6min。
[0024] 步骤⑶所述肽段的分子量是比理论值大约IDa的肽段；优选的，所述的肽段的质 核比（m/z)为 514. 00+0· 50。
[0025] 步骤⑷中进行MS/MS碎片分析的参数优选为：质核比扫描范围为70-1500,碰撞 能量为15-23V(优选为18V)，扫描累积时间为1.0 s。
[0026] 本发明采用上述检测方法检测了重组人胰岛素、地特胰岛素以及门冬胰岛素的 主要脱氨产物位点，检测结果发现，上述三种样品的脱氨基处理的总离子流图中均出现质 核比（m/z)为514. 00+0. 50的离子峰，三种样品的未经脱氨基处理的总离子流图中均未 出现质核比（m/z)为514. 00+0. 50的离子峰；二级碎片质谱分析发现，质核比（m/z)为 514. 00+0. 50的离子峰是检测样品中A21位点脱氨基的肽段，证明A21位点为重组人胰岛素 或其类似物的主要脱氨产物位点。
[0027] 由此，本发明进一步提供了一种鉴定重组人胰岛素或其类似物中是否存在A21位 脱氨基产物的方法，该方法包括以下步骤：
[0028] (1)将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用Glu-蛋白内切酶进行酶解， 再用还原剂还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个 小肽段；将分离的各个小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到总离 子流图；
[0029] (2)如果在总离子流图中出现质核比（m/z)为514. 00+0. 50的离子峰，说明待检测 的样品中存在A21位脱氨基的产物。
[0030] 本发明所述的重组人胰岛素或其类似物包括：重组人胰岛素原料药或注射液、赖 脯胰岛素原料药或注射液、门冬胰岛素原料药或注射液、赖谷胰岛素原料药或注射液、地特 胰岛素的原料药或注射液。
[0031] 所述蛋白酶与样品的用量之比为1:3~1:8,优选为1:5 ;所述酶切时间优选为 4_8h，更优选为6h ;所述酶切反应温度优选为30-40°C，更优选为37°C。
[0032] 步骤（1)中进行酶解时所用到的酶解缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液或者HEPES 缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为15-30mmol/L，优选为20mmol/L ;所述HEPES缓冲 液的终浓度为30-70mmol/L，优选为50mmol/L ;所述缓冲液的pH值为7. 0-8. 0,优选为7. 5。
[0033] 步骤（1)中所述的还原剂优选为二硫苏糖醇（DTT)或β -巯基乙醇；所述还原剂 终浓度为5-15mmol/L，优选为lOmmol/L ;所述还原温度为25-35°C，优选为30°C ;所述还原 时间为20_40min，优选为30min。
[0034] 步骤（1)中在正离子模式下进行电离之前先将样品经受甲酸酸化。
[0035] 步骤（1)中用高效液相色谱进行分离的参数优选为：流动相A为0. 1 %甲酸溶液， 流动相8为100%乙腈溶液，色谱柱为(：18反相柱（2.111111^100111111，1.7 4111)，流速为0.31111/ min，柱温为 40°C;洗脱梯度：0 ~25min，2 ~20%B ;25 ~31min，20 ~26%B ;31 ~45min， 26 ~100% B ;45 ~50min，100% B。
[0036] 步骤⑴中用质谱仪进行一级扫描的参数优选是：m/z扫描范围为70-1500,分析 时长46min。
[0037] 本发明根据重组人胰岛素及其类似物的氨基酸序列结构，采用酶切还原法将待测 重组人胰岛素及类似物样品降解为小肽段，再结合LC-MS/MS液质联用技术鉴定重组人胰 岛素或其类似物的主要脱氨产物位点；本发明鉴定方法灵敏度高、重复性好、快速简便，可 有效鉴定待测样品中主要脱氨产物，为重组人胰岛素及其类似物有关物质的定性提供了一 种快速、简便的鉴定方法。
【附图说明】
[0038] 图1重组人胰岛素的一级结构。
[0039] 图2地特胰岛素的一级结构。
[0040] 图3为重组人胰岛素加热脱氨处理前后酶切还原总离子流图对比。
[0041] 图4为地特胰岛素加热脱氨处理前后酶切还原总离子流图对比。
