30天后用刀片切下整片处理叶片，立即置于液氮中保存待用。
[0054]将上述处理过的叶片转移至冷冻干燥机中，于-80°C下冷冻干燥72h;
[0055]4、y_XRF 原位分析
[0056]冷冻干燥后的叶片样品的μ-XRF原位分析可在上海光源、美国阿贡实验室、斯坦福大学加速器等同步辐射实验站进行。本实施例以美国能源部斯坦福大学加速器(SSRL)线站2_3为例说明相关实验参数。
[0057]斯坦福正电子加速储存环(SPEAR)中的电子能量为3.0GeV，束流强度90?10mA，光谱亮度1父1012?110切118/8/1111112/11^(12/0.1%81;利用带有谐波抑制的3丨(220)双晶单色仪使得入射光为单色光，利用Kirkpatrick-Baez显微镜聚集光斑，光斑大小为2μηι，样品打点角度为45°，利用单通道涡流Si检测仪检测荧光信号。
[0058]选取处理叶片上的扫描区域B，如图1所示，将扫描光斑步长设为5μπι，每点的扫描时间为200ms。线站可保存每一个像素点的完整XRF光谱数据，通过扫描感兴趣区域的XRF光谱即可获得该区域不同位点的元素分布信息，区域B如图3所示。
[0059]作为对照，由图2可见，没有经过稳定性同位素68Zn标记液处理的叶片几乎没有锌元素(白色点)；由图3可见，白色虚线框为区域A，经过30天处理后该区域A有大量锌(白色点)积累，并逐渐向四周未标记区域B扩散。
[0060]进行数据分析:植物样品中P、S、C1、41"、1(、03、]\111、？6、(]11和211的特征峰均可通过4-XRF微探针检测到，根据特征峰峰值大小可计算出各个元素的相对含量，通过与标准样品的比对，即可获得各个位点不同元素的绝对含量。
[0061 ]成像图谱米用SMAK(http://www-ssrl.slac.Stanford.edu/?swebb/smak.htm)等软件处理，对图3所选的区域B进一步细扫，由图4可见，μ-XRF图像原位呈现了锌(白色点)通过韧皮部迀移转运到其他部位的过程。
[0062]对图4所选区域进行进一步细扫(如图5)，扫描光斑步长设为Ιμπι，每点的扫描时间为200ms;由图5可见，锌和钙呈点状分布于韧皮部中；
[0063]将扫描获得的叶片中锌高分辨二维图像与显微组织图片进行对比分析，获得锌在稳定性同位素锌肥标记叶片中的原位分布特点。
[0064]5、LA-1CPMS 验证分析
[0065]将上述获得的冷冻干燥叶片样品带往北京国家地质测试中心进行LA-1CPMS定量分析。
[0066]LA系统采用Nd: YAG激光器(波长213nm，重复频率1Hz，激光参数设置为40 % )，扫描光斑直径为5μηι。
[0067]植物叶片样品固定于样品台上，置于样品室内；聚焦激光束按行扫描样品，行与行之间的间隔设置为ΙΟμπι，灼烧后的样品物质由载气氦气和氢气混合气体送入ICP检测离子强度。为了校正水分流失及样品厚度对ICP的影响，需要同时检测13C的离子强度，将13C作为内标元素；用Ba和Rh标准样品最优化ICP-MS参数，并选取美国标准与技术研究院(NIST)的标准参比物作为参比物质。
[0068]将上述获得的μ-XRF数据和LA-1CPMS数据进行归一化、标准定量化，比较分析两种金属组分布分析技术获得的数据，通过两种方法相互印证，优势互补，获得稳定性同位素同位素68Zn标记液标记叶片中锌元素的二维定量分布图(如图6)。
[0069]实施例2
[0070]1、溶液配制
[0071]与实施例1中所述一致。
[0072]2、标记同位素68Zn标记液
[0073]与实施例1不同之处在于，将配置好的稳定性同位素68Zn标记液转移至50mL离心管中，将所选待标记叶片浸泡于上述溶液中，如图7所示，特定区域为区域C，注意将与叶柄连结处的叶片组织露出液面2cm左右，固定好后将离心管放置于试管架上进行稳定性同位素68Zn标记液标记处理。
[0074]3、样品制备
[0075]上述实验植株处理48h后，轻轻取出待标记叶片，让吸附于叶片表面的同位素68Zn标记液自然风干，一个月后，用刀片割下待标记叶片连结的叶柄与新生的新叶，小心割开包裹在叶柄表面的Telflon膜，用超纯水冲洗干净待标记叶片，用吸水纸轻轻吸干备用；
[0076](I)制备切片样品用于μ-XRF原位分析和LA-1CPMS验证分析
[0077]切取待标记叶片连结的叶柄中部厚度约2_的一小段组织，置于涂有OCT包埋剂的切片机样品托上，并放入-20 0C的冷冻切片机(LEICA，CM1850)中速冻，待包埋剂逐渐凝固时再缓慢添加一层OCT包埋剂，反复多次直至样品完全浸入包埋剂中。
[0078]将样品托和冷冻包埋好的植物组织夹紧于切片机样品头上，调整好样品头和刀片的角度与距离，使样品表面与刀锋平行，调整好防卷板，以切出完整、平滑的切片为准，并将切片厚度设置为ΙΟΟμπι。
[0079]转动手轮进行切片，随后从中选取质量较好的切片，转移至含有Kapton胶带的特制塑料框中，注意压实切片使其紧密黏贴于胶纸上，避免样品脱落，上述操作均在-20°C切片机冷冻箱中进行。
[0080]将上述切片样品转移至冷冻干燥机中，于-20°C下冷冻干燥72h;将上述冷冻干燥后的切片样品置于显微镜下观察，挑选出组织结构完整、高质量的样品，拍摄显微组织图片后备用，如图8所示；
[0081 ] (2)制备液体样品用于ICP-MS定量分析
[0082]配制三酸消煮液:5mL浓硝酸，ImL高氯酸和ImL氢氟酸混合。
