一种测定水产品中麻痹性贝类毒素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产品检测领域，具体的说涉及一种测定水产品中麻痹性贝类毒素的 方法。
【背景技术】
[0002] 麻痹性贝类毒素（PSTs)是水体中浮游藻类或微生物产生的一类水溶性极强 的小分子次生代谢产物。其基本结构是两个胍基的四水化嘌呤多叠六元环。根据取代 基团的不同，主要分为四类：①氨基甲酸酯类毒素 （Carbamate toxins)，包括石房蛤毒 素（Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素（neoSTX，ΝΕ0)和膝沟藻毒素 l_4(Gonyautoxins， GTX1-4);② N-磺酰氨甲酰基类毒素（N-sulfocarbamoyl toxins)，包括 GTX5 (BI)、 GTX6(B2)和 C1-C4 ;③脱氛甲醜基类毒素 （Decarbamoyl toxins)，包括 dcSTX、dcneoSTX、 dcGTXl-4;④脱氧脱氛甲醜基类毒素（Deoxydecarb-amoyl toxins)，包括 doSTX、doneoSTX 和doGTXl等，其中，氨基甲酸酯类毒素是较为重要的一类毒素。
[0003] PSTs是一类高效的钠离子通道神经毒素。当人体摄入了被PSTs污染的海产品 后，临床初期主要表现为嘴、唇、舌发麻，四肢出现麻痹症状，感觉出现异常，人变得虚弱和 混乱；后期主要表现为恶心，呕吐，呼吸急促，头痛发烧，吞咽困难，血压异常，严重者出现意 识模糊甚至死亡。其中，氨基甲酸酯类毒素分布最广、毒性最强，其典型代表STX占 PSTs分 布的85%以上。N-磺酰氨甲酰基类毒素虽然其本身毒性较小，但是在生物体内极易通过生 物转化脱去磺酰基和氨基甲酸酯链生成毒性很强的STX和脱氨甲酰基类毒素。另外，最新 的生物转化实验发现并确认了在贝体内存在一类C1/C2毒素。
[0004] 为保障公众不受PSTs的威胁，世界许多国家、地区及相关国际组织都已经对贝类 水产品进行严格管理和控制，并制定了相应的贝类水产品及其制品的PSTs限量标准。不同 于其他毒素的安全性评价是建立在毒素标准品本身的毒性评价，PSTs的限量标准是基于动 物实验法的毒理学评价。
[0005] 目前通行的生物体内PSTs限量标准是联合国卫生组织（WHO)依据小鼠试验法 (MBA)得到的。该法的LOD值以及出现病理学特征的最低毒力为80yg STXeq/100g，即 400MU，MBA也被确定为PSTs安全性评价的标准方法。这个标准被包括我国在内的大多数国 家所采用，也被认为是PSTs安全问题的最低标准。研究表明，虽然在自然环境以及单一生 物体内并不包含目前已知的所有PSTs (目前已知一种生物体内最多检测到5-10种PSTs)， 但是对于某些已发现的此类毒素，其性质我们并不清楚，也就难以对其进行安全及毒性评 价。此外，不同的PSTs具有不同的毒性，某些毒素如N-磺酰氨甲酰基类毒素虽然其本身毒 性较低，但是可以通过环境诱导或者生物转化形成高毒的分子形态，而在环境和生物体内 这种转化十分常见。因此，由于PSTs具有毒性多样性和易变性的特点，使得对于这类毒素 的精确定量检测出现了不小的难度。MBA法虽然是目前通用的标准检测方法，但是其灵敏度 低和准确度差使得这种分析方法饱受争议。2009年，欧洲食品安全局建议将PSTs限量值控 制在7. 5 μ gSTXeq/lOOg以内，远远低于MBA的L0D。因此，必须找到具备更高灵敏度和准确 度的合适检测方法替代MBA，为PSTs安全评价研究提供手段和前提。
[0006] 目前，MBA和HPLC-FLD法已经成为英国食品标准局（FSA)、A0AC、美国贝类卫生管 理计划（NSSP)等标准制定机构确定为PSTs的标准检测方法，已经建立相对成熟的监测体 系。LC-MS法的出现被认为是MBA和HPLC-FLD法的合适替代者，因其对HPLC-FLD法耗时和 操作难度大两大缺点做了明显的改善。目前国际上针对PSTs的LC-MS检测法仍存在一定 的不足，如前处理方式对毒素各组分的回收率差异很大，没有合适的净化方法来很好的限 制基质效应对组分测定的影响等。
[0007] 因此有必要系统的建立了一套多组分PSTs的定量检测方法，以确保水产品质量 安全。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种测定水产品中麻痹性贝类毒素的方法，该方法具体包 括如下步骤：
