梯度栗，脱气装置，微量进样栗，脉冲电子检测器 (1.0mm直径的金工作电极和Dionex pH-Ag/AgCl参考电极，电池体作为返电极）以脉冲电流 测定模式工作(PAD)。
[0048] 检测器程序:波形选择标准糖四电位波形。
[0049] 进样量:10yL。
[0050] 称量天平:感量为lmg，恒温振荡水浴箱，高速冷冻离心机。
[00511洗脱液的制备：
[0052] A为超纯水
[0053] 准备3000mL超纯水，使用溶剂过滤器配合0.22μπι PES滤纸抽滤二次，转移1500mL 已抽滤的超纯水至淋洗瓶A中备用。完成后连接色谱仪，通入氦气后轻柔摇匀。
[0054] B为250mmol/L氢氧化钠溶液
[0055] 转移1400mL已抽滤的超纯水至淋洗瓶B中，吸取19.5mL 50%氢氧化钠溶液到 1400mL已抽滤的超纯水中，再使用已抽滤的超纯水定容到1500mL。完成后连接色谱仪，通入 氦气后轻柔摇匀。
[0056] C为1. Omol/L醋酸钠溶液+100mmol/L氢氧化钠溶液
[0057] 准备500mL超纯水至淋洗瓶C中，称取49.2 ±0.0 lg醋酸钠到500mL超纯水中定容到 600mL，超声lOmin使醋酸钠完全溶解，使用溶剂过滤器配合0.22μπι PES滤纸抽滤二次。抽滤 完成后吸取3.12mL 50%氢氧化钠溶液到该淋洗瓶中，完成后连接色谱仪，通入氦气后轻柔 摇匀。
[0058] D为100mmol/L醋酸钠溶液
[0059] 准备500mL超纯水至淋洗瓶D中，称取4.92±0.Olg醋酸钠到500mL超纯水中定容到 600mL，超声lOmin使醋酸钠完全溶解，使用溶剂过滤器配合0.22μπι PES滤纸抽滤二次。完成 后连接色谱仪，通入氦气后轻柔摇匀。
[0060] 低聚半乳糖标准工作液的制备：
[0061] 对某品牌液态奶中的低聚半乳糖含量进行检测，已知其低聚半乳糖含量的标识值 为 0.5%〇
[0062]选择与待测样品中添加的低聚半乳糖的品牌号相同的低聚半乳糖原料作为标准 物质。精密称取含有〇.5g有效低聚半乳糖成分的低聚半乳糖原料，加水溶解至500mL容量 瓶，定容至刻度，此为含低聚半乳糖l〇〇〇mg/L的储备液。
[0063] 精密量取储备液1.25mL、2.5mL、3.75mL、5. OmL、7.5mL，分别移至25mL容量瓶，加水 定容至刻度，分别配成低聚半乳糖浓度为SOmg/UlOOmg/LUSOmg/LdOOmg/LdOOmg/ija# 准工作液。
[0064]精密称取两份样品，每份样品的质量均为1.0g(精确至O.OOOlg)，分别置于10mL容 量瓶中，一份加水3mL，振摇使溶解，作为样品液，标记为A，另一份再加入低聚半乳糖有效质 量为0.003g的低聚半乳糖原料，加水使其体积达到3mL，作为加标液，标记为B。
[0005 ]向A和B中均加乙腈定容至1 OmL，振摇使均勾。
[0066]完成定容后，A和B移至离心管，进行高速离心。离心机条件:温度为25摄氏度，转速 为9000rpm，持续时间为10分钟。
[0067] 完成离心后，取A和B上清液4mL，加水稀释至10mL，摇匀，过0.22μπι PES滤膜，取滤 液备用。
[0068] 将收集到的Α和Β的滤液分别进样至离子色谱仪中，后再按高至低浓度将低聚半乳 糖标准工作液进样至离子色谱仪中进行梯度洗脱，得到样品液、加标液和工作液的色谱图。
[0069] 将样品液和加标液的色谱图进行对比，保留时间和峰形相同且所述加标液的峰面 积大于所述样品液的峰面积的色谱峰为特异峰。
[0070] 测得不同浓度的工作液在特异峰处的峰面积，以峰面积为纵坐标，以工作液的浓 度为横坐标，拟合得到标准曲线。
[0071] 测得样品液中特异峰的峰面积，找出在标准曲线上对应的浓度，得到样品液中低 聚半乳糖的浓度，经换算即得液态奶中低聚半乳糖含量。
[0072]所述换算具体为：
[0073] 液态奶中?氐聚半乳糖含量（％ ) - nCV xlOO%，式中，η为样品液到样 1000m 品液稀释的倍数;C为样品液中低聚半乳糖的浓度，单位为mg/mL;V为样品液的体积，单位为 mL; m为所述样品的的质量，单位为g。
[0074]当存在1个以上的特异峰时，分别测得工作液在每个特异峰处的标准曲线，后根据 样品液中相应特异峰的峰面积，一一找出相应标准曲线上对应的浓度，取所有浓度的平均 值作为样品液中低聚半乳糖的浓度。
[0075]在梯度洗脱的步骤中，其梯度洗脱的具体条件为：
[n07Ai
[0077] 所用离子色谱仪的分析柱为3mmX 150mm Dionex CarboPac ΡΑ20,保护柱为3mmX 30mm Dionex CarboPac PA20。
[0078] 柱温控制在30°C。
[0079] 检测结果：
[0080] 如图1所示，线1为样品液的色谱图，线2为加标液的色谱图，两者对比后，选择1-1， 2-2，2-3，4-4这4组峰为特异峰组，将其用作定量计算。
[0081] 如图2所示，不同浓度的标准曲线工作液在选出的4个峰位处具有相应的色谱峰， 且峰面积随着浓度的升高而增大。利用软件，以工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分 别拟合得到4组峰处工作液的标准曲线，如表1所示。
[0082] 表1 4组峰处分别拟合得到的标准曲线
