小时，使其 与酶标抗体反应；
[0103] 7)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物， 37°C避光作用30分钟；
[0104] 8)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
[0105] 9)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取待检样 品和标准品的0D值，通过绘制标准曲线，求得待检样品的含量（也可不使用酶标仪，直接通 过显色情况进行定性检测）。
[0106] 该方法利用ELISA原理，可以将全血中的特异性白蛋白提取出来，提取出来的白 蛋白上部分螯合有重金属铬，而这部分白蛋白上的铬被抗铬抗体所捕获，之后可以再被辣 根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获（该抗体不识别包被蛋白），捕获上的抗 体在显色剂及终止液的作用下，可以在仪器下读出0D值，而不含有螯合金属铬的白蛋白， 则不会被抗铬的特异性抗体所捕获，也不会与辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗 体所捕获，而所用试剂中也不含有金属铬（阴性对照组结果为阴性），因而当所读取的0D值 结果显示为阳性时，即可证明检测出白蛋白上螯合的金属铬。
[0107] 方法二：酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法）检测铬-白蛋白螯 合物按照如下步骤检测：
[0108] 1)将能够捕获白蛋白的物质，如抗白蛋白抗体（抗