细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒及其临床应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检验领域，特别是涉及细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒及其在红细 胞膜抗原保存及血型抗体检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 红细胞血型是人类遗传多态型标志之一，自20世纪初发现ΑΒ0血型以来，已发现 500多个人类红细胞血型抗原，目前已确认200多个。其中，与临床最为密切的血型系统包括 AB0、Rh、MNS等29个系统。临床血型血清学检测主要有:血型检测、抗体筛检和鉴定、交叉配 血。目前，血型血清学检测所使用的红细胞均为新鲜细胞。然而新鲜红细胞保存期短，仅3个 月，而且在使用过程中，易受环境条件的影响，难以满足临床常规检测应用。
[0003] 趋磁细菌(Magnetotactic bacteria，MTB)是一类能沿磁力线方向排列或作定向 运动、在细胞内合成由生物膜包围的细菌磁颗粒的革兰氏阴性细菌，其在自然界普遍分布， 但是由于其对生长条件、营养要求非常苛刻，使得其纯培养和特性的研究相当困难。在80年 代和90年代初期对趋磁细菌的研究一度处于低迷状态。近年来，随着分子生物学技术等的 迅速发展，对趋磁细菌的形态学、生物学特性、培养条件等的研究也迅速发展起来。
[0004] 趋磁细菌是从环境中吸收大量的铁，形成一种特殊的细胞器，即细菌磁颗粒，其内 部含有一个单磁畴的四氧化三铁(Fe30 4)或四硫化三铁(Fe3S4)的晶体，其外部有脂类和蛋 白组成的单位膜包被。不同的菌株可以合成不同形状的细菌磁颗粒，具有种专一性。细菌磁 颗粒主要有平截八面体、棱柱状、子弹状、箭头状、齿状等，直径30~120nm。在细胞内，细菌 磁颗粒通常高度有序地排列成一条或几条链，形成一个或多个"小磁针"，从而使菌体可以 感知外界磁场;细菌磁颗粒的形成过程属于生物矿化(biomineralization)，其整个过程多 在50nm左右的泡囊内进行，受到严格的生物调控，条件温和，产物为单磁畴晶体，粒径均一、 晶形稳定，在同类材料中磁性最强，是名副其实的"纳米工厂(Nanofactory)"。同时，细菌磁 颗粒有单位膜包被，与裸露的磁性材料相比，其具有超顺磁性，易于分散，目前尚无法人工 模拟。此外，细菌磁颗粒大小均匀、表面积大，并且外有生物膜包被，颗粒间不容易聚集，具 有良好的分散性和生物相容性。
[0005] 细菌磁颗粒是一种天然磁性纳米生物材料，由于其优良的性能而在许多领域具有 巨大的潜在应用价值，例如CN102419370公开的用抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体包被的细菌磁 颗粒可用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白；CN101077418公开的载阿霉素细菌纳米细菌磁颗 粒可用于抑制癌细胞的增殖等;但是现有技术还没有公开利用细菌磁颗粒与红细胞膜并用 于血型抗体检测的相关报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒及其在红 细胞膜抗原保存及血型抗体检测中的应用，该检测方法简便、高效，结果准确、可靠。
[0007] 本发明具体技术方案如下：
[0008] 本发明一方面提供一种细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒，其中该颗粒是由表面nh2 基团通过偶联剂活化后的细菌磁颗粒和红细胞膜通过孵育剂孵育而成。
[0009] 进一步的改进，该孵育剂为聚乙二醇4000,该偶联剂选自质量比为1:1-1.2的EDC 和NHS的混合物。其中EDC为1-乙基-3-( 3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，NHS为N-羟基硫代琥 珀酰亚胺，通过采用EDC和NHS的混合物作为偶联剂可以显著提高细菌磁颗粒负载红细胞膜 的量。
[0010] 进一步的改进，为了进一步提高细菌磁颗粒的活化效果，上述偶联剂中还加入了 质量比为1:2.5的琼脂和无水硫酸钙的混合物。
[0011] 进一步的改进，所述孵育剂为重量份数比为2:5.5-7.2:2-3的壳聚糖、海藻酸钠和 聚乙二醇4000的混合物。选择3种物质的混合物作为孵育剂可显著提高细菌磁颗粒对红细 胞膜的负载效果。
[0012] 进一步的改进，红细胞膜上的血型抗原保持抗原表位活性，血型抗原包括但不限 于八80、诎、1^11、〇1^€7、几、丽38、01或1^中的抗原。
[0013] 本发明提供的细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒在临床检验领域用于红细胞膜血型 抗原的长期保存(特别是稀有血型抗原保存），及作为新鲜试剂谱红细胞的替代品用于血型 抗体检测中的应用。
