ephadex G-25除盐柱去掉游离荧 光，标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育，个例样本用于血清/唾液芯片的点制。
[0029] (3)凝集素芯片和数据分析 凝集素芯片的制备，Cy3荧光标记的样本蛋白与凝集素芯片的孵育步骤及凝集素芯片 数据获取与归一化分析与专利申请号为201110021447.3发明专利描述的凝集素芯片和数 据分析过程一致。
[0030] (4)血清/唾液芯片的制备和数据分析 参见图3，血清/唾液芯片由个例血清/唾液样本点制而成，样本根据HC、cHB、ACHBLF患 者分成三组，各20例，Cy3标记的凝集素用以检测这些血清/唾液样本中凝集素特异识别的 糖链结构表达水平。血清/唾液蛋白溶于点样缓冲液（0.5 mg/mL BSA溶于1XPBS，pH 7.4)中至终浓度1 mg/mL，并用芯片点样仪点制于环氧化修饰的玻片上。血清/唾液芯片的 布局图显示在图3中A部分。每个样本区内重复三次，每张片基三个重复区。点好的片基在 50%湿度中孵育过夜，然后37 °C真空干燥3 h固定，固定好的芯片可4 °C避光密封保存备 用。芯片首先在封闭缓冲液中常温封闭lh，1 X PBST和1 X roS各清洗两次，每次5min，离心甩 干。后加入配好的含Cy3标记凝集素的孵育缓冲液，在芯片杂交箱内4 rpm缓慢旋转3h，IX PBST和IX PBS各清洗两次，每次lOmin，离心甩干。通过芯片扫描仪设置光电倍增管70%和激 光强度100%，在532 nm波长处扫描芯片图像。图像经Genepix 3.0软件分析获取原始数据。 原始数据中小于两倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本九个重复点的有效值再 取平均值(AS)，每组平均值表示为组内每个样本平均值(AS)的均值(AG) 土标准偏差(SDG)。 任意两组或多组间借助SPSS statistics 19软件进行t检验或单方面方差分析(one-way AN0VA)寻找显著差异，参见图3中A和B部分。
[0031]结果分析 重型乙肝、慢乙肝及健康志愿者血清糖蛋白糖链谱的变化 利用凝集素芯片分别对健康志愿者、慢乙肝、重型乙肝血清样本进行检测，通过专业软 件获取芯片数据并归一化处理后，首先将两组肝病结果与健康组结果进行比较，即每个凝 集素对应的归一化后NFI在ACHBLF、cHB分别比HC得到Fold-change值，我们将Fold-change > 2和Fold-change〈 0.5作为肝病患者相较于健康人在血清中上调和下调表达的糖链。 [0032] 结果发现，有26种凝集素识别的糖链在HC，cHB，ACHBLF患者血清中差异表达(表3 和图 1B)。其中WFA识别的terminating in GalNAca/01-3/6Gal，GSL-II和GSL-I识别的the GlcNAc and aGal, PTL-II识别的the Gal，PWM识别的 the branched (LacNAc)n,和BPL 识别的 the Gal01_3GalNAc, Terminal GalNAc 糖链结构在ACHBLF患者血清中较HC，cHB 中高表达（all fold change > 2，p = 0.005)(图1)。
[0033] 其中，12种凝集素（如：MAL-II，PTL-I，SJA，PNA，and AAL)识别的糖链在 ACHBLF患者血清中较HC高表达，3种凝集素(EEL, LTL，and ACA)识别的糖链在ACHBLF患者 血清中较HC低表达，但是BS-I识别的 the α-Gal, α-GalNAc, Gala-1，3Gal, Gala-1, 6Glc, UEA-I识别的the Fucal-2Gaim-4Glc(NAc)糖链在ACHBLF患者血清中较cHB中低表 达，其他凝集素在ACHBLF与cHB患者血清中表达无显著差异。
[0034] 除此之外，MPL 识别的the GalP-l，4GlcNAc (type II)，GalPl_3GlcNAc (type I) binder ECA, the Gal01_3GalNAc, GalNAc, DBA识别的the aGalNAc, Tn antigen, GalNAcal-3(Fucal-2)Gal,和NPA识别的 the High-Mannose, Manal-6Man 糖链在ACHBLF 患者血清中较cHB显著高表达，而这些糖链在ACHBLF和HC血清中表达无显著差异。
[0035]重型乙肝、慢乙肝及健康志愿者血清糖蛋白糖链谱之间的比较 通过对ACHBLF、cHB及HC血清凝集素芯片结果比较，发现10种凝集素(如:ECA，WFA，GSL-II，MPL)识别的糖链在ACHBLF患者血清中表达水平显著高于cHB患者，而BS-I和UEA-I识别 的糖链在ACHBLF患者血清中的表达水平显著低于cHB患者，20种凝集素（如:WFA，GSL-II， MAL-II，PTL-I)识别的糖链在ACHBLF患者血清中较HC中差异性表达。
[0036]表3重型乙型肝炎，慢乙肝患者血清糖蛋白糖链谱的表达
aSignal intensities obtained for 9 repeated blocks in three repeated slides were normalized and averaged, and the ratios of ACHBLF vs.HC, cHB (ACHBLF /HC AND ACHBLF /cHB) were calculated. HC: healthy control; cHB: HBV-infected patients with chronic liver diseases; ACHBLF: acute-on-chronic hepatitis B liver failure b/， negative signal;--，no significant difference;氺P〈0.05;氺氺P〈0.01; _P〈0.001〇
