Fgf23检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗器械领域，具体地是涉及一种FGF23检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] FGF23(成纤维样细胞生长因子23)是一个功能蛋白分子，含251个氨基酸残基，分 子量32KDa，在蛋白分子179位精氨酸和180位丝氨酸之间经蛋白酶水解成N-末端和C-末端 两个片段。它主要是由分泌细胞分泌，用于调节磷酸盐和1，25(0H)2D代谢。
[0003] FGF23(成纤维样细胞生长因子23)是最近发现的相关蛋白大家族中的新成员，其 基因编码一个含250个氨基酸残基的蛋白。FGF-23的N-末端(aa 1-24)是疏水的且很可能作 为其进入血液循环的信号肽；它的C-末端(aa 180-251)与FGF蛋白家族的其它成员仅有有 限的同源性。FGF-23与FGF-21(~24%为同源序列）和FGF-19(~22%为同源序列）最接近。
[0004] 肾磷酸盐流失可导致低血磷症，是骨骼矿化和生长板发展缺陷的原因之一。常染 色体显性低血磷性佝偻病(ADHR，一种罕见遗传疾病）患者体内携带一种FGF-23突变子，该 突变子可使蛋白质免受水解断裂。而且，并发瘤原性骨软化(00M)的肿瘤患者被证实有过量 的FGF-23mRNA表达，似乎表明血液中FGF-23浓度的上升是导致这类病人磷酸盐流失的原 因。对啮齿动物应用重组FGF-23后发现尿中磷的排泄量增加进而导致低血鳞症和骨软化/ 佝偻病也印证了这一结论。总之，现有文献表明FGF-23直接或间接地与磷酸盐动态平衡的 调节有关。
[0005] 测定人体血液循环中的全段FGF-23水平可能为以下不同程度的血磷酸盐流失障 碍患者的实验室评估提供重要的诊断工具:瘤原性骨软化，X-链锁低血磷性佝偻病和常染 色体遗传性低血磷性佝偻病。此外，对FGF-23的灵敏测定可能为骨骼调节和矿化动态提供 新的见解。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种FGF23检测试剂盒。
[0007] 实现上述目的的技术方案如下：
[0008] -种FGF23检测试剂盒，主要包括有：
[0009] (A)生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体:FGF23抗体的效价为1:4550 - 5050;
[0010] (B)FGF23单克隆抗体预包被微孔板，预包被用FGF23单克隆抗体溶液效价为1: 950-1:1050；
[0011]所述生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体与FGF23单克隆抗体溶液的用量比为1: 1〇
[0012]在其中一个实施例中，所述的FGF23检测试剂盒，还包括过氧化物酶与链霉亲和素 偶联后得到的酶结合物，所述酶结合物的工作浓度为1. 〇 - 2. Oμg/ml。
[0013] 在其中一个实施例中，所述兔抗FGF23多克隆抗体的效价为1:5000，所述FGF23单 克隆抗体的效价为1:1000。
[0014]本发明另一目的是提供一种FGF23检测试剂盒的制备方法。
[0015]实现上述目的的技术方案为：
[0016] -种FGF23检测试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：
[0017] 1)制备生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体:取兔抗FGF23多克隆抗体，用lOmmol/ L的TRIS缓冲液稀释兔抗FGF23多克隆抗体至浓度约1. Omg/mL，取浓度为1.20-1.30mg/mL的 活化生物素(N-羟基琥珀酰亚胺生物素），按抗体稀释液:生物素= 9-11:1体积比混合，通过 化学反应将生物素与兔抗FGF23多克隆抗体交联;取制备后的生物素标记的兔抗FGF23多克 隆抗体;所述兔抗FGF23多克隆抗体工作液的效价为1:4550 - 5050;
[0018] 2)制备FGF23单克隆抗体溶液:取FGF23单克隆抗体，加入10mmol/L的TRIS缓冲液 与25mol/L EDTA的混合液，得到FGF23单克隆抗体工作液，所述FGF23单克隆抗体工作液效 价为 1:950 -1:1050。
[0019] 在其中一个实施例中，兔抗FGF23多克隆抗体制备：取家兔采用皮下注射方式，对 其进行免疫接种，初次免疫注射〇. 8-1.2mg/mL浓度的FGF23抗原0.2 ±0.05mL/只，第3周、 第4周及第5周分别注射浓度为0.8-1.2mg/mL FGF23抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶 液;免疫达到预期效果后处死家兔，动脉采血，然后采用辛酸-硫酸铵法纯化即得兔抗FGF23 多克隆抗体。
