六瓣红大蒜蒜酶灭活提取物hplc指纹图谱的建立方法
【专利说明】
[0001] 本发明得到"天津市农委重点项目（201302030)和天津师范大学应用开发研究基 金"资助。
技术领域
[0002] 本发明属于天然植物分析技术领域，涉及天然植物指纹图谱的构建方法，尤其是 宝坻"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物高效液相色谱（HPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指 纹图谱。
【背景技术】
[0003] 大蒜)百合科葱属，二年生草本植物，食药兼用，在世界范围 内被广泛种植。目前，我国是最大的大蒜生产国，国内种植大蒜69. 2万公顷，占世界种植面 积的1/2左右，我国大蒜的总产量占世界总产量3/4以上，产量1208. 8万吨。大蒜作为人 们生活中必不可少的蔬菜和调味品，营养丰富，含有多种对人体有益的化学成分，包括其中 含硫挥发物43种，硫化亚磺酸(如大蒜素)酯类13种、氨基酸9种、肽类8种、糖苷类12种、 酶类11种等。大蒜鳞茎、幼苗及花茎均可食用。大蒜还具有较强的药用价值，具有杀菌、消 炎、抗病毒、抗癌、降血脂等功效。
[0004] 宝坻特有品种"六瓣红"大蒜，蒜头致密紧实，一般每头6瓣左右，单柱型围座，无 加楔，无重瓣，蒜瓣洁白脆嫩，辛辣汁多味浓，易贮藏，耐运输，抗病性较强，辣味柔和适口， 生、熟食用倶佳。"六瓣红"大蒜以其优良的农艺性状、丰富的营养成分以及良好的口感，一 直保持着名优特产的地位，深受国内外消费者喜爱，目前已远销日本、韩国及东南亚等多个 国家和地区。但由于品质管理技术落后，导致品种出现退化的迹象，已成为制约这一名优品 种进一步科学化、规模化发展的瓶颈。
[0005] 指纹图谱技术已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段之一。它 可以较全面、准确、直观的反映多种成分在中药或其制剂中的分布，是一种综合的、宏观的 和可量化的鉴别方法。运用指纹图谱技术，通过对指纹图谱中主要特征峰的识别或比例的 测定，可以鉴别中药材和中成药的真伪，有效评价产品质量的均一性和稳定性。
[0006] 蒜氨酸酶是大蒜中的一类内源酶，存在于细胞液泡内，蒜氨酸则以稳定的形态存 在于细胞质中。当大蒜鳞茎收到外力作用，细胞结构遭到破坏，蒜氨酸酶与蒜氨酸相接触， 发生酶解反应，生成一系列蒜氨酸代谢产物如二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚等。由此 可见，在提取过程中使蒜酶灭活，可充分反应大蒜中天然状态下的化合物成分。但是，迄今 为止，有关宝坻特有大蒜品种"六瓣红"的蒜酶灭活提取物指纹图谱还未见报道。
[0007] 鉴于以上不足，有必要发明一种建立宝坻"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物指纹图谱 的新方法，使之能够简便、稳定、可重复、全面、精确的评价"六瓣红"大蒜的质量，从而既加 强了对"六瓣红"大蒜真伪及产地的鉴别能力，又能提高"六瓣红"大蒜质量的全面评估和 控制，弥补了现有检测方法的不足，使之更加科学、完善。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是针对现有宝坻"六瓣红"大蒜品质管理检测方法的不 足，而提供一种"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法。该方法通过将 大蒜制备成蒜酶灭活提取物待测溶液，经固相萃取技术分离浓缩，再经由高效液相色谱仪 分析检测，获得指纹图谱，为"六瓣红"大蒜的真伪鉴别以及品质控制提供可靠依据和技术 方法。
[0009] 本发明宝坻"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在 于：该方法按如下的步骤进行： (1) 大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取宝坻"六瓣红"大蒜鳞茎20g，加 25-30ml蒸馏水，90°C灭酶lh，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000 X g离心15min，取上清液 经0.45 μ m微孔滤膜过滤； (2) 大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、IOml超纯 水活化，平衡15min ;待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再 由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至lml，经0. 45 μm 微孔滤膜过滤待测； (3) 高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18,5 ym，4.6x250mm;保护柱为： Eclipse Plus C18 Grd，5 μ m，4.6x12. 5mm;柱温 35°C;流动相为甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2 min - 10 min - 20 min，甲醇：60% - 60% - 80% - 80% ;二极管 阵列检测器检测波长240nm ;进样量50 μ L ;在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜蒜酶 灭活提取物HPLC指纹图谱； 本发明还提供上述大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱得到的"六瓣红"大蒜蒜酶灭活 提取物HPLC标准指纹图谱。