[0042] 图5为门冬胰岛素加热脱氨处理前后酶切还原总离子流图对比。
[0043] 图6为选择反应监测（SRM)扫描模式下选择离子对m/z513. 00、514. 00监测的质 谱图。
[0044] 图7为合成多肽和各加热处理样品离子m/z为514. 00的碎片质谱图。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0046] 实施例1重组人胰岛素主要脱氨产物的鉴定
[0047] 1试验材料和试剂
[0048] 试验材料：重组人胰岛素（购自Sigma公司）。
[0049] 试验试剂：Glu-C蛋白内切酶（序列纯，NEB)、DTT (分析纯，Bio-rad)、甲酸（色谱 纯，Sigma)、乙腈（色谱纯，Merk)。
[0050] 2试验仪器
[0051] 高效液相色谱仪（Agilent 1290)、TSQ Quantum Access MAX 质谱仪（Thermo Scientific)〇
[0052] 3样品的检测前处理
[0053] (1)样品溶液的制备
[0054] 称取0. 025g重组人胰岛素于5ml容量瓶中，加0. 02mol/L的醋酸溶液使样品完全 溶解，并用〇. 〇2mol/L的醋酸稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤。
[0055] (2)样品加热处理
[0056] 取过滤后的溶液Iml于Eppendorf管中，置60°C恒温水浴锅中加热4h，使重组人 胰岛素在酸性条件下大量脱氨，以便富集脱氨产物。
[0057] (3)样品酶解
[0058] 分别取加热处理和未处理的样品各12. 5 μ 1，加入0· 2mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7. 3) 10 μ 1，0. 1% Glu-C蛋白内切酶12. 5 μ 1，再加入65 μ 1超纯水，混匀，置37°C恒温水浴 锅中水浴4h。
[0059] (4)样品还原
[0060] 向酶解后的样品中加入0. lmol/L的DTT溶液12 μ 1，使DTT终浓度为10mmol/L， 30°C孵育30min，再加入2 μ 1磷酸终止反应，混匀即得还原后的样品。
[0061] 4脱氨基肽段的发现
[0062] (1)液质检测
[0063] 还原后的样品取5 μ 1进行液质联用检测。液相条件：流动相A为0. 1 %甲酸溶液， 流动相8为100%乙腈溶液，色谱柱为(：18反相柱（2.111111^100111111，1.7 4111)，流速为0.31111/ min，柱温为 40°C;洗脱梯度：0 ~25min，2 ~20%Β ;25 ~31min，20 ~26%Β ;31 ~45min， 26~100% B ;45~50min，100% B。质谱条件：电喷雾正离子模式（ESI+)进行一级全扫， m/z扫描范围为70-1500,分析时长46min。
[0064] (2)目标母离子的发现
[0065] 质谱全扫图见图3。分析比较加热处理和未加热处理样品的总离子流图，发现加热 处理过的样品在4. 3min多出一个肽段，该肽段离子峰的m/z为514. 10,而肽段III离子峰 (理论肽段）的m/z为513. 10,二者m/z相差1，由于均带1个正电荷，所以相对分子质量也 相差1 ;其余各肽段相对分子质量均与理论值一致，没有明显变化。由此推断4. 3min的肽 段很可能是酸性条件加热后肽段III脱氨基的产物，由于肽段III中含有两个Asn，不能确 定是哪个天冬酰胺脱氨基，因此需要提取4. 3min的母离子峰进行MS/MS碎片分析。酶切还 原后各肽段编号与序列见表1。
[0066] 表1酶切还原后各肽段编号
[0068] (3)目标母离子的二级碎片质谱分析
[0069] 提取m/z为514. 10的母离子进行MS/MS碎片分析。质核比扫描范围为70-1500， 碰撞能量为18V，扫描累积时间为1.0 s。m/z 514. 10离子的二级MS图谱和碎片图谱分别见 图6和图7。分析N-端b系列碎片峰与C-端y系列碎片峰，可以检测到与理论相对分子量 一致的连续b系列碎片峰（除去bl碎片峰，未监测到），同时可以检测到比理论相对分子质 量增加约1的y系列碎片峰，据此可以证明m/z为514. 10的离子为A21位脱氨基的肽段。 数据统计见表2。
[0070] 表2二级碎片质谱分析<