一种定量分析壳聚糖的共振瑞利散射法
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测技术领域，更具体地，设及一种定量分析壳聚糖的共振瑞利散射 法。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖(CTS)是甲壳素脱乙酷基产物，其化学名称为聚葡萄糖胺（1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是自然界含量仅次于纤维素的第二大天然有机高分子化合物。它是甲壳类 (邮、蟹）动物、昆虫的外骨骼的主要成分。壳聚糖及其衍生物是重要的生物活性物质，具有 抗肿瘤，抗凝血，减肥降脂和增强免疫力等功能，可作为医药保健品、食品、化妆品等的添加 剂及制备人造皮肤和手术缝合线等的重要原料。因此，壳聚糖在生物医学，环境卫生和食品 等领域都有着广阔的应用前景。
[0003] 随着壳聚糖广泛应用，壳聚糖的准确定量显得十分重要。目前，国内外用于壳聚糖 定量分析的方法主要集中在分光光度法和巧光法。目前，光谱法测定壳聚糖普遍忽略了壳 聚糖作为高分子天然产物，其分子量从几千到百万不等，当样品中壳聚糖分子量与标准品 差异较大时，可能会产生一定的系统误差，影响准确测定。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供活性红4在作为定量分析壳聚糖的探 针中的应用。
[000引本发明的另一个目的是提供一种W活性红4为探针的定量分析壳聚糖的方法。
[0006] 本发明的再一个目的是提供一种定量分析壳聚糖的共振瑞利散射法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明是通过W下方案予W实现的： 本发明首先研究了弱酸环境下活性红4与壳聚糖缔合后的光谱特征，及其在壳聚糖定 量分析中的应用。结果表明在弱酸性B-R缓冲体系中，活性红4与壳聚糖的离子缔合物于λ= 342nm处产生强烈的共振瑞利散射特征峰，共振瑞利散射强度与壳聚糖浓度C呈良好线性关 系，在0.050 ~6.00yg/mL 的浓度范围内，线性方程为：ΔΙ = 682.31C+ 114.95(c，yg/mL)， R2=0.9991，检测限0.03化g/mL。据此，本发明要求保护活性红4在作为定量分析壳聚糖的探 针中的应用。
[0008] 另外，本发明还保护一种W活性红4为探针的定量分析壳聚糖的方法。
[0009] -种定量分析壳聚糖的共振瑞利散射法，包括W下步骤： 标准曲线的绘制:配置η个成梯度浓度的壳聚糖溶液和1个空白试剂，向η个成梯度浓度 的壳聚糖溶液和1个空白试剂中分别加入2倍体积的B-R缓冲溶液，然后再分别加入等体积 的活性红4溶液，混合均匀后得到稀释后的成浓度梯度的壳聚糖待测溶液，静置，检测壳聚 糖待测溶液的共振瑞利散射强度，具体为Κλθχ=λθπι进行同步扫描，记录RRS光谱，并于 342nm处分别测量离子缔合物的Irr沸试剂空白的1〇,绘制标准曲线，进一步得线性方程：Δ I = 682.31C+ 114.95(c，yg/mL) 式中 Δ I = Irrs-Io; 样品检测：向经过初步处理后的待测样品的上清液中，加入2倍体积的B-R缓冲溶液，然 后再加入等体积的活性红4溶液，混合均匀后静置，检测共振瑞利散射强度，由上述线性方 程计算出待测样品中壳聚糖的浓度。 优选地，所述静置的时间为120分钟W内。
[0010] 优选地，所述棘性红4溶液的浓度化.00乂1〇-4111〇1/1，8-1?缓冲溶液的抑为5.5。
[0011] 优选地，待测样品初步处理的步骤如下:将待测样品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解， 待完全溶解后离屯、，得上清液，上清液稀释后用于巧光巧灭检测。