[0014] 本发明另一方面还提供一种细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒的制备方法，该制备方 法包括如下步骤：
[0015] 1)活化:加入偶联剂对细菌磁颗粒表面进行活化，制得活化后的细菌磁颗粒；
[0016] 2)孵育:将活化后的细菌磁颗粒与红细胞膜混合，加入孵育剂，室温孵育；
[0017] 3)磁铁吸附并洗涤，收集沉淀，即得细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒；
[0018] 优选地，细菌磁颗粒先经过处理步骤再进行活化；
[0019] 优选地，所述细菌磁颗粒的处理步骤具体方法如下：
[0020] (1)取细菌磁颗粒，加入处理剂搅拌条件下反应，反应完成后将产物洗涤至中性； 所述处理剂为体积比是40-60:1-3:0.3-1的无水乙醇、氨水和正硅酸乙酯的混合液；
[0021] (2)将步骤(1)反应后得到的细菌磁颗粒配成浓度为0.1 %~0.3%的溶液，调节溶 液pH值至3.0-5.0，向上述溶液中加入浓度为5-15%的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中， 搅拌条件下反应，反应完成后将产物洗涤至中性，制得经过处理的细菌磁颗粒；
[0022] 优选地，所述活化步骤具体方法如下：
[0023] (a)取经过处理的细菌磁颗粒，加入偶联剂混合物，搅拌反应，过滤，所述偶联剂为 质量比为1:1-1.2的EDC和NHS的混合物；
[0024]优选地，孵育的条件为：140-160rpm涡旋振荡，室温，反应过夜；
[0025] 优选地，所述孵育剂为聚乙二醇4000;
[0026]优选地，所述孵育剂重量份数比为2:5.5-7.2:2-3的壳聚糖、海藻酸钠和聚乙二醇 4000的混合物。
[0027]本发明另一方面还提供了 一种细菌磁颗粒的制备方法，其包括如下步骤：
[0028] a.将趋磁细菌MSR-1菌株进行扩大培养；
[0029] b.离心并收集趋磁细菌MSR-1菌株，用Tris-HCl缓冲液悬浮，制得悬 [0030]浮液；
[0031] c.超声波破碎悬浮液中的细胞；
[0032] d.磁铁吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到 的沉淀，超声波清洗，磁铁再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3 次，即得细菌磁颗粒；
[0033] 优选地，
[0034] 离心条件为:转速8000-1 OOOOrpm，离心时间5-1 Omin;
[0035] 超声波破碎条件为:超声功率250-350w，超声时间2-7s，间隔时间2-7s，超声次数 80-100次，重复3次；
[0036] 超声波清洗条件为:超声功率70-90w，超声时间2-7s，间隔时间2-7s，超声次数40-60次。
[0037]本发明另一方面还提供了红细胞膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0038] a)取新鲜红细胞，用NaCl溶液洗涤至上清液澄清，获得压积红细胞；
[0039] b)向压积红细胞中加入等体积的NaCl溶液，混匀后室温作用，离心
[0040] 并收集沉淀；
[0041] c)向步骤b)收集的沉淀中加入等体积的NaCl溶液，混匀后室温作用，
[0042]离心并收集沉淀；
[0043] d)向步骤c)收的沉淀中加入等体积的蒸馏水，混匀后室温作用，离
[0044] 心，收集沉淀并用PBS悬浮，即得红细胞膜。
[0045] 本发明另一方面还提供了趋磁细菌MSR-1菌株扩大培养方法，其包括如下步骤： [0046] a.在培养罐内加入第一培养基，105-110 °C灭菌10min，静置lh后，将趋磁细菌MSR-1菌株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液;第一次培养的条件为:起始pH值 为5.5-6,培养温度为28-30 °C，培养时间为3-5天，摇床转速为250-300转/分钟，培养过程中 通入氧气，通入氧气的方式为：间隔20min，通入50min氧气；
[0047] b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养;第 二次培养的条件为:起始pH值为6.5-7.0，培养温度为20-25°C，培养时间为2-3天，摇床转速 为100-200转/分钟。
[0048] 进一步的改进，趋磁细菌扩大培养过程中的，第一培养基由重量份数为5-10份的 谷氨酰胺、1-3份麦芽糖醇、2-5份、0.5-1份泛酸钙、0.5-1份酪蛋白酸钠、0.2-0.5份磷酸二 氢钾、0.5-1份月桂酸肌氨酸和1-2份氯化钠组成;第二培养基由重量份数为2-3份蛋白胨、 2-5份生物素、1-2份甘氨酸、0.5-1份