[0083]将剩余叶柄与实验植株新生的新叶分别放入信封，置于烘箱中，65°C下烘72h;将上述烘干样品转移至磨样机中，磨成能通过0.25mm筛孔的粉末状样品；称取0.1g粉末样品至聚四氟乙烯消煮管中，加入三酸消煮液，于常温下消煮2h后，置于130°C消煮炉中消煮5h;将消煮完全的液体样品转移至125mL塑料广口瓶中，用超纯水定容至50mL。
[0084]4、y_XRF 原位分析
[0085]与实施例1方法相同，所获得叶柄的冷冻干燥完的切片样品进行μ-XRF原位分析；由图9可见，ck表示没有经过稳定性同位素68Zn标记液处理的对照组，在韧皮部中没有出现锌元素(白色点)，但是右侧标记组中锌元素(白色点)主要积累于处理叶叶柄的韧皮部组织中。
[0086]5、LA-1CPMS 验证分析
[0087]与实施例1方法相同，实验材料为叶柄的冷冻干燥完的切片样品。由图10可见，LA-1CPMS定量化分析证实了 68Zn主要集中于韧皮部特定区域。
[0088]6、ICP-MS 定量分析
[0089]将消煮完的液体样品，液体样品包括一组叶柄与一组新生的新叶以及对照组，通过ICP-MS进行锌含量的检测，分析获得叶片中锌往植株其他部位的转运量与转运特征。由图11可见，ck表示没有经过稳定性同位素68Zn标记液处理的对照组，ICP-MS定量分析结果表明68Zn标记处理后显著提高了植株叶柄中的Zn含量。
【主权项】
1.一种叶面锌肥肥效的原位评价方法，包括如下步骤: 1)配制同位素68Zn标记液； 2)选取实验植株中的待标记叶片，对待标记叶片的特定部位标记同位素68Zn标记液； 3)选定步骤2)中实验植株的待测部位，所述的待测部位与特定部位没有重合区域，对待测部位进行前置处理； 4)对步骤3)中经过前置处理的待测部位进行μ-XRF原位分析、LA-1CPMS验证分析、ICP-MS定量分析中的两种或三种。2.根据权利要求1所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的步骤2)中特定部位为待标记叶片的整个叶面，所述的步骤3)中待测部位为待标记叶片的叶柄以及实验植株新生的新叶。3.根据权利要求2所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的步骤3)中待测部位进行前置处理是指:将所述的待标记叶片的叶柄进行冷冻切片，然后冷冻干燥;另外分别将待标记叶片的叶柄和实验植株新生的新叶烘干磨碎，进行三酸消煮。4.根据权利要求1所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的步骤2)中特定部位为待标记叶片的局部叶面，所述的步骤3)中待测部位为待标记叶片的剩余叶面。5.根据权利要求4所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的步骤3)中待测部位进行前置处理是指:将所述的待标记叶片的剩余叶面进行冷冻干燥。6.根据权利要求1所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的步骤I)中同位素68Zn标记液包括150?250mg L—1的ZnSO4水溶液，所述的ZnSO4水溶液中68Zn的摩尔比为5?15%。7.根据权利要求6所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的同位素68Zn标记液还包括0.05?0.15vol%的表面活性剂SiIwet L-77。8.根据权利要求3所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的三酸消煮是指: 将烘干磨碎后的样品分散于三酸消煮液中，先进行常温消煮，消煮温度为20?28°C，时间为1.5?2.5h，再进行高温消煮，消煮温度为120?140°C，时间为4?6h; 所述的三酸消煮液组成为:体积比为4.5?5.5:0.5?1.5:1的浓硝酸、高氯酸和氢氟酸的混合液。9.根据权利要求3所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的冷冻切片的温度为-16?_20°C，切片厚度为60?ΙΟΟμπι。10.根据权利要求3或5所述的叶面锌肥肥效的原位评价方法，其特征在于，所述的步骤4)中的μ-XRF原位分析、LA-1CPMS验证分析和ICP-MS定量分析是指: 将冷冻干燥后的样品通过同步辐射荧光探针μ-XRF技术对样品中锌元素进行定位，同时利用激光刻蚀-电感耦合等离子体质谱LA-1CPMS技术进一步定量分析样品中68Zn的原位分布特征;利用电感耦合等离子体质谱ICP-MS技术测定三酸消煮后液体样品中的锌含量。
【专利摘要】本发明涉及一种叶面锌肥肥效的原位评价方法，包括如下步骤：配制同位素68Zn标记液；选取实验植株中的待标记叶片，对待标记叶片的特定部位标记同位素68Zn标记液；选定实验植株的待测部位，所述的待测部位与特定部位没有重合区域，对待测部位进行前置处理；对经过前置处理的待测部位进行μ-XRF原位分析、LA-ICPMS验证分析、ICP-MS定量分析中的两种或三种。该原位评价方法突破了传统叶面肥肥效评价技术存在的耗时长、见效慢等技术瓶颈，率先在细胞水平上原位表征了植物体内锌的分布特征及其动态变化规律。
【IPC分类】G01N33/00
【公开号】CN105699597
【申请号】CN201610044676
【发明人】田生科, 谢若瀚, 王海新, 刘婷
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年1月21日