行反馈修正从而即使承认荧光受光器40固有的每个受光位置的依赖于场所的灵敏度 偏差，也能够减少由该灵敏度偏差造成的影响并且能够使相位调制光L2以及荧光L3的强 度均匀的情况。
[0132] 以下，对由本实施方式得到的效果，表示实施例来进行说明。即，在该实施例中作 为试样使用rAcGFPl溶液，由荧光受光装置1进行多点照射。图8表示其结果。图8 (a)表 示进行反馈修正之前的荧光图像。在图8(a)中右上部的荧光强度与中心部相比较变低，另 外，虽然由目视难以确认，但是依赖于场所的强度偏差也存在于中央附近。还有，在图8中， 以亮度表示荧光的强度。图8(b)表示进行本实施方式所涉及的反馈修正的荧光图像。与 图8(a)不同，可知减少了依赖于场所的强度偏差。还有，图8表示在考虑了受光器固有灵 敏度信息之后在各个受光位置上进行检测的荧光的强度。
[0133]图9是表示由本实施方式进行的反馈修正的实施次数（横轴）与荧光强度的偏差 (纵轴）之间的关系的图。作为偏差的评价函数，如上所述使用Peak-to-valley(PV)法或 RMS(RootMeanSquareerror)法。还有，PV法和RMS法中的算出偏差能够分别由下述式 (9)、（10)进行表示。
[0134] [数 10]
[0138] 其中，q(m)为第m编号的焚光的观察区域中的焚光的总和，qmax、qmin、qdesired 分别为最大、最小、所期望的荧光强度。如图9所示，在修正前（反馈修正的实施次数=0) PV= 26%、RMS= 10%，但是，在6次的反馈修正之后能够确认大幅改善到PV= 3%、RMS =1 %〇
[0139] 另外，在本实施方式中，放置试样90来检测荧光L3。在此，放置试样90来检测荧 光L3的优点如以下所述。即，第一个优点在于，将rACGFP溶液或香豆素乙醇（coumarin ethanol)等的荧光强度被均匀地获得的介质作为试样90来使用，如果进行一次修正的话 则之后即使在将细胞等作为试样来使用的情况下也能够获得均匀的数据。作为第二个优 点，可以列举因为通过使用试样从而能够使用实际进行测量的光学系统，所以光学系统整 体的修正是可能的。作为第三个优点，可以列举通过准备具有接近于进行观察的条件的折 射率的均质介质从而在应用了球面像差修正或透镜图案的状态下进行均匀化是可能的。还 有，试样90和观察介质的折射率如果极端不同的话则因为聚光像糊涂呆板并且SN下降，所 以恐怕均匀化的精度会降低。因此，也可以将试样90的折射率以一定程度对合到观察介质 的折射率。再有，0C法为最适合化法，为了防止陷入局部解，对于初始相位而言多使用随机 相位。其结果，在每个第1全息图上，被生成的多点的偏差的分布不同。或者，即使使用相 同的初始相位，如果目标图案中的多点的位置或强度发生变化的话则由第1全息图生成的 多点的偏差的分布也不同。第四个优点在于，通过将荧光强度被均匀地获得的介质作为试 样90来使用，从而能够明确地把握起因于全息图的偏差。
[0140] 另外，根据本实施方式，因为在多个聚光位置中的每个聚光位置上进行由修正部 22进行的修正，所以能够将该部正分别应用于由空间光调制器20以及全息图生成的多点。
[0141] 本发明对于在将能够进行多光子激发的短脉冲激光用于激发光源10的情况下发 生的多个聚光位置的强度偏差来说特别有用。作为这样的激发光源10,优选具有纳秒以下 的脉冲宽度并且能够射出波长为650nm以上的短脉冲激光的光源。
[0142]另外，本实施方式对于多阳极型的光电倍增管那样的存在依赖于场所的灵敏度偏 差的荧光受光器40来说特别有用。
[0143] 另外，根据本实施方式，在例如均匀地对向试样90的相位调制光L2以及来自试样 90的荧光L3的双方进行强度控制的时候，通过将没有依赖于场所的偏差的均质的荧光材 料作为试样90来使用从而能够减少计算量，并且能够简易而且适当地进行该控制。
[0144] 另外，根据本实施方式，由修正部22进行的修正因为在沿着包含于聚光光学系统 30的物镜33的光轴方向的规定的间隔的每个扫描层上进行，所以相对于具有一定程度的 深度的试样90也能够应用本实施方式。
[0145] 另外，根据本实施方式，因为通过空间光调制器20控制物镜33的光轴方向上的聚 光位置从而进行每个扫描层的扫描，所以能够适当地进行每个扫描层的扫描。
[0146] 还有，作为试样，也可以使用具有接近于实际的测定试样的折射率的折射率并且 荧光物质等的溶质的浓度均匀的校正试样。如果使用这样的校正试样的话，则能够保持荧 光强度的均匀性。
[0147] 产业上的可利用性
[0148] 本发明能够提供一种能够控制聚光位置上的多点的荧光强度的荧光受光装置以 及荧光受光方法。
【主权项】