[0012] 更优选地，一种定量分析壳聚糖的共振瑞利散射法，包括W下步骤： 标准曲线的绘制:在一系列10.OOmL的比色管中，按先后顺序分别加入ImL浓度分别为 0.5、1、3、5、10、20、30、40、50、60yg/mL的壳聚糖溶液，P册.50的B-R缓冲液缓冲液2. OOmL， 1.00 X l(T4mol/L活性红4操作液1 .OOmL，W蒸馈水稀释至刻度线，摇匀得到浓度分别为 0.05、0.10、0.30、0. 50、1.00、2. 00、3.00、4, 00、5.00、6.00yg/mL的壳聚糖待测溶液，静 置15~120分钟，WAex=Aem进行同步扫描，记录RRS光谱，并于34化m处分别测量离子缔合 物的Irrs和试剂空白的1〇,绘制标准曲线，进一步得线性方程：ΔΙ = 682.31C+ 114.95(c，y g/mL) 式中 Δ I = Irrs-Io; 样品检测：将〇.4g待测样品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至lOOmL，待完全溶解后 离屯、，取2.5mL上清液，并定容至lOOmL，作为样品操作液，取1血样品操作液，加入2mL的抑为 5.5的B-R缓冲溶液，再加入1血的1.00 X l〇-4mol/L活性红4溶液，用水定容至10血，混合均匀 后，静置15~120分钟，检测共振瑞利散射强度，由线性方程计算出待测样品中壳聚糖的浓 度。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明首次研究了弱酸环境下活性红4与壳聚糖缔合后的光谱特征，及其在壳聚糖定 量分析中的应用。研究结果显示，在弱酸性B-R缓冲体系中，活性红4与壳聚糖的离子缔合物 于λ=342ηπι处产生强烈的共振瑞利散射特征峰，共振瑞利散射强度与壳聚糖浓度C呈良好线 性关系，在0.050~6.00yg/mL的浓度范围内，线性方程为：ΔΙ = 682.31C+ 114.95(c，yg/ mL)，R2=0.9991，检测限0.03化g/mL。据此本发明利用壳聚糖与活性红4的结合，建立了分析 壳聚糖的共振瑞利散射，该方法具有操作简单，快速，准确，灵敏度高等特点。
【附图说明】
[0013] 图1为紫外吸收光谱、巧光光谱W及共振瑞利散射光谱。
[0014] 图2为不同浓度壳聚糖的共振瑞利散射图谱；1.壳聚糖（2.Oyg /mL);2.活性红4 (1.0Xl〇-5mol/L); 3~7.活性红4 (1.0Xl〇-5mol/L)-壳聚糖（1.0，2.0，3.0，4.0， 5.化g /mL)复合物。
[001引图3为活性红浓度的影响。
[0016] 图4为缓冲溶液用量的影响。
[0017] 图5为低、中、高分子量壳聚糖的标准曲线W及模拟样品曲线；（)低分子量；（?) 中分子量;（▲)高分子量;（▼)中分子量模拟样品。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0019] 壳聚糖（CTS)标准（20°C时，1%溶解在1%醋酸溶液中）：低分子量为< 200 mPa. S;中分子量为200~400mPa. S;高分子量为400~lOOOmPa. S。壳聚糖(CTS)标准溶液:配 置方法为准确称取0.0400g壳聚糖溶于0.5mol/L醋酸溶液中，于容量瓶定容至lOOmL，得到 浓度为400.化g/mL的标准胆备液;吸取储备液2.50mL于100 mL的容量瓶中，W水定容到刻 度，得到10.0化g/mL的壳聚糖标准溶液，现配现用。
[0020] 活性红4操作液（1.00 X l〇-4mol/L):精密称取0.0250g活性红4(Sigma公司）染料， 用水溶解，于250mL容量瓶中定容，摇匀，备用。
[0021 ] Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液：由0.04mol/L 混合酸[(2.71mL正憐酸 + 2.36mL冰乙酸+2.47g棚酸)/L]与0.2mol/L NaOH溶液按不同比例配制而成。
[0022] 实施例1 一、光谱分析:在lOmL的比色管中，加入ImL壳聚糖标准溶液