[0009] (1)称取捣碎后的样品，加入提取溶液，涡旋及超声振荡提取后离心，上清液合并 冷冻后，取出下层冷冻干燥至近干；
[0010] (2)复溶、用吸附剂进行净化，涡旋振荡离心，上层液过滤膜待分析；
[0011] (3)待测样品液通过液相色谱串联质谱仪进行麻痹性贝类毒素的定性定量分析。
[0012] 其中所述的样品可以为扇贝、蛤蜊、贻贝等贝类水产品；
[0013] 步骤⑴中所述的提取溶液为含0. 1% (质量百分比浓度）甲酸的乙腈水溶液（乙 臆：水=80 :20,体积比）；
[0014] 所述步骤（2)中净化吸附剂为C18硅胶和酸性氧化铝，二者的重量比为1 :1 ;
[0015] 步骤（3)中所测麻痹性贝类毒素为：石房蛤毒素（STX)、新石房蛤毒素（neoSTX)、 膝沟藻毒素1-4 (GTX1-4)、N-磺酰氨甲酰基膝沟藻毒素-2 (Cl)和N-磺酰氨甲酰基膝沟藻 毒素-3(C2);
[0016] 所述步骤（3)中的液相分析条件具体如下：
[0017] 色谱柱：TSK-gel Amide-80 亲水柱（150X2mm，3ym);柱温：30°C ;流速：0· 3mL/ min ;进样量：5 μ L ;
[0018] 流动相：Α相：乙腈；B相：3. 6mM甲酸、2mM甲酸铵水溶液（pH 3. 5)
[0019] 梯度洗脱程序：0min，15% B ;0-10min，45% B ;10-llmin，45% B ;ll-14min，15% B, 14-19, min 15% B ；
[0020] 步骤（3)中所使用的质谱分析条件具体如下：
[0021] 离子源模式：正离子模式（ESI+);喷雾电压：4. Okv(ESI+);加热块温度：300°C;离 子传输管温度：350°C ;鞘气：氮气，流量35arb ;辅助气：氮气，流量20arb ;碰撞气：氩气，碰 撞压力I. 5mTorr。
[0022] 具体的说，本发明的一种测定水产品中麻痹性贝类毒素的方法，包括如下步骤：
[0023] (1)采集得到的贝类生物样品用水洗净，取出软组织，放入组织捣碎机中捣碎，取 样品加入含0. 1%甲酸的乙腈水溶液（80:20，v/v)进行提取，涡旋振荡Imin后冰水状态下 超声提取l〇min，4500rpm 15°C以下离心10min ;将离心后得到的上清液，-20°C条件下冷冻 4h，取出后迅速弃去上层有机相（〈lmin)，下层冷冻干燥至近干；
[0024] 其中含0. 1%甲酸的乙腈水溶液与样品的比例为1-3 :l(ml :g);
[0025] (2)用质量百分比浓度为0· I %的甲酸水复溶并定容，加入质量比为1 :1的C18和 酸性氧化错作为吸附剂对其净化，祸旋振荡lmin，15°C以下4500rpm离心10min，上层液过 0. 22 μ m尼龙滤膜待分析；
[0026] (3)将步骤（2)获得的待检测样品通过液相色谱串联质谱仪进行分析，分别获得8 种麻痹性贝类毒素的检测结果。
[0027] 本发明提供了一种前处理方法简单经济快捷、灵敏度及准确度高的液相串联质谱 法测定水产品中8种麻痹性贝类毒的素检测方法。
[0028] 本发明的一种测定水产品中麻痹性贝类毒素的方法与现有技术相比，具有以 下技术优点和效果：前处理采用改进的方法更加简便快捷、节省了样品处理的时间及成 本、减少了有机溶剂的消耗量。同时处理后的样本十分干净，连续进样后灵敏度不会有 明显变化。本发明方法中不同毒素在不同基质中的定量限分别为：STX，0.33-1. 65 yg/ kg ；NE0, 0. 69-2. 59 μ g/kg ；GTX 1,4. I 4-5. 52 μ g/kg ；GTX4, 2. 70-6. 08 μ g/ kg ；GTX2, 2. 01-2. 82 μ g/kg ；GTX3, I. 60-4. 79 μ g/kg ；C1, 2. 27-3. 33 μ g/kg ； Cl, 1.35-2. 69 μ g/kg;回收率在81. 52%~116. 50%之间，相对标准偏差均小于19. 10%。 由此可见，灵敏度及精密度均可满足定量检测要求。
【附图说明】
[0029] 图1为8种麻痹性贝类毒素标准溶液的选择反应监测（SRM)图谱（其中各组分 标准溶液的浓度分别为：STX :39· 69 μ g/mL ;NEO :4L 37 μ g/mL ;GTX2 :90. 29 μ g/mL ;GTX3