诱导愈伤组织培养大蒜酶解产物hplc指纹图谱的建立方法
【专利说明】诱导愈伤组织培养大蒜酶解产物HPLC指纹图谱的建立方 法
[0001] 本发明得到"天津市农委重点项目（201302030)和天津师范大学应用开发研究基 金"资助。
技术领域
[0002] 本发明属于涉及诱导愈伤组织培养植物指纹图谱的构建方法，尤其是诱导愈伤组 织培养大蒜高效液相色谱（HPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。
【背景技术】
[0003] 大蒜)百合科葱属，二年生草本植物，食药兼用，在世界范围 内被广泛种植。目前，我国是最大的大蒜生产国，国内种植大蒜69. 2万公顷，占世界种植面 积的1/2左右，我国大蒜的总产量占世界总产量3/4以上，产量1208. 8万吨。大蒜作为人 们生活中必不可少的蔬菜和调味品，营养丰富，含有多种对人体有益的化学成分，包括其中 含硫挥发物43种，硫化亚磺酸(如大蒜素)酯类13种、氨基酸9种、肽类8种、糖苷类12种、 酶类11种等。大蒜鳞茎、幼苗及花茎均可食用。大蒜还具有较强的药用价值，具有杀菌、消 炎、抗病毒、抗癌、降血脂等功效。但目前在农业生产上，由于大蒜常年进行无性繁殖，致使 大蒜花叶病毒、洋葱黄矮病毒、韭葱黄条纹病毒、青葱潜隐病毒、大蒜普通潜隐病毒、洋葱螨 传潜隐病毒、马铃薯Y病毒和烟草花叶病毒等病原体在大蒜母体内传播，逐代积累，导致大 蒜优良种性不断退化，严重影响大蒜产量。 植物组织培养脱毒快繁技术能有效地降低大蒜体内的病毒，使大蒜保持优良种性，提 高农业生产上的繁殖系数。植物组织培养是指在无菌环境条件下，人工控制温度、光照、湿 度、营养、激素等条件，利用培养基提供养分，对离体的植物器官、组织、细胞或者原生质体 进行培养，使其再生细胞或形成完整植株的生物技术。本发明涉及的材料取自农艺性状优 良的宝坻特有大蒜品种"六瓣红"，经过愈伤组织培养所培育的大蒜。 宝坻特有品种"六瓣红"大蒜，蒜头致密紧实，一般每头6瓣左右，单柱型围座，无加楔， 无重瓣，蒜瓣洁白脆嫩，辛辣汁多味浓，易贮藏，耐运输，抗病性较强，辣味柔和适口，生、熟 食用倶佳。"六瓣红"大蒜以其优良的农艺性状、丰富的营养成分以及良好的口感，一直保持 着名优特产的地位，深受国内外消费者喜爱，目前已远销日本、韩国及东南亚等多个国家和 地区。 如何评价诱导愈伤组织培养植物是否完全继承亲本植物所具有的优良农艺性状，既全 面评估和控制愈伤组织培养植物的品质质量，是这一技术应用于农业生产方面亟待解决的 问题。 指纹图谱技术已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段之一。它可以 较全面、准确、直观的反映多种成分在中药或其制剂中的分布，是一种综合的、宏观的和可 量化的鉴别方法。运用指纹图谱技术，通过对指纹图谱中主要特征峰的识别或比例的测定， 可以鉴别中药材和中成药的真伪，有效评价产品质量的均一性和稳定性。但是，迄今为止， 有关诱导愈伤组织培养大蒜的指纹图谱还未见报道。 鉴于以上不足，有必要发明一种建立诱导愈伤组织培养大蒜指纹图谱的新方法，使之 能够简便、稳定、可重复、全面、精确的评价诱导愈伤组织培养大蒜的质量，从而既加强了对 诱导愈伤组织培养大蒜真伪鉴别能力，又能提高了诱导愈伤组织培养大蒜质量的全面评估 和控制，弥补了现有检测方法的不足，使之更加科学、完善。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是针对现有诱导愈伤组织培养大蒜品质管理检测方法 的不足，而提供一种诱导愈伤组织培养大蒜HPLC指纹图谱的建立方法。该方法通过将诱导 愈伤组织培养大蒜制备成酶解产物待测溶液，经固相萃取技术分离浓缩，再经由高效液相 色谱仪分析检测，获得指纹图谱，为其真伪鉴别以及品质控制提供可靠依据和技术方法。 本发明诱导愈伤组织培养大蒜酶解产物HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：该方 法按如下的步骤进行： (1) 大蒜酶解产物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g破碎、研磨， 加25-30ml蒸馏水，5〇-55°C温浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000Xg离心15min，取上清 液经0.45 μ m微孔滤膜过滤； (2) 大蒜酶解产物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、IOml超纯水活化， 平衡15min ;待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲 醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至〇. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至Iml，经0. 45 μ m微孔滤膜 过滤待测； (3) 参照物溶液的制备：精密称取二烯丙基二硫醚30. 44 mg和二烯丙基三硫醚32. 12 mg，溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液Iml用甲醇定容至10ml，作为参照物； (4) 高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18,5 ym，4.6x250mm;保护柱为： Eclipse Plus C18 Grd，5 μ m，4.6x12. 