的过饱和盐的塑料袋的内部的湿度为大约90%。 然后，返回实验室（湿度25% )，停留1小时后，用角质层剥离带从两臂的处理部位剥离角 质层片，固定于载玻片。将固定了的角质层片用〇. 2w/v%荧光素钠溶液（和光纯药工业 (株））浸渍5分钟，水洗后，用荧光显微镜（才yWUBX51)观察荧光亮度，引入图像（图 4A)。对于引入的图像，使用解析软件，实施倾斜校正，实施二值化，计算出荧光亮度。将各 12视场的数据平均化得到的图示于图4B中。在低湿度（10%)干燥了的皮肤角质层与在 高湿度（90% )干燥了的皮肤角质层相比荧光亮度有意义地高。（P〈0. 01)
[0074] 实施例5 :在将通讨带剥离取得的角质层片用水浔润后，在湿度90%干燥了的情 况下，和伸用硅胶讲行了干燥的情况下的染色
[0075] 从前臂屈肌部使用角质层剥离带采集两块角质层片，固定于载玻片。将它们浸渍 于水中1小时，然后一块在加有硝酸钾的过饱和盐的密闭容器中干燥2小时。该情况下的 湿度成为约90%。另一块在加有干燥了的硅胶的密闭容器中干燥2小时。该情况下的湿度 成为0%。将这些角质层片用0.2w/v%荧光素钠溶液（和光纯药工业（株））浸渍5分钟， 水洗后，用荧光显微镜（才卩 >，只8乂51)观察荧光亮度，引入图像。对于引入的图像，使 用解析软件，实施倾斜校正，实施二值化，计算出荧光亮度。将各12视场的数据平均化得到 的图示于图5A)中。使水浸渍于通过带剥离取得的角质层片，使用硅胶来进行快速干燥，从 而能够制成肌肤粗糙角质层片模型，在该情况下可以计测荧光的亮度的变化。用硅胶干燥 了的角质层与在高湿度干燥了的角质层相比荧光亮度有意义地高（P〈〇. 001)。
[0076] 对于其它染料，分别使用0. 2w/v%玫瑰红溶液（和光纯药工业）、0. 2w/v%藏红花 水溶液（和光纯药工业）、〇.2w/v%刚果红水溶液（和光纯药工业）进行同样的实验。将由 上述方法制成的角质层片浸渍于各个染料水溶液中5分钟，水洗后，用光学显微镜（才yy BX40)进行观察，引入其图像。将引入的图像用图像解析软件二值化，计算出色强度。 将各12视场的数据平均值化得到的图示于图5B)、C)、D)中。确认了玫瑰红染色时，用硅 胶干燥了的角质层与在高湿度干燥了的角质层相比染色强度高的倾向。（P< 0. 1)另一方 面，藏红染色、刚果红染色时不能评价由干燥带来的差异。
[0077]实施例6 :关于角质层改善效果的候诜化妆品的筛诜
[0078] 将从前臂屈肌部使用角质层剥离带取得的角质层片固定于载玻片，将固定了的各 角质层片浸渍于作为对照的水（两块）、作为候选化妆品的3%赤藓醇水溶液（ER)和3% 7夕707°-;P1407水溶液（AQ)中1小时。然后，将浸渍于水的一块角质层片在湿度 0 %、室温进行干燥，将另一块在湿度90 %、室温干燥2小时。将浸渍于ER和AQ的角质层片 在湿度〇%、室温干燥2小时。将这些角质层片用0. 2w/v%荧光素钠溶液（和光纯药工业 (株））浸渍5分钟，水洗后，用荧光显微镜（才yBX51)观察荧光亮度，引入图像。 对于引入的图像，使用解析软件，实施倾斜校正，实施二值化，计算出荧光亮度。将各12视 场的数据平均化得到的图示于图6中。对于浸渍于ER的角质层片，荧光亮度与用水浸渍了 的角质层片（在湿度〇%干燥）为同等程度，另一方面，对于浸渍于AQ的角质层片，与用水 浸渍了的角质层片（在湿度〇%干燥）相比荧光亮度有意义降低，其荧光亮度为接近于用 水浸渍，在湿度90%慢慢干燥了的角质层片的值。通过该实验，可知3% 7夕>7°-少 1407水溶液具有角质层改善效果，显示能够通过本实验体系来筛选候选化妆品。
