制备 本实验对不同提取溶剂（50%甲醇、甲醇、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇)、不同提取方法 (超声和热回流)和不同提取时间（l/2h、Ih和2h)进行了优化考察。实验结果表明，采用60% 乙醇超声提取Ih作为供试品的制备方法，所得指纹图谱出峰数较多。因此，取元胡止痛滴 丸适量，置于研钵中研成粉末状，称取1.0 OOg药粉，置于IOmL量瓶，加入60%乙醇溶液，超 声lh，冷却，加60%乙醇溶液至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0025] 4、以去氢延胡索甲素为参照峰的标准指纹图谱的制定：精密吸取参照物溶液和 供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，依据所测得的图谱，制定标准指纹图谱。以上述方 法作为待测定元胡止痛滴丸样品中延胡索和白芷中一种或几种成分指纹图谱的测试手段。 将待测定元胡止痛滴丸样品指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，计算相似度，应为0. 90~ 1. 00〇
[0026] 5、方法学考察 1)精密度实验在所述优化后的色谱条件下，分析同一批的供试品溶液，连续进样6 次，记录指纹图谱，以去氢延胡索甲素（附表3和4中峰号13)色谱峰面积为参照，计算出各 共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见附表3、4。实验结果表明，各色谱峰的相对保 留时间及峰面积的比值基本没有明显变化，各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等 于5%的色谱峰的比值基本一致（RSD在5. 0%以下），符合指纹图谱的要求。
[0027] 2)稳定性实验在所述优化后的色谱条件下，分析同一批的供试品溶液，分别在0， 3,6,12, 24h时间间隔下检测指纹图谱，以去氢延胡索甲素（附表5和6中峰号13)的保留时 间和色谱峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见附表5和 6。结果表明，各色谱峰的相对保留时间及峰面积的比值基本没有明显变化，各色谱峰的相 对保留时间和相对峰面积的RSD值均不大于5%，符合指纹图谱的要求。样品溶液在24h内 稳定。
[0028] 3)重复性实验取同一批的样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，检 测指纹峰。以去氢延胡索甲素（附表7和8中峰号13)的保留时间和色谱峰面积为参照，计 算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见附表7和8。结果表明，各色谱峰的 相对保留时间及峰面积的比值基本没有明显变化，各共有峰的相对保留时间和单峰面积占 总峰面积大于或等于5%的色谱峰面积比值基本一致（RSD在5. 0%以下），符合指纹图谱要 求。
[0029] 上述实验以同一批号的元胡止痛滴丸制备供试品溶液，按色谱条件采集指纹图谱 共有30个色谱峰，并以这30个色谱峰的相对保留时间和相对色谱峰面积进行方法学考察。 结果表明，均符合指纹图谱的要求。
[0030] 6、元胡止痛滴丸标准指纹图谱的建立 本发明收集不同批次元胡止痛滴丸样品12批，由甘肃陇神戎发制药有限公司提供，来 源及产地见表1。取上述12批元胡止痛滴丸(编号依次为Sl至S12号)，按供试品溶液制备 方法制备供试品溶液。采用HPLC法对元胡止痛滴丸进行分析，记录各色谱图。
[0031] 上述实验条件下测定所有样品的HPLC色谱图，见图2。对12批样品进行测定，经 比较样品的色谱图和计算相对保留时间，以12号峰去氢延胡索甲素为参照峰，有25个峰确 定为共有指纹峰，详见图3。其中单峰面积超过总峰面积5%的吸收峰有3个，分别为：4、12、 21号峰；计算相对保留时间和相对峰面积，结果如下所示：相对保留时间：4(0. 72±0. 05)， 12(1.00)，21(1.64±0. 10);占总峰面积大于5%共有峰的相对峰面积：4(0. 64±0. 10)， 12 (1.00)，21 (0.58±0. 10)。其中4号峰为药根碱，其与元胡止痛滴丸的药效关系尚不明 确；12号峰为去氢延胡索甲素，是元胡止痛滴丸药效主要活性成分；21号峰为欧前胡素，其 遇热不稳定，易分解；故选择12号峰去氢延胡索甲素为参照物；选择12号峰去氢延胡索甲 素为参照物其优势在于：去氢延胡索甲素是元胡止痛滴丸药效主要活性成分，其单峰面积 超过总峰面积5%，以其为参照物对指纹图谱液相条件方法学进行考察，精密度、稳定性、重 复性均良好，该分析方法具有较高的灵敏度和准确度，该方法稳定可靠。25个峰中1、2、3、 4、5、7、8、10、11、12、14、15号峰来自于延胡索，12号峰为去氢延胡索甲素；6、9、13、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25号峰来自于白芷，21号峰是欧前胡素。
[0032] 以去氢延胡索甲素（12号）色谱峰为内参照峰，计算各共有指纹峰保留时间、峰面 积的相对比值，计算结果见表9、表10。
[0033] 7、相似度评价 用《中药色谱图的指纹图谱评价系统》（2004A)软件计算12批元胡止痛滴丸的相似度， 结果见表11。12批元胡止痛滴丸的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度均大于0. 9,相似度 良好，标准指纹图谱能有效表征其质量，应用本方法有利于全面控制元胡止痛滴丸的质量。
[0034] 实施例2元胡止痛滴丸色谱峰指认及归属 采用液质联用法对元胡止痛滴丸标准指纹图谱中的主要特征峰进行了指认，并结合延 胡索和白芷药材指纹图谱对25个共有峰进行色谱峰归属。
[0035] 1、色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18 (4.6mm X 250mm, 5μηι) ;A 相：乙臆，B 相：冰醋酸调 pH 为 4. 0的0. 4%。乙酸铵溶液；柱温35°C ;进样量10 μ L ;波长245nm ;流速：lmL/min。流动相梯 度见表2。