1. 一种荧光受光装置，其特征在于： 是对通过相位调制后的激发光被聚光从而从试样发生的荧光进行受光的荧光受光装 置， 具备： 激发光源，输出所述激发光； 相位调制型的空间光调制器，输入所述激发光并输出通过对所述激发光进行相位调制 从而获得的相位调制光； 聚光光学系统，被设置于所述空间光调制器的后段并将所述相位调制光聚光于所述试 样； 试样平台，载置所述试样； 荧光受光器，经由所述聚光光学系统而对通过将所述相位调制光聚光于所述试样从而 发生的荧光进行受光； 控制部，通过将第1全息图显示于所述空间光调制器从而在二维排列的多个像素中分 别调制所述激发光的相位并且由所述聚光光学系统使所述相位调制光聚光于所述试样的 多个聚光位置；以及 修正部，修正所述第1全息图， 所述修正部具备： 第1全息图输入部，输入所述第1全息图； 受光器固有灵敏度信息容纳部，预先取得并容纳所述荧光受光器固有的每个受光位置 的灵敏度信息；以及 第2全息图生成部，通过根据所述聚光位置上的所述荧光的强度以及容纳于所述受光 器固有灵敏度信息容纳部的所述灵敏度信息来修正所述第1全息图，从而生成第2全息图， 所述控制部将所述第2全息图显示于所述空间光调制器。2. 如权利要求1所述的荧光受光装置，其特征在于： 由所述修正部进行的所述修正在所述多个聚光位置的每个聚光位置上进行。3. 如权利要求1或者2所述的荧光受光装置，其特征在于： 所述激发光源是能够进行多光子激发的短脉冲激光。4. 如权利要求1~3中的任意一项所述的荧光受光装置，其特征在于： 所述荧光受光器是多阳极型的光电倍增管。5. 如权利要求1~4中的任意一项所述的荧光受光装置，其特征在于： 所述试样由聚光于所述试样的所述相位调制光与从所述试样发生的所述荧光的强度 的比率没有依赖于场所的偏差的均质的荧光材料构成。6. 如权利要求1~5中的任意一项所述的荧光受光装置，其特征在于： 由所述修正部进行的所述修正在沿着包含于所述聚光光学系统的物镜的光轴方向的 规定的间隔的每个扫描层上进行。7. 如权利要求6所述的荧光受光装置，其特征在于： 每个所述扫描层的扫描通过由所述空间光调制器控制所述物镜的所述光轴方向上的 聚光位置而进行。8. -种焚光受光方法，其特征在于： 是对通过相位调制后的激发光被聚光从而从载置于试样平台的试样发生的荧光进行 受光的荧光受光装置中的荧光受光方法， 具备： 激发光源输出所述激发光的步骤； 相位调制型的空间光调制器输入所述激发光并输出通过对所述激发光进行相位调制 而获得的相位调制光的步骤； 被设置于所述空间光调制器的后段的聚光光学系统将所述相位调制光聚光于所述试 样的步骤； 荧光受光器经由所述聚光光学系统而对通过将所述相位调制光聚光于所述试样从而 发生的荧光进行受光的步骤； 控制部通过将第1全息图显示于所述空间光调制器从而在二维排列的多个像素中分 别调制所述激发光的相位并且由所述聚光光学系统使所述相位调制光聚光于所述试样的 多个聚光位置的步骤；以及 修正部修正所述第1全息图的步骤， 所述修正部修正所述第1全息图的步骤具备： 第1全息图输入部输入所述第1全息图的步骤； 受光器固有灵敏度信息容纳部预先取得并容纳所述荧光受光器固有的每个受光位置 的灵敏度信息的步骤；以及 第2全息图生成部通过根据所述聚光位置上的所述荧光的强度以及容纳于所述受光 器固有灵敏度信息容纳部的所述灵敏度信息来修正所述第1全息图从而生成第2全息图的 步骤， 还具备所述控制部将所述第2全息图显示于所述空间光调制器的步骤。
【专利摘要】荧光受光装置(1)具备激发光源(10)、对激发光(L1)进行相位调制并获得相位调制光(L2)的相位调制型的空间光调制器(20)、被设置于空间光调制器(20)的后段并将相位调制光(L2)聚光于试样(90)的聚光光学系统(30)、载置试样(90)的试样平台(92)、对通过相位调制光(L2)被聚光于试样(90)从而发生的荧光(L3)进行受光的荧光受光器(40)、将第1CGH显示于空间光调制器(20)的控制部(21)、修正第1CGH的修正部(22)。修正部(22)具备预先取得并容纳荧光受光器(40)固有的每个受光位置的灵敏度信息的受光器固有灵敏度信息容纳部(222)、根据荧光(L3)的强度以及灵敏度信息修正第1CGH并且生成第2CGH的第2全息图生成部(223)。控制部(21)将第2CGH显示于空间光调制器(20)。
【IPC分类】G02B21/06, G03H1/08, G01N21/64
【公开号】CN105026916
【申请号】CN201480012124
【发明人】松本直也
【申请人】浜松光子学株式会社
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年3月4日
【公告号】DE112014001147T5, WO2014136784A1