检测空肠弯曲菌的方法及其单抗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测领域。具体而言，本发明涉及一种抗空肠弯曲菌单克隆抗 体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞以及抗空肠弯曲菌的单克隆抗体的用途。
【背景技术】
[0002]空肠弯曲菌（Campylobacterjejunienteritis)是 1973 年Butzler等自腹泻病 人粪便中分离出来，目前已认识其为人类腹泻的主要致病菌之一。空肠弯曲菌肠炎的发病 率在发达国家超过细菌性痢疾，在发展中国家发病率几乎等同于细菌性痢疾。本菌作为重 要的食源性致病菌，随着食物进入肠道后在含微量氧环境下迅速繁殖，主要侵犯空肠、回肠 和结肠，侵袭肠粘膜，造成充血及出血性损伤，近年来观察到有些菌株能产生类似霍乱肠毒 素，引起肠腔内液体分泌增加。
[0003] 目前空肠弯曲菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、 检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定 的快速检测手段，但国内外目前尚无可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以空肠弯 曲菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及空肠弯曲菌快速检测产品。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种体外检测副溶血性弧菌的方法。
[0005] 本发明的另一个目的是提供用于上述方法的两株由同一次单克隆抗体制备过程 产生的可特异性地结合于副溶血性弧菌不同抗原位点的单克隆抗体。
[0006] 本发明的另一个目的是提供产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0007] 本发明的第一方面是提供了一种体外检测空肠弯曲菌的方法，所述方法用于非疾 病诊断目的，包括以下步骤：
[0008] (a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯 曲菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有"空肠弯曲菌-捕捉抗体"二元复合物的固相 载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9,所述的单 克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766产生；
[0009] (b)将检测抗体加样于（a)获得的固相载体，从而形成带有"检测抗体-空肠弯 曲菌-捕捉抗体"三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌 的单克隆抗体4C9E1G7H3,所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3， CGMCCNo. 8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；和
[0010] (C)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中空肠弯曲菌的存在 与否以及存在的量。
[0011] 在一优选例中，所述的固相载体为酶标反应板。
[0012] 在另一优选例中，所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。
[0013] 本发明的第二方面是提供了一种免疫球蛋白，它是特异性地结合于空肠弯曲菌的 单克隆抗体，它由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766所产生。
[0014] 本发明的第三方面是提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是小鼠杂交瘤 细胞系 3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766。
[0015] 本发明的第四方面是提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于检测空肠弯曲菌， 所述用途用于非疾病诊断目的。
[0016] 本发明的第五方面是提供了一种免疫球蛋白，它是特异性地结合于空肠弯曲菌的 单克隆抗体，它由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3,CGMCCNo. 8457所产生。
[0017] 本发明的第六方面是提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是小鼠杂交瘤 细胞系 4C9E1G7H3,CGMCCNo. 8457。
[0018] 本发明还提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于检测空肠弯曲菌，所述用途用 于非疾病诊断目的。
[0019] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【附图说明】
[0020] 图1本发明的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图
[0021] Lanel :4C9E1G7H3, Lane3 :3G2D8H3G9〇
【具体实施方式】
[0022] 本发明人的研究表明，以空肠弯曲菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得 到抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9,其抗体效价可达到1:100000,其能够 特异性、高效地与空肠弯曲菌结合，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福 氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠〇157:H7、小肠耶尔森氏菌等91种细菌（株）均无交叉 反应。
[0023] 本发明提供了抗空肠弯曲菌单克隆抗体。本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体可以 利用小鼠杂交瘤细胞系 4C9E1G7H3(CGMCCNo. 8457)或 3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766)分泌产 生。本发明包括具有抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9的相应氨基酸序列 的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本 发明包括具有含超变区（互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及 融合表达产物（即免疫偶联物及融合表达产物），只要该超变区与本发明的轻链和重链的 超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶 联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断 或治疗分子与抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与 抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0024] 对于本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。 抗空肠弯曲菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区（complementaritydetermining region，⑶R)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些 具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗空肠弯曲菌单克隆抗 体⑶R具有90%以上（较佳地95%以上）的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体， 还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或（Fab'）2片段；抗体重链；抗体轻链。
[0025] 本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以 用常规技术，利用杂交瘤细胞系 4C9E1G7H3(CGMCCNo. 8457)或 3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766) 获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0026] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0027] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0028]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子（或如载 体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0029] 本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这 些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0030] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0031] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaClJi 处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电 穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规 机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
[0032] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导）