[0010] 将10批次"六瓣红"大蒜样品按上述方法制备成供试品溶液，由上述方法分离检 测，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到 "六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物标准指纹图谱。该方法确定了 15个共有特征峰，其保留时 间分别为：2.16 min、2.748 min、2.94 min、3.379 min、3.813 min、4.719 min、5.839 min、 6. 439 min、7. 074 min、8. 002 min、9. 131 min、10. 615 min、13. 069 min、15. 314 min、18. 325 min，相对标准偏差（RSD)〈1%，这些共有特征峰构成了宝坻"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物 HPLC标准指纹图谱。
[0011] 本发明公开的宝坻"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法与现 有技术相比所具有关键之处在于： (1) 样品前处理简便，易于操作，采用固相萃取技术对样品进行预分离浓缩，得到的供 试品溶液所含杂质少，不污染色谱柱，对色谱图信号干扰小； (2) 色谱条件简便易行，重现性好； (3) 本发明能够最大程度上提取大蒜鳞茎天然状态下的有机物成分，在此基础之上建 立的HPLC指纹图谱对"六瓣红"大蒜品质控制更具针对性和实用性。
[0012] (4)本发明色谱体系下各色谱峰分离较好，可以从整体上识别"六瓣红"大蒜化学 成分的特点。
[0013] (5)本发明分析效率高，稳定性好，特异性强，重现性好，特征峰较多，利用本发明 能对宝坻"六瓣红"大蒜进行真伪及产地鉴别，并能全面、准确地评价其内在品质质量。
[0014]
【附图说明】： 图1是"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱； 图2是"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专 业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本 发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。所用各种原料均有市售。
[0016] 实施例1 : 宝坻"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法，该方法步骤如下： (1) 样品、试剂盒仪器：宝坻"六瓣红"大蒜，使用安捷伦1200型高效液相色谱仪，试剂 均为色谱纯或分析纯； (2) 大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取宝坻"六瓣红"大蒜鳞茎20g，加 25-30ml蒸馏水，90°C灭酶lh，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000 X g离心15min，取上清液 经0.45 μ m微孔滤膜过滤； (3) 大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、IOml超纯 水活化，平衡15min ;待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再 由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至lml，经0. 45 μm 微孔滤膜过滤待测； (4) 高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18,5 ym，4.6x250mm;保护柱为： Eclipse Plus C18 Grd，5 μ m，4.6x12. 5mm;柱温 35°C;流动相为甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2 min - 10 min - 20 min，甲醇：60% - 60% - 80% - 80% ;二极管 阵列检测器检测波长240nm ;进样量50 μ L。
[0017] 分别精密吸取各供试品液溶液，在上述色谱条件下经高效液相色谱仪分离检测， 得到大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱，见图1。
[0018] 实施例2: 宝坻"六瓣红"大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱的建立方法，该方法步骤如下： (1) 样品、试剂盒仪器：宝坻"六瓣红"大蒜共10批次，使用安捷伦1200型高效液相色 谱仪，试剂均为色谱纯或分析纯； (2) 大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取宝坻"六瓣红"大蒜鳞茎20g，加 25-30ml蒸馏水，90°C灭酶lh，破碎研磨，加