[0037] 乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液糖蛋白糖链谱的变化 利用凝集素芯片分别对HC、cHB、ACHBLF患者唾液样本进行检测，通过专业软件获取芯 片数据并归一化处理后，首先将两组肝病结果与健康组结果进行比较，即每个凝集素对应 的归一化后NFI在ACHBLF、cHB分别比HC得到Fold-change值。我们认为Fold-change > 2和 Fold-change〈 0.5为肝病患者相较于健康人在血清中上调和下调表达的糖链。（图2) 结果发现，有16种凝集素识别的糖链在HC，cHB，ACHBLF患者唾液中差异表达(表4和图 2)。其中GSL-I识别的ctGalNAc，aGal，anti-A and B，STL识别的trimers and tetramers of GlcNAc， core (GlcNAc) of N-glycan, oligosaccharide containing GlcNAc and MurNAc，ConA识别的High-Mannose，Manal-6(Manal_3)Man，terminal GlcNAc等糖链在 八(：冊1^和〇冊患者中差异性高表达，而扣〇&1111识别的63101-3631财〇(1-56以11^(1')， GalNAca-Ser/Thr(Τη), GlcNAcPl-3-GalNAca-Ser/Thr(Core3), sialyl-T(ST). not bind to Core2，Core6，and sialyl-Tn (STn)，WFA识别的terminating in GalNAcct/β l-3/6Gal等糖链只在ACHBLF患者中差异性高表达。
[0038] 表4重型乙型肝炎，慢乙肝患者唾液糖蛋白糖链谱的表达
aSignal intensities obtained for 9 repeated blocks in three repeated slides were normalized and averaged, and the ratios of ACHBLF vs.HC, cHB (ACHBLF /HC AND ACHBLF /cHB) were calculated. HC: healthy control; cHB: HBV-infected patients with chronic liver diseases; ACHBLF: acute-on-chronic hepatitis B liver failure b/， negative signal;--，no significant difference;氺P〈0.05;氺氺P〈0.01; _P〈0.001〇
[0039]凝集素探针组确定 通过上述结果分析得到凝集素探针筛选血清的结果，指标参见表5。
本发明凝集素探针筛选唾液的结果，指标参见表6。 [0041]表 6
本发明凝集素探针筛选血清和唾液共有的结果，指标参见表7。
[0042] 表 7
凝集素芯片结果验证 为进一步验证凝集素芯片的结果，验证凝集素探针与HC、cHB、ACHBLF患者血清样本中 识别糖链的结合。以凝集素 WFA为例，将Cy3荧光标记的WFA与转膜后的血清蛋白或者点制好 的血清芯片孵育，经扫描仪扫描(见图3B)和Genepix 3.0软件分析，根据1.6所述方法对原 始数据深入分析。结果显示，WFA与20例cHB，20例ACHBLF患者血清样本中识别糖链的结合强 度明显高于健康人血清样本的结合(见图3A和3B)，经student t-test发现P值小于0.05。 其余凝集素探针验证方法参照此方法，结果均显示与凝集素芯片结果一致。证明这些凝集 素可以作为探针通过对血清中的糖蛋白糖链的检测鉴别肝系列病。
[0043] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种基于血清糖结合蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组， 其特征在于：所述测试凝集素探针组至少包括PTL-I、PNA、AAL、LTL、STL、BS-I、PTL- II、 SBA、ACA、UEA-I、MAL-I、PHA-E+L。2. 根据权利要求1所述基于血清糖结合蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，其特征在 于:所述测试凝集素探针组还包括WFA、GSL- II、MAL- II、SJA、EEL、LEL、PWM、BPL。3. -种共同基于血清和唾液中糖蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素 探针组，其特征在于:所述测试凝集素探针组至少包括STL、SBA、ACA、WFA、GSL-II。4. 一种权利要求1-2所述凝集素芯片在检测血清中糖蛋白检测糖链标志物的应用。5. -种权利要求3所述凝集素芯片在共同检测血清和唾液中糖蛋白检测糖链标志物的 应用。6. -种含有权利要求1或2或3所述凝集素探针组的试剂盒。
【专利摘要】一种基于血清或唾液蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片和试剂盒及其应用，涉及一种用于血清或唾液中检测糖链标志物的凝集素芯片，具体涉及一种基于血清和唾液中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其应用。目的在于提供一种非损伤，通过鉴别唾液或血清中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法。本发明提供一种基于血清糖结合蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，测试凝集素探针组至少包括PTL-I、PNA、AAL、LTL、STL、BS-I、PTL-II、SBA、ACA、UEA-I、MAL-I、PHA-E+L。该凝集素芯片可以快速检测出血清和唾液样品中特有的糖蛋白糖链结构，可以迅速判断出样品中糖链的特异性结合，确定对应的人群是否患有肝炎，并确定是否为ACHBLF患者。
【IPC分类】G01N33/96, G01N33/68
【公开号】CN105675893
【申请号】CN201610123811
【发明人】李铮, 钟耀刚, 张甲戌, 刘夏薇, 张志伟, 秦鑫敏, 舒健
【申请人】西北大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月4日