卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 卡他莫拉菌（Moraxellacatarrhalis，Mc)首次发现于1896年，当时称之为卡他 微球菌（Micrococcuscatarrhalis)，尔后又称为卡他奈瑟菌（Neisseriacatarrhalis)和 卡他布兰汉菌（Branhamellacatarrhalis)。卡他莫拉菌为革兰氏阴性球菌，通常呈肾形 双球菌状，偶可呈四联状，无鞭毛，无芽胞，一般无荚膜。其营养要求不高，普通培养基上即 可生长，需氧，最适生长温度为35°C。菌落直径1~3_，光滑型，灰白色，不透明，整个菌落 易从培养基上刮下。较长时间培养后，菌落可呈粗糙颗粒状，黏附在培养基表面。产氧化酶 和DNA酶。对糖类均不发酵。抵抗力较强，在痰中可存活27d，65°C时可存活30min。
[0003] 过去一直认为Mc是对人体无致病性的上呼吸道正常寄居菌，但是，近20多年的研 究发现，该菌不仅可以引起儿童和老年人的上呼吸道感染，而且还是引起成人下呼吸道感 染的重要病原菌，是儿童上颌窦炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最 常见致病菌，仅次于肺炎支原体和肺炎链球菌。已有报道该菌可引起呼吸道医院感染爆发 流行。因此，卡他莫拉菌及其所致感染日益受到人们关注，对该菌的生物学特性、流行病学、 所致疾病、耐药性以及感染的防治有了更多的认识。
[0004] 临床上由于Mc与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床 表现、X-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。而儿童疾病的特点是起病急、 转归快，因此敏感、快速、实用的Mc检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。
[0005] 尽管Mc在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。 目前，Mc感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检测法。
[0006] 检测血清中McIgG、IgA、IgM抗体常用的方法有：微量免疫荧光抗体检测（MIF)， 补体结合试验（CF)，重组酶免疫测定（rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验（SeroCF- EIA)等。然而Mc抗体的检出只能说明该个体感染过Mc，却不能反映体内是否仍有Mc活菌 存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果进行判断，需要较长的 时间。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测 时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。
[0007] 核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应（PCR)，核酸杂交检测Mc的特异性强， 但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较 高的敏感性，但PCR实验对实验室有特殊要求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现 假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。
[0008] 病原体检测方法主要为病原分离培养法，将标本接种于血平板，35~37°C，于含 5%二氧化碳（CO2)孵箱中孵育16~20h，再根据菌落形态、革兰染色及生化鉴定（氧化酶 阳性、葡萄糖阴性，DNA酶、硝酸盐还原酶阳性）确定为卡他莫拉菌。该法为检测卡他莫拉 菌感染的"金标准"，但其存在操作步骤复杂，检测时间长等明显缺陷，并不十分适合临床应 用。
[0009]因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的卡他莫拉菌抗原快速检测法以满足临床 的检测需求就显得非常必要了。
【发明内容】
[0010] 本发明针对【背景技术】中现存的几种卡他莫拉菌在检测方式中遇到的技术瓶颈，提 出了一种具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点的卡他莫拉菌量子点免疫层 析检测卡及其制备方法和应用。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术手段来实现的：
[0012] -种卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于：所述卡他莫拉菌量子点免 疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点标 记的抗卡他莫拉菌纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤 维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体；所述质控线包被 有抗兔IgG;所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部 的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合 垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。
[0013] 作为优选，本发明所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS 量子点。
[0014] 作为优选，本发明所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
[0015] 作为优选，本发明所采用的检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是6. 6-7. 7cm的 底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2. 5-3cm的吸水垫重 叠0. 2-0. 4cm;所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0. 5-0. 8cm的结合垫重 叠0. 2-0. 4cm;所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2. 5cm的样品垫重叠0. 2- 0. 4cm;所述检测线与质控线的间距是0. 5-0. 8cm;所述底板的宽度是0. 3-0. 5cm。
[0016] 作为优选,本发明所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。
[0017] -种基于上述的卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于：所 述制备方法包括以下步骤：
[0018] 1)结合垫的制备：
[0019]I. 1)重组UspAl-His融合蛋白的制备、纯化：
[0020] I.I. 1)对卡他莫拉菌表面蛋白UspAl进行生物信息学分析，获取其胞外结构域中 抗原表位最为丰富的肽段；
[0021] I. 1. 2)找到步骤I.I. 1)中所得到肽段对应的基因编码序列，并在序列的5'端及 3'端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为UspAl;其基因序列参见序列表；
[0022] 1. 1.3)将步骤1. 1.2)中所得到的UspAl按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组UspAl-His融合蛋白；所述重组UspAl-His融合蛋 白以包涵体表达方式存在于菌体中；
[0023]I. 1. 4)用镍柱纯化步骤I. 1. 3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以 Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0. 2mg/mL后备用；
[0024]I. 2)兔及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG的制备：
[0025]I. 2. 1)以步骤I.L4)中所得到的重组UspAl-His融合蛋白为完全抗原，分别免 疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清及鼠抗卡他莫拉菌 UspAl蛋白抗血清；所述兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白 抗血清的间接ELISA效价均大于IXIO5;
[0026] 1. 2. 2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清及 鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG;
[0027] 1. 2. 3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1. 2. 2)所得到的二种多克 隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为3mg/mL后备用；
[0028] 1. 3)量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针的制备与纯化：
[0029] 1. 3. 1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺和 300nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min，37°C反应 30min后，透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分 含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲 液的pH= 7. 3 ;
[0030] 1. 3. 2)在活化的量子点中，加入4_12nmol的步骤1. 2)所制备的兔抗卡他莫拉菌 UspAl蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1. 5%，封闭 未反应的活化羧基位点，继续避光反应Ih;用0. 2ymPES滤器过滤除去抗体聚集物，然后 将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心15min，除去未发生偶 联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml 磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以SOOOg离心力在4°C下离心 15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于Iml磷酸盐保存液中，至此制得 量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针；
[0031] 所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢 钠、2g/L氯化钠、5ml/L吐温-20以及lg/L叠氮钠；所述磷酸盐洗涤液的pH= 7. 3 ;所述磷 酸盐保存液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、 10g/LBSA以及lg/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH= 7. 3 ;
[0032] 1. 4)量子点标记抗体的负载：
[0033] 将聚酯纤维膜浸入步骤1. 3. 2)所得到的量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针溶 液中lh，取出，25°C干燥后4°C密封保存备用，至此制得结合垫；
[0034] 2)样品垫的制备：
[0035] 取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置 于生物安全柜内37°C通风干燥后，25°C密封干燥保存；至此制得样品垫；
[0036] 所述样品垫处理液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢 钠、2g/L氯化钠、20g/L牛血清白蛋白（BSA)、10ml/L吐温-20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯 吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH= 7. 3 ;
[0037] 3)检测层的制备：
[0038] 3. 1)将步骤1. 2)制备的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体与抗兔IgG用磷 酸盐缓冲液均调整至终浓度为〇. 5-2. 5mg/mL后备用；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分 别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的pH=7. 3 ；
[0039] 3. 2)将稀释好的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体装入BIODOT划膜仪喷头 中，设置0. 8-2. 5iU/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入 BIODOT划膜仪喷头中，设置0. 8-2. 5iil/cm的量按照与检测线0. 5-0. 8cm的间隔喷于硝酸 纤维素膜上作为质控线；
[0040] 3. 3)将喷有检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37°C干燥2h，4°C密封干燥保 存