5mm;柱温 35°C;流动相为甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2 min - 10 min - 20 min，甲醇：70% - 70% - 80% - 80% ;二极管 阵列检测器检测波长240nm ;进样量50 μ L ;在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜酶解 产物HPLC指纹图谱； 本发明还提供上述大蒜酶解产物HPLC指纹图谱得到的诱导愈伤组织培养大蒜酶解产 物HPLC标准指纹图谱。 将10批次诱导愈伤组织培养大蒜样品按上述方法制备成供试品溶液，由上述方法分 离检测，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得 到诱导愈伤组织培养大蒜标准指纹图谱。该方法确定了 14个共有特征峰，其保留时间分别 为：2· 229 min、2. 98 min、3. 412 min、3. 858 min、4. 714 min、5. 969 min、6. 611 min、7. 144 min、8.121 min、9.261 min、10.783 min、13.302 min、15.59 min、18.655 min，相对标准偏 差（RSD)〈2%，这些共有特征峰构成了诱导愈伤组织培养大蒜酶解产物HPLC标准指纹图谱。 本发明公开的诱导愈伤组织培养大蒜酶解产物HPLC指纹图谱的建立方法与现有技术 相比所具有关键之处在于： (1)样品前处理简便，易于操作，采用固相萃取技术对样品进行预分离浓缩，得到的供 试品溶液所含杂质少，不污染色谱柱，对色谱图信号干扰小； (2) 色谱条件简便易行，重现性好； (3) 本发明能够最大程度上提取大蒜鳞茎酶解后的含硫化合物，在此基础之上建立的 HPLC指纹图谱对诱导愈伤组织培养大蒜品质控制更具针对性和实用性。 (4) 本发明色谱体系下各色谱峰分离较好，不仅能从整体上识别诱导愈伤组织培养大 蒜化学成分的特点，也能对如二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等化合物进行定性定量分 析。 (5) 本发明分析效率高，稳定性好，特异性强，重现性好，特征峰较多，利用本发明能对 诱导愈伤组织培养大蒜进行真伪鉴别，并能全面、准确地评价其内在品质质量。
[0005]
【附图说明】： 图1是诱导愈伤组织培养大蒜HPLC指纹图谱； 图2是参照物HPLC图谱；其中1:二烯丙基二硫醚，2:二烯丙基三硫醚； 图3是诱导愈伤组织培养大蒜HPLC标准指纹图谱。
【具体实施方式】
[0006] 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人 员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明 的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。所用各种原料均有市售。 实施例1 :诱导愈伤组织培养大蒜酶解产物HPLC指纹图谱的建立方法，该方法步骤如 下： (1) 样品、试剂盒仪器：诱导愈伤组织培养大蒜，使用安捷伦1200型高效液相色谱仪， 试剂均为色谱纯或分析纯； (2) 大蒜酶解产物待测溶液的制备：称取样品大蒜鳞茎20g破碎、研磨，加25-30ml蒸馏 水，50-55°C温浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000 X g离心15min，取上清液经0. 45 μ m微 孔滤膜过滤； (3) 大蒜酶解产物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、IOml超纯水活化， 平衡15min ;待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲 醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至〇. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至Iml，经0. 45 μ m微孔滤膜 过滤待测； (4) 参照物溶液的制备：精密称取二烯丙基二硫醚30. 44 mg和二烯丙基三硫醚32. 12 mg，溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液Iml用甲醇定容至10ml，作为参照物； (5) 高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18,5 ym，4.6x250mm;保护柱为： Eclipse Plus C18 Grd，5 μ m，4.6x12. 5mm;柱温 35°C;流动相为甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2 min - 10 min - 20 min，甲醇：70% - 70% - 80% - 80% ;二极管 阵列检测器检测波长240nm ;进样量50 μ L。 分别精密吸取各供试品液溶液，在上述色谱条件下经高效液相色谱仪分离检测，得到 大蒜酶解产物HPLC指纹图谱，见图1。 按相同实验条件分析参照物溶液得到图谱，见图2. 实施例2 : 诱导愈伤组织培养大蒜酶解产物HPLC标准指纹图谱的建立方法，该方法步骤如下： (1) 样品、试剂盒仪器：诱导愈伤组织培养大蒜共10批次，使用安捷伦1200型高效液 相色谱仪，试剂均为色谱纯或分析纯； (2) 大蒜酶解产物待测溶液的制备：样品大蒜鳞茎20g破碎、研磨，加25-30ml蒸馏水， 50-55°C温浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000 X g离心15min，取上清液经0. 45 μ