单 克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766产生；
[0062] (b)将检测抗体加样于（a)获得的固相载体，从而形成带有"检测抗体_空肠弯 曲菌-捕捉抗体"三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌 的单克隆抗体4C9E1G7H3,所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3， CGMCCNo. 8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；和
[0063] (C)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待检测样品中空肠弯曲菌的存 在与否以及存在的量。
[0064] 作为本发明的一种优选方式，定量检测空肠弯曲菌的方法具体如下：
[0065] (i)抗原抗体反应：将本发明的捕捉抗体包被在多孔板上，之后在多孔板的微孔 内分别加入不同浓度的标准品、质控品（可选），或待测样品；
[0066] (ii)酶联反应：将检测抗体（其上设置有标记物）溶液加入各孔，振荡、孵育、洗 涤；
[0067] (iii)显色反应：每孔加入对应于标记物的底物、显色剂，孵育，每孔加入反应终止 液，结束反应：
[0068] (iv)酶标仪测定OD值：
[0069] (V)结果计算：
[0070] A)制作标准曲线：以空肠弯曲菌标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐 标，做出标准曲线；
[0071] B)评判质控品浓度（可选）：根据质控品的OD值，从标准曲线上读出相应的浓度 值；质控品测定浓度值处于给定范围时，该次测定有效；
[0072] C)计算待测样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD 值从标准曲线计算出待测样品的空肠弯曲菌浓度。
[0073] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0074] 实施例1.抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9的制备
[0075] -、免疫原和阳性标准品的准备
[0076] 空肠弯曲菌（CICCNo. 22937)接种在布氏肉汤上，37°C、150r/min振荡厌氧条件 培养17h，计数，加入0. 3%甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整空肠弯曲菌（CICC No. 22937)浓度至5X109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为10scfu/ml作为阳性 对照标准品，布氏肉汤为阴性对照标准品。
[0077] 二、单克隆抗体的制备
[0078] 1、实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0079] 2、免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一 次。
[0080] 3、采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血 清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0081] 4、细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融 合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5%CO2培养箱培养。
[0082] 5、杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将 其转移至24孔培养板。
[0083] 6、克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔 底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 - 4次，直至阳性率达到 100 %。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2XIO6个 杂交瘤细胞，7~10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。
[0084] 三、单克隆抗体纯化及鉴定
[0085] 腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用Protein G Sepharose亲和层析法纯化；纯 化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价（见表1);再用SDS-PAGE分析纯度，5% 积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像 分析系统观察结果（见图1)。
[0086] 表1.两株单克隆抗体效价测定结果（OD4m)
[0089] 实施例2.单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9的特性鉴定 [0090] 一、单克隆抗体亚类鉴定
[0091] 1、抗原包被：用0.OlMPBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50y1，4°C包被过夜， 次日弃去孔内液体，洗板3遍。
[0092] 2、封闭：每孔加入1 %BSA200y1，4°C封闭过夜。次日拍干板子不洗板。
[0093] 3、加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50yl。37°C，孵育 lh〇
[0094] 4、洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3,IgA，IgM， K，A，37°C孵育lh。
[0095] 5、洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG(H+L)， 37°C，孵育 30min。
[0096]6、洗板4遍后，加入100 y 1底物显色液，37°C，避光显色lOmin。于450nm波长下 读取结果。
[0097] 如表2所示，H3属于IgG2a亚类，G9属于IgGl亚类。
[0098] 表2.两株单克隆抗体亚类鉴定结果
[0099]
[0100] 二、单克隆抗体交叉反应测试
[0101] 1、抗原包被：将96种10scfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌 加3各孔，每孔100yI，4°C，包被过夜。
[0102] 2、封闭：洗板3遍后，每孔加入3%BSA200y1，37°C孵育2h。
[0103] 3、洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100y1，37摄氏度孵育lh。
[0104] 4、洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100y1，37摄氏 度孵育Ih。
[0105] 5、洗板4遍。加入底物显色液，37°C，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。
[0106] 表3.两株单克隆抗体交叉反应检测结果
[0107]
[0111] 实施例3.检测空肠弯曲菌的酶联免疫试剂盒的组成、制备及其应用
[0112] -、酶联免疫试剂盒由下述物质组成
[0113] (1)预包被抗体的酶标板：用0. 02M醋酸缓冲液（pH2. 0)溶液稀释、抗空肠弯曲 菌单克隆抗体3G2D8H3G9包被96孔酶标板，每孔100y1。4°C孵育过夜，按照常规ELISA方 法封闭洗潘。
[0114] (2)空肠弯曲菌阳性对照标准品和阴性对照标准品。
[0115] (3)辣根过氧化物酶标记的抗空肠弯曲菌的单克隆抗体4C9E1G7H3。
[0116] (4)酶标抗体稀释液：0?OlMPBS，pH7. 6。
[0117] (5) 10X浓缩洗液：含有0? 5%吐温-20和0? 2%叠氮钠的0?IM磷酸盐缓冲液，pH 7. 4,使用时将浓缩洗液10倍稀释即可。
[0118] (6)显色液A液，显色液B液。使用前将A液与B液等体积混合。
[0119] (7)终止液：2M硫酸溶液。
[0120] 二、酶联免疫试剂盒中各组分的制备
[0121 ]( -）将空肠弯曲菌单克隆抗体3G2D8H3G9作为捕捉抗体包被酶标板
[0122] 用包被缓冲液将空肠弯曲菌单克隆抗体3G2D8H3G9稀释成5yg/ml，每孔加入 100y1，4°C过夜，次日倾去包被液，用稀释好的洗液洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入 220y1封闭液，37°C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝箱袋密封保存。
[0123] 包被缓冲液：0. 02M醋酸缓冲液，用5MHCl调节pH至2. 0。
[0124] 封闭液：含有0. 3%牛血清白蛋白和10%蔗糖的0.OlMPBS。
[0125] (二）辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C9E1G7H3的制备