[00的1
[0084]根据得到的不同峰处的标准曲线以及图1中样品液的色谱图在相应特异峰处的峰 面积，得到样品液中低聚半乳糖的浓度。如表2所示。再根据换算公式得到液态奶中低聚半 乳糖的含量。
[0085]表2样品液中低聚半乳糖的浓度 [00861
[0087]此外，本发明还验证了该方法的准确性和精确性，对某品牌奶中低聚半乳糖含量 进行重复性检测。其检测结果如表3所示。
[0088] 表3重复性检测的对比结果
[0089]
[(
[0091]尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1. 液态奶中低聚半乳糖含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 采用与样品中添加的低聚半乳糖的品牌号相同的低聚半乳糖作为标准物，配制成 不同浓度的标准工作液； (2) 称取两份相同质量的样品，一份加入所述标准物，加水溶解后配成加标液，另一份 直接加水配成相同体积的样品液，将所述加标液和所述样品液经预处理后连同所述工作液 依次加至离子色谱仪中进行梯度洗脱，并分别得到色谱图； (3) 将所述加标液和所述样品液的色谱图进行对比后筛选出用于定量的特异峰，拟合 得到所述工作液的标准曲线，再根据样品液色谱图中特异峰的峰面积找出所述标准曲线上 对应的浓度，得到液态奶中低聚半乳糖含量。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述梯度洗脱的步骤中， 所用的流动相包括超纯水、250-260mmol/L NaOH溶液、1.0-1.2mol/LCH3⑶ONa溶液加100-120mmol/L NaOH溶液组成的混合溶液和100-120mmol/L CH3C00Na溶液。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述梯度洗脱的步骤中， 洗脱时间为60~65min，流动相的流速为0.40~0.45mL/min，且所述超纯水的体积分数为0-58%，所述NaOH溶液的体积分数为0-100%，所述混合溶液的体积分数为0-100%，所述 CH3C00Na溶液的体积分数为0-45 %。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离子色谱仪的分析柱 S3mmX150mmDionexCa;rboPacPA20，{：^#|iS3mmX30mmDionexCa;rboPacPA20。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述分析柱的柱温为30-35°C。6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预处理的步骤具体包 括： 加入相同体积的乙腈，混匀后经高速离心获得上清液，依次取相同体积的所述加标液 和所述样品液的上清液，加入等量水稀释后再过滤，收集滤液。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述高速离心的步骤中，离心温度为 25-28°C，转速为9000-10000rpm，且离心时间为10-13分钟。8. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述过滤的步骤具体包括： 将稀释后的上清液依次通过〇. 22μπι的PES滤膜。9. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，当存在1个以上的特异峰 时，分别测得所述工作液在每个特异峰处的标准曲线，后根据所述样品液中相应特异峰的 峰面积，一一找出相应标准曲线上对应的浓度，取所有浓度的平均值作为所述样品液中低 聚半乳糖的浓度。10. 根据权利要求1~9任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述将所述加 标液和所述样品液的色谱图进行对比后筛选出用于定量的特异峰的步骤具体包括： 将所述加标液和所述样品液的色谱图进行对比，选择保留时间和峰形相同且所述加标 液的峰面积大于所述样品液的峰面积的色谱峰作为定量的特异峰。
【专利摘要】本发明提供了一种液态奶中低聚半乳糖含量的检测方法，采用与样品中添加的低聚半乳糖的品牌号相同的低聚半乳糖作为标准物，配制成不同浓度的标准工作液；称取两份相同质量的样品，一份加入标准物，加水溶解后配成加标液，另一份直接加水配成相同体积的样品液，经预处理得到加标液和样品液；将加标液和样品液连同工作液依次加至离子色谱仪中进行梯度洗脱，得到加标液、样品液和工作液的色谱图；将加标液和样品液的色谱图进行对比后筛选出用于定量的特异峰，根据特异峰进行定量计算，得到液态奶中低聚半乳糖含量。该检测方法步骤简单，无需复杂操作，最大程度减少了不确定因素带来的误差。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/88
【公开号】CN105548403
【申请号】CN201610025124
【发明人】叶满香, 谭永成
【申请人】云浮市新金山生物科技有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月13日