[0079]实施例7 7Y>7°- ;1/1407水溶液的浓度依存件的角质层改善效果
[0080] 将从前臂屈肌部使用角质层剥离带取得的角质层片固定于载玻片，将固定了的各 角质层片浸渍于作为对照的水，以及作为候选化妆品的使7夕7 07°-;P1407 (A?的 浓度分别为〇%、〇. 1%、1%、3%和10%的浓度的水溶液中1小时。然后，浸渍于水的角质 层片在湿度90%、室温干燥2小时。将浸渍于AQ的角质层片在加有硅胶的密闭容器内（湿 度0% )干燥2小时。将这些角质层片用0. 2w/v%荧光素钠溶液（和光纯药工业（株）） 浸渍5分钟，水洗后，用荧光显微镜（才卩 BX51)观察荧光亮度，引入图像。对于引 入的图像，使用解析软件，实施倾斜校正，实施二值化，计算出荧光亮度。将各12视场的数 据平均化，将浸渍于水，在湿度10%干燥了的角质层片的荧光亮度设为100而示于图7中。 7夕7彳'乂7°- ; 1^ 1407可以浓度依存地使荧光亮度降低，对于3%和10%，显示相对于0% (即用水浸润，在湿度〇%干燥）有意义地降低了。由于浓度依存地使荧光亮度降低，因此 7夕7 4 >7°-;P1407确实具有角质层改善效果，显示作为具有角质层改善效果的化妆 品是有用的。
【主权项】
1. 一种角质层状态的评价方法，其包括下述工序： 使选自荧光素、玫瑰红和它们的盐中的染料的水溶液与角质层片接触的工序， 洗涤所述染料的工序， 测定角质层片中的所述染料的染色强度的工序。2. 根据权利要求1所述的评价方法，所述角质层状态的评价是对角质层透明度、角质 层细胞间脂质的结构和角质层的水分含量进行综合性评价。3. 根据权利要求1或2所述的评价方法，所述评价基于与标本的染色强度的比较、或与 比色表的比较来进行。4. 根据权利要求1~3的任一项所述的方法，所述角质层片为通过带剥离调制的角质 层片。5. -种关于角质层改善效果的美容处置的评价方法，其包括下述工序： 使选自荧光素、玫瑰红和它们的盐中的染料与对皮肤进行美容处置后通过带剥离而取 得的角质层片接触的工序， 洗涤所述染料的工序， 测定所述角质层片中的所述染料的染色强度的工序。6. 根据权利要求5所述的评价方法，所述评价基于：用染料对美容处置前的通过带剥 离取得的角质层片进行染色，将美容处置前后的角质层片的染色强度进行比较。7. 根据权利要求5或6所述的方法，所述美容处置为化妆品的涂抹。8. -种关于角质层改善效果的候选化妆品的评价方法，其包括下述工序： 对角质层片应用候选化妆品的工序， 使角质层片干燥的工序， 使选自荧光素、玫瑰红和它们的盐中的染料的水溶液与角质层片接触的工序， 洗涤所述染料的工序，以及 测定角质层片中的所述染料的染色强度的工序。9. 根据权利要求8所述的方法，所述角质层片为培养角质层片。
【专利摘要】本发明的课题涉及提供更简便地评价角质层状态的方法。通过使水溶性染料的溶液与角质层片接触，计测染色强度或荧光强度，从而能够简便地进行角质层状态的评价。进一步提供通过应用本发明的使用了水溶性染料的角质层状态的评价方法，从而对化妆品或美容处置的角质层改善效果进行评价的方法。
【IPC分类】G01N33/50, A61K8/02, A61Q19/00, G01N33/52
【公开号】CN105026929
【申请号】CN201480005269
【发明人】八木荣一郎, 岩井一郎
【申请人】株式会社资生堂
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年1月21日
【公告号】EP2947457A1, US20150362412, WO2014112643A1