重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及胰岛素或其类似物的有关物质的检测方法，尤其涉及重组人胰岛素或 其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法，属于胰岛素类产品脱氨产物的定性与定量分析 领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是已成为严重危害人类健康和生命的一大疾病。随着人们生活方式的改变 和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率逐年上升，尤其是各种急慢性并发症的发生，给患者 个人、家庭及社会带来沉重负担。糖尿病治疗最重要的目的是控制血糖水平，1型糖尿病患 者及部分2型糖尿病患者需要使用胰岛素来降低血糖。近年来随着重组DNA技术的出现， 人们开发出了具有不同作用时间的重组人胰岛素及其类似物，并实现了产业化，给糖尿病 患者带来了福音，极大减轻了糖尿病患者的痛苦。
[0003] 重组人胰岛素是一种利用重组DNA技术，经重组大肠杆菌或者重组酵母菌发酵和 纯化制备得到的蛋白质，广泛用于2型和1型糖尿病的临床治疗。重组人胰岛素由A和B 两条链组成，A链含有21个氨基酸，B链含有30个氨基酸。两条链之间由两对二硫键相连 (A7-B7和A20-B19)，在A链内部还有一对二硫键（A6-A11)，其一级结构见图1。
[0004] 二硫键的存在对稳定胰岛素结构及生理活性具有重要作用。随着人们对胰岛素结 构与功能的深入研究以及基因工程技术和蛋白质工程的应用，通过改变或者修饰重组人胰 岛素的部分氨基酸序列，可以赋予胰岛素新的聚合特性，使其具备速效或长效胰岛素的生 理特征，以满足人们不同类型的胰岛素需求。
[0005] 目前市面上的速效重组人胰岛素类似物有赖脯胰岛素、赖谷胰岛素和门冬胰岛 素。赖脯胰岛素是由人胰岛素 B链第28位脯氨酸与B链第29位赖氨酸相互交换而形成的 一种速效胰岛素类似物，能显著改善2型糖尿病患者的胰岛β和α细胞功能，促进胰岛素 分泌；赖谷胰岛素是赖氨酸替代人胰岛素 B链第3位天冬酰胺，谷氨酸替代B链第29位赖氨 酸而形成的新型速效人胰岛素类似物，局部吸收更快。门冬胰岛素是人胰岛素 B链28位脯 氨酸被天门冬氨酸所取代而得到的胰岛素类似物，其吸收速率更快，有利于稳定餐后血糖。
[0006] 长效重组人胰岛素类似物有甘精胰岛素和地特胰岛素。甘精胰岛素在人胰岛素 B 链C末端增加了 2个精氨酸残基，A链C末端的最后一个天冬氨酸被甘氨酸取代，使其六聚 体结构更稳定，通过在注射部位缓慢降解成单体吸收，从而具备了长效胰岛素的特性；地特 胰岛素是由原型胰岛素去除了 B链第30位苏基酸，通过酰化作用在Β29位赖氨酸侧链氨基 连接了一个十四烷基脂肪酸侧链而成，其被人体吸收缓慢，作用持续时间延长，其结构式见 图2。这些速效和长效重组人胰岛素类似物在结构上与重组人胰岛素差异较小，但具有较好 的降血糖效果，因此受到广大糖尿病患者的青睐。
[0007] 组成蛋白质或多肽的氨基酸中若含有天冬酰胺（Asn)和谷氨酰胺（Gln)残基，该 蛋白质的这两种氨基酸的侧链氨基就有可能发生脱氨基现象，生成对应的天冬氨酸（Asp) 或谷氨酸（Glu)残基，最终得到与原蛋白结构类似的副产物，这种脱氨基反应在酸性溶液 环境中更为明显。这些副产物的理化性质与原蛋白十分接近，功能与原蛋白相近，但免疫原 性可能存在一定的差异，所以脱氨产物一般作为有关物质（杂质）在目的蛋白中的含量有 着严格的限制。重组人胰岛素 A链含有2个Asn (A18和A21)和2个Gln (A5和A15)，B链 中含有1个Asn (B3)和Gln (B4)，而且重组人胰岛素制备工艺中经常使用到酸性溶液，所以 最终的重组人胰岛素产品中会含有一定比例的脱氨产物，含量一般不超过1. 5%。由于重组 人胰岛素类似物氨基酸组成与人胰岛素的氨基酸基本一致，所以胰岛素类似物在生产过程 中这两种氨基酸残基也很容易脱掉氨基生成相应的杂质，进而影响胰岛素类似物的纯度和 安全性。开发胰岛素类产品脱氨产物的定性与定量分析方法对于保证产品质量至关重要， 不但可以更好保证产品的质量安全性，也可以作为生产过程中质量控制和工艺优化的重要 依据。特别是对胰岛素类似物而言，目前多国药典中都未收载这类产品，没有对该药品质量 控制的质量标准和分析方法。目前有文献报道的鉴定方法是将脱氨产物采用高效液相色谱 的方法将其分离、脱盐和浓缩制备，然后再进行液质分析，操作十分复杂，特别是采用高效 液相分离目的蛋白和脱氨产物难度较大，很难得到单一产物。因此，建立一种快速简单的鉴 定脱氨基产物位点的分析方法对药物研发人员及质控人员来说显得非常重要。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、准确的鉴定重组人胰岛素或其类似 物的主要脱氨产物位点的方法
[0009] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0010] -种重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法，所述方法包括如 下步骤：
