一种铬-白蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种铬-白蛋白螯合物及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 血清白蛋白（HSA)是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众 多的内源性和外源性物质，这与它特异性结构密切相关。血清白蛋白是由肝脏合成的一种 简单蛋白质，仅由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。根据数据资料显示，牛血清白 蛋白（BSA)分子由583个氨基酸残基组成。而人血清白蛋白（HSA)比BSA多2个氨基酸， 即585个氨基酸残基组成。两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的残 基。白蛋白氨基酸成分最显著的特征是低含量的色氨酸，HSA和BSA每分子中分别含有1或 2个残基。苯丙氨酸和异亮氨酸含量也比较低。半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量都 非常高。大量的离子化残基提供了白蛋白非常高的电荷，在PH7的条件下，每分子白蛋白带 有185个离子，这样就形成白蛋白易溶性。
[0003] 白蛋白最独特的结构特点是二硫键模式。BSA序列包含35个半胱氨酸残基，形成 17个二硫桥，相邻的半胱氨酸对与链上最近的残基连结，形成10-47个残基长度的一对环。 S-S键交迭增加了白蛋白结构的刚性和稳定性。
[0004] 白蛋白的三级结构被认为是一种高度螺旋的分子，通过X射线衍射得知HCR晶体 中大约67%的残基参与形成了 28个a-螺旋体，10%残基参与形成0转角，23%残基形 成伸展链。
[0005] 生理机制上，白蛋白维持人体血浆胶体渗透压的80 %。另外，白蛋白也是血液中各 种大分子物质的主要载体，在代谢物转运、生物转化中发挥着重要作用。它同时也是调节凝 血功能和炎性反应的组分。人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究。
[0006] 络（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一种过渡金属，其质地坚硬，表面具有 光泽，有较高的熔点，在工业生产中具有重大的经济价值，一个世纪以来被广泛应用，每年 全球铬生产量高达107吨，因而铬是一种名副其实的重要金属污染物。目前，铬广泛应用于 电镀、鞣革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关，但是同样也对人 类的身体健康产生巨大影响。在美国，Cr与Cr、Cd、Pb被称为四大环境污染物。据统计，每 年有几十个亿的民众都在饮用铬污染的水源，而在加利福利亚有高达30%的水资源都已经 被铬污染，因而铬污染严重影响着人们的身体健康。
[0007]自然界中铬主要以三价和六价的形式存在，而一般认为，三价铬（Cr3+)是人类所 需的微量元素，而六价铬（Cr6+)才是明显的毒性物质。由于六价铬易通过细胞膜进入细胞， 而且可以通过一系列反应，产生强烈的细胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铬的毒性 高于三价铬，达10-100倍。学者认为当水中的六价铬含量超过〇.〇5mg/L即是有毒的。六 价铬可以通过皮肤接触、食物摄入、饮用水饮入、呼吸道吸入等途径进入人体，对于职业性 暴露人群主要是通过呼吸道吸入六价铬灰尘，而对于普通人群则是通过饮入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式摄入六价铬。六价铬进入体内后，可以引发氧化应激、染色体 畸变、细胞凋亡、多种DNA损伤（包括单链断裂、DNA-蛋白质交联、DNA-氨基酸交联、Cr-DNA 配合物形成等），从而造成机体多处组织、器官、系统损伤。不仅如此，六价铬还被认为是一 种强有力的致癌物，早在1990年国际癌症研究组织。
[0008] 铬与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对铬毒性研究的深入，人们逐渐认识到铬与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解铬的毒性机理的关键所在，因此，对铬和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于铬与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铬之 间的关系还不清楚，因而加强对于铬与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0009] 针对铬污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铬-白蛋白螯合物及其制备 方法，并建立铬-白蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铬-白蛋白螯合物在 评价一个地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铬-白蛋白螯合物可 以间接反映这个地区人群受铬污染的情况，从而间接反映这个地区铬污染程度。
[0010] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铬-白蛋白螯合物，铬离 子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
[0011] 本发明还提供一种上述的铬-白蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0012] A)铬与白蛋白的螯合反应：在提纯源于人体的白蛋白或按照生物学方法重组的 白蛋白中加入铬离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0013] B)纯化铬_白蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应 的白蛋白以及多余的铬离子，即得铬-白蛋白螯合物。
[0014] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0015] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铬-白蛋白螯合 物复溶；
[0016] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与白蛋 白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0017] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，白蛋白 与填料特异性结合；
[0018] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0019] (5)收集：收集洗脱液I;
[0020] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0021] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0022] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0023] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[0024] (10)收集：收集洗脱液II;
[0025] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三 次后，4 °C透析过夜，收集样本，即得铬-白蛋白螯合物。
[0026] 其中，上述铬-白蛋白螯合物的制备方法，还包括步骤C):对铬-白蛋白螯合物的 鉴定；
[0027] 其中，步骤C)中具体如下：
[0028] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0029] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-白蛋白螯合物，加入稀释缓冲液，并混 匀，然后加样于样品槽中；
[0030] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0031] (4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有铬以及检测铬的含量。
[0032] 本发明还提供一种如上述的铬-白蛋白螯合物在制备检测人体内铬-白蛋白螯合 物的试剂或试剂盒中的应用。
[0033] 本发明还提供一种至少包括如上述的铬-白蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。
[0034] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获白蛋白的物质或捕获铬的 物质。
[0035] 本发明还提供一种定量检测铬-白蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述的 铬-白蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫 与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铬-白蛋白螯合 物与酶联免疫结合法、提纯铬-白蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铬-白蛋白螯合 物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体 质谱结合法。
[0036] 实施本发明的铬-白蛋白螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
[0037] 1.本发明首次体外合成铬-白蛋白螯合物；
[0038] 2.本发明首次提出铬-白蛋白螯合物可用于制备检测血样中铬-白蛋白螯合物的 试剂或试剂盒中的应用。
[0039] 3.本发明建立了铬-白蛋白螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测铬-白蛋 白螯合物在评价一个地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铬-白 蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受铬污染的情况，从而间接反映这个地区铬污染程 度。本发明建立的铬-白蛋白螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复 性得到大大提高。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明所述的铬-白蛋白螯合物的非变性电泳条带图；
[0041] 图2为本发明所述的铬-白蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图。
【具体实施方式】
[0042] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0043] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可以通过市购方式 获得：
[0044] 磷酸盐溶液为 0? 05-0.lmol/LNa2HP04溶液或 0? 5-lmol/LNa2HP04溶液；
[0045] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0046] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
[0047] 捕获白蛋白的物质购买自Novus公司型号为A-0577的人白蛋白抗体；其中，本发 明所述与白蛋白特异性结合的物质、抗HSA抗体、抗白蛋白抗体均为捕获白蛋白的物质；
[0048] 捕获铬的物质购买自广州然科生物科技有限公司的型号为RK10641的抗铬抗体； 其中，本发明所述与铬特异性结合的物质、抗Cr抗体、抗铬抗体、铬抗均为捕获铬的物质；
[0049] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0050]