[0036] 2、Q-TOF 实验条件 本实验使用Bruker质谱仪，正、负两种模式扫描测定，仪器参数如下： 采用电喷雾离子源；V模式；毛细管电压正模式3. 0 kV，负模式2. 5 kV ;锥孔电压30 V ; 离子源温度ll〇°C ;脱溶剂气温度350°C ;脱溶剂氮气流量600 L/h ;锥孔气流量50 L/h ;检 测器电压正模式1900 V，负模式2000 V ;采样频率0.1 s，间隔0.02 s ;质量数检测范围50 ~ 1500 Da ;柱后分流，分流比为1:5 ;内参校准液采用甲酸。
[0037] 3、供试品溶液的制备 元胡止痛滴丸溶液的制备：准确称取元胡止痛滴丸lg，精密称定，置于10 mL量瓶中， 加入适量60%乙醇，超声I h，冷却至室温后稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得。
[0038] 药材溶液的制备：取醋制延胡索5. 0g、白芷2. 5 g，分别置于两个50 mL圆底烧瓶 中，精密加入60%乙醇30 mL，精密称定，加热回流3 h，冷却至室温，用60%乙醇补足减失的 重量，摇匀滤过，取续滤液，即得延胡索药材溶液及白芷药材溶液。
[0039] 4、试验结果 元胡止痛滴丸指纹图谱中25个共有色谱峰归属实验表明，12个色谱峰来源于醋延胡 索药材，13个色谱峰归属于白芷药材，通过液质联用从元胡止痛滴丸中指认出20个化合 物，有助于全面明确样品的化学信息，能同时对多种成分进行定量分析，可进一步对元胡止 痛滴丸的质量进行控制，结果见图4、图5及表12。
【主权项】
1. 一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：该方法是采用去氢延胡索甲素为 参照物，共有峰有25个的高效液相色谱标准指纹图谱的质量控制方法。2. 如权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：所述标准指 纹图谱的测定方法，包括如下步骤： (1) 色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙 腈，流动相B为冰醋酸调pH为3. 0~4. 5的0. 4%。乙酸铵溶液；检测波长为210~400nm; 柱温：20 ~40°C;流速：0· 5 ~1. 5mL/min;进样量：10yL; (2) 参照物溶液的制备：取去氢延胡索甲素对照品适量，加甲醇配制成浓度为0.lmg/ ml溶液，摇匀，即得参照物溶液； (3) 供试品溶液的制备：取研细后的元胡止痛滴丸lg，置于10mL量瓶中，加入适量60% 乙醇，超声lh使溶解，冷却，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液； (4) 以去氢延胡索甲素为参照物的标准指纹图谱的制定：精密吸取参照物溶液和供试 品溶液，分别注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，依据所测得的图谱，制定元胡 止痛滴丸标准指纹图谱； (5) 将元胡止痛滴丸待测产品指纹图谱与所述标准指纹图谱进行比较，当相似度为 0. 90~1. 00时待测产品合格。3. 根据权利要求2中所述的一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：所述色 谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动 相B为冰醋酸调pH为4. 0的0. 4%。乙酸铵溶液；检测波长为245nm;柱温：35°C;流速：lmL/ min;进样量：10μL。4. 根据权利要求2中所述的一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：所述梯 度洗脱程序按如下，其中流动相比例均为体积百分比：〇~30min，流动相Α为10~25%， 流动相B为90%~75% ;30~40min，流动相A为25%，流动相B为75 ;40~75min，流动相 A为25%~80%，流动相B为75%~20% ;75~80min，流动相A为80%~100%，流动相B为 20% ~0%。5. 如权利要求2所述的一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：所述标准指 纹图谱中的1、2、3、4、5、7、8、10、11、12、14、15号峰来自于延胡索，12号峰为去氢延胡索甲 素；6、9、13、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25号峰来自于白芷，21号峰是欧前胡素。
【专利摘要】一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，是采用去氢延胡索甲素为参照物，共有峰有25个的高效液相色谱标准指纹图谱的质量控制方法。该指纹图谱的测定：色谱柱：Diamonsil？C18（4.6？mm×250mm，5μm），采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为用冰醋酸调pH为3.5的0.4‰乙酸铵溶液，检测波长：245？nm，柱温：35℃；流速：1.0mL/min。采用本发明的测定方法，能有效的控制元胡止痛滴丸的内在质量，方法具有精密度、稳定性、重复性高的特点，确保产品质量的稳定一致，从而保证产品的安全有效<b>。</b>
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105319300
【申请号】CN201510880850
【发明人】张喜民, 张铁军, 任一杰, 许浚, 邓月婷, 魏晋君, 贾继禧, 张政
【申请人】甘肃陇神戎发药业股份有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年12月3日