[0011] (1)将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用蛋白酶进行酶解再用还原剂 还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个小肽段；将 分离的各个小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到未经脱氨基处理 的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图；
[0012] (2)将待检测的重组人胰岛素或其类似物进行脱氨基处理后用蛋白酶进行酶解， 再用还原剂还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个 小肽段；将分离的各个小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到脱氨 基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图；
[0013] (3)将未经脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图和经过脱氨 基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图进行分析比较，找出出现在经过脱氨 基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图中但没有出现在未经过脱氨基处理 的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图的肽段并确定该肽段离子峰的质荷比；
[0014] (4)提取该肽段的母离子峰进行MS/MS二级碎片分析，获取二级MS图谱和系列碎 片图谱，将该肽段的系列碎片离子与其理论碎片离子进行匹配对比，精确定位该肽段是检 测样品中哪个位点的脱氨产物，该位点即为检测样品的主要脱氨产物位点。
[0015] 所述的脱氨基处理包括将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用 稀酸制成酸性溶液后再进行加热处理；所述稀酸可以为盐酸或醋酸，其浓度优选为 0· 01-0. 05mol/L，更优选为0· 02mol/L ;所述的加热处理优选采用水浴加热，其中，水浴加 热的温度优选为40-60°C，更优选为60°C ;所述的加热时间优选为3-6h，更优选为4h。
[0016] 优选的，将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用稀酸制成酸性溶液的方 法包括：
[0017] 将重组人胰岛素原料药、赖脯胰岛素原料药、门冬胰岛素原料药、赖谷胰岛素原料 药或地特胰岛素原料药直接用稀酸溶液溶解成3-6mg/ml的溶液（优选为5mg/ml);或者将 重组人胰岛素注射液、赖脯胰岛素注射液、门冬胰岛素注射液、赖谷胰岛素注射液或地特胰 岛素注射液采用Millipore 3KD的超滤管超滤换相浓缩至稀酸溶液中，使样品的终浓度为 3_6mg/ml (优选为 5mg/ml)。
[0018] 步骤（1)或步骤（2)中所述的蛋白酶优选为Glu-C蛋白内切酶；所述蛋白酶与样 品的用量之比为1:3~1:8,优选为1:5 ;所述酶切时间优选为4-8h，更优选为6h ;所述酶切 反应温度优选为30-40°C，更优选为37°C。
[0019] 步骤（1)或步骤（2)中进行酶解时所用到的酶解缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液 或者HEPES缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为15-30mmol/L，优选为20mmol/L ;所述 HEPES缓冲液的终浓度为30-70mmol/L，优选为50mmol/L ;所述缓冲液的pH值为7. 0-8. 0， 优选为7. 5。
[0020] 步骤（1)或步骤（2)中所述的还原剂优选为二硫苏糖醇（DTT)或β -巯基乙醇；所 述还原剂终浓度为5-15mmol/L，优选为lOmmol/L ;所述还原温度为25-35°C，优选为30°C ; 所述还原时间为20_40min，优选为30min。
[0021] 步骤（1)或步骤（2)中在正离子模式下进行电离之前先将样品经受甲酸酸化。
[0022] 步骤（1)中用高效液相色谱进行分离的参数优选为：流动相A为0. 1 %甲酸溶液， 流动相8为100%乙腈溶液，色谱柱为(：18反相柱（2.111111^100111111，1.7 4111)，流速为0.31111/ min，柱温为 40°C;洗脱梯度：0 ~25min，2 ~20%B ;25 ~31min，20 ~26%B ;31 ~45min， 26 ~100% B ;45 ~50min，100% B。
[0023] 步骤⑴中用质谱仪进行一级扫描的参数优选是：m/z扫描范围为70-1500,分析 时长4