[0126] 将空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3与辣根过氧化物酶（HRP)进行偶联，采用的 方法是改良的过碘酸钠法，方法如下：
[0127] a、5mg辣根过氧化物酶（HRP)溶解于0. 5ml0. 2M醋酸缓冲液（pH5. 6)中。
[0128] b、加入现配制的0. 06M似104溶液0. 5ml，4°C氧化20min。
[0129]c、加入含22%NaCl的0. 4M乙二醇溶液0. 5ml，室温静置30min。
[0130] d、用6ml预冷的无水乙醇沉淀酶，1500rpm离心lOmin。
[0131] e、去上清，将沉淀溶于2. 5ml的0.OlMPBS(pH7. 4)中。
[0132] f、加入IOmg单克隆抗体4C9E1G7H3,并立即用0? 5M碳酸缓冲液（pH9. 6)调节pH 至9.0。4°C静置过夜。
[0133] g、加入 10mg/ml硼氢化钠 50y1，4°C，静置 2h。
[0134] h、用 0?OlMPBS(pH7. 4)4°C透析过夜。
[0135] i、纯化保存。
[0136] 三、试剂盒的应用
[0137] ( -）检测方法
[0138] 1、样品前处理
[0139] 取待检样品25g(ml)加入225ml布氏肉汤于均质机下均质混匀，36°C±1°C培养 16h。将培养好的样品在100°C水浴中加热lOmin，取出冷却至室温待用。
[0140] 2、用试剂盒检测
[0141] 取出所需数量的微孔和所有试剂常温下放置30min。取200y1待检样品加到微 孔中，37°C，孵育30min。倒去孔内液体，加入200y1洗液到每个微孔内，轻轻晃动数秒，快 速翻转将微孔内液体倒尽，向一叠干净的吸水纸拍几下，如此重复操作共洗板3次。加入 100y1酶标单克隆抗体4C9E1G7H3工作液，37°C，孵育60min。倒去孔内液体并洗板4次。 将显色A液和显色B液等量混合配成底物显色液。每个微孔加入100y1的底物显色液，室 温避光显色15-20min。加入终止液100y1，用酶标仪于450nm下测定吸光度值。
[0142] 结果判定：阴性对照< 0. 1、阳性对照多0. 3,实验结果有效，否则结果判定为无 效；检测孔OD值彡0. 2时，判定为阳性；检测孔OD值介于0. 1-0. 2之间时，判定为弱阳性； 检测孔OD值< 0. 1判定为阴性。
[0143] 若无酶标仪，可用肉眼判定：阳性对照孔有肉眼可见的黄色，阴性对照孔无颜色， 实验结果有效，否则判定为实验结果无效；当检测孔有明显肉眼可见的黄色时为阳性结果； 有微弱黄色时，判定为弱阳性结果；无肉眼可见黄色时为阴性结果。
[0144] (二）酶联免疫试剂盒效果的检测
[0145] 1、试剂盒重复性和稳定性测试
[0146] 板内精密度测试：取同一块酶标板上的6个微孔，用被空肠弯曲菌污染过的牛奶 进行测试，实验重复4次。
[0147] 板间精密度测试：取同一批次的4块酶标板，用被空肠弯曲菌污染过的牛奶进行 测试，实验重复3次。
[0148] 变异系数的计算方法：变异系数（CV)=测定结果的标准差与其平均值的百分比。
[0149] 表4.板内重复性测试结果
[0150]
[0151] 表5.板间重复性测试结果
[0152]
[0153] 2、试剂盒交叉反应测试
[0154]用试剂盒去检测其他91种食源性致病菌和常见食品携带细菌，验证试剂盒检测 空肠弯曲菌的特异性，观察是否与其他的致病菌有交叉反应和假阳性出现。
[0155] 表6.试剂盒特异性测试
[0160] 注：" + "表示检测结果呈阳性；"一"表示检测结果为阴性。
[0161] 3、试剂盒保存期实验
[0162] 试剂盒保存条件为2-8°C，经过12个月后，试剂盒的检测结果与新批次的试剂盒 结果一致。考虑到运输和使用过程中会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存的条 件下放置8天，进行加速老化试验，结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。因此试剂盒 可以在2 - 8°C至少可以保存12个月以上。
[0163] 生物材料的保藏
[0164] 产生经过上述鉴定的空肠弯曲菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G2D8H3G9于2014 年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)(北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，分类命名为"抗空 肠弯曲菌杂交瘤细胞"，保藏号为CGMCCNo. 8766。
[0165] 产生经过上述鉴定的副溶血性弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C9E1G7H3于 2013年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)(北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，分类命名 为"抗空肠弯曲菌杂交瘤细胞"，保藏号为CGMCCNo. 8457。
[0166] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种体外检测空肠弯曲菌的方法，所述方法用于非疾病诊断目的，包括以下步骤： (a) 将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯曲菌 与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有"空肠弯曲菌-捕捉抗体"二元复合物的固相载 体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9,所述的单克 隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766产生； (b) 将检测抗体加样于（a)获得的固相载体，从而形成带有"检测抗体-空肠弯曲 菌-捕捉抗体"三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的 单克隆抗体4C9E1G7H3,所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3， CGMCCNo. 8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；和 (c) 检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中空肠弯曲菌的存在与否 以及存在的量。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固相载体为酶标反应板。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。4. 一种免疫球蛋白，它是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体，其特征在于，它由 小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766所产生。5. -种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞系 3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766〇6. -种如权利要求4所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于检测空肠弯曲 菌，所述用途用于非疾病诊断目的。7. -种免疫球蛋白，它是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体，其特征在于，它由 小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3,CGMCCNo. 8457所产生。8. -种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞系 4C9E1G7H3,CGMCCNo. 8457。9. 一种如权利要求7所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于检测空肠弯曲 菌，所述用途用于非疾病诊断目的。
【专利摘要】本发明属于微生物检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测空肠弯曲菌的方法、用于该方法的两株由同一次单克隆抗体制备过程产生的抗空肠弯曲菌的单克隆抗体，该单克隆抗体可特异性地与空肠弯曲菌结合。它由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9，CGMCC？No.8766或4C9E1G7H3，CGMCC？No.8457所产生。本发明还提供了抗空肠弯曲菌的单克隆抗体的用途。CGMCC No.876620140109
【IPC分类】C07K16/12, C12R1/91, C12N5/20, G01N33/577
【公开号】CN105223363
【申请号】CN201510573715
【发明人】万绍业, 方水琴, 郭慧琴, 杨标, 胡永辉, 刘箐
【申请人】上海慧耘生物科技有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月10日