[0020] 在其中一个实施例中，所述FGF23单克隆抗体的制备操作为:对小白鼠采用皮下注 射方式，对其进行免疫接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的FGF23抗原0.2mL/只，第3周、第4周 及第5周分别注射浓度为lmg/mL FGF23抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液;免疫达到 预期效果后拉颈处死小鼠，收集血液，适量分装后保存；同时，在生物安全柜中解剖小鼠，取 其脾脏筛选淋巴B细胞，完成后与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法挑选目标克隆融合细 胞，最后接种培养以生产单克隆抗体。
[0021 ]在其中一个实施例中，所述FGF23检测试剂盒还包括有酶结合物，该酶结合物的制 备操作为:取链霉亲和素〇. lg，加入到10mL 10mm〇l/L TRIS缓冲液中溶解混匀；取HRP干粉 (辣根过氧化物酶)用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与链霉亲和素交， 得到HRP标记的链酶亲和素，加入防腐剂和稳定剂分装保存。用TRIS缓冲液和EDTA的混合液 将酶结合物的工作浓度稀释为1. 〇 - 2.0μg/ml，优选为1.5μg/ml。
[0022]在其中一个实施例中，制备所述兔抗FGF23多克隆抗体或所述FGF23单克隆抗体的 FGF23抗原的氨基酸组成如SEQ ID N0.1所示。
[0023]本发明所述试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法，是基于一种FGF23片段对包被于 微孔板上的单克隆抗体结合，再与生物素标记的FGF23抗体结合的方法。
[0024]首先，加入的标本/质控品/校准品中的FGF23与微孔板中的固相抗体(FGF23单克 隆抗体)结合，然后加入生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体选择性结合目标物FGF23，生物 素再与加入的HRP标记的链霉亲和素结合，形成酶标志的夹心复合物，经过洗涤后加入的底 物TMB在酶催化下显色，最后加入终止液终止反应。颜色的深浅和标本中的FGF23呈正相关。 在酶标仪450nm(参考波长620nm)下测定0D值。
[0025]本发明所述的FGF23检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。
【附图说明】
[0026]图1实施例2中检测方法的标准曲线。
【具体实施方式】 [0027] 实施例1
[0028]( - )本实施例所述的FGF23检测试剂盒的主要组成成份如下：
[0029] 1.抗FGF23单克隆抗体包被的微孔板
[0030]抗FGF23单克隆抗体预包被的条形微孔板(12条X8孔），置于框架中。
[0031]制备FGF23单克隆抗体预包被微孔板:取FGF23单克隆抗体，用10mmol/L的TRIS缓 冲液(含25mol/L EDTA)稀释，所得抗体溶液效价为1:1000;然后向微孔板各孔中加入100uL 抗体溶液，置于37 °C直至完全干燥。
[0032] 2.标准品 1-7
[0033] 溶于人血清中的重组FGF23，浓度分别为0，0.2,0.6，1.8,5，10,20pmol/L，白色盖 子，冻干粉，7瓶。
[0034] 3.FGF23 质控品
[0035] 冻干粉(复溶后的精确浓度见标签），2瓶。
[0036] 4.检测缓冲液
[0037] 可以直接使用的1 Ommo 1 /L的TRIS缓冲液1瓶(至少20.0ml)。
[0038] 5.生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体
[0039]可直接使用的生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体1瓶(至少6.0mL)。
[0040] 6.酶结合物
[0041] 可直接使用的过氧化物酶偶联的链霉亲和素（溶于含去污剂、防腐剂的TRIS缓冲 溶液中）1瓶(至少13.0mL)。
[0042] 7.底物溶液
[0043] 可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物，1瓶(至少13. OmL)。
[0044] 8.终止液
[0045] 可直接使用的0.18M硫酸溶液，1瓶(至少7. OmL)。
[0046] 9.清洗溶液（2〇父）
[0047]含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液，1瓶(至少50.OmL)。
[0048] 10.封板膜
[0049] 孵育时密封微孔板的粘性薄膜。
[0050] 所述试剂盒的制备如下：
[0051] -)校准品与质控品
[0052] 1)来源：
[0053] FGF23合成肽冻干粉外购。
[0054] 2)质控品制备：
[0055]用10mm〇l/L的TRIS缓冲液稀释FGF23合成肽冻干粉，质控品1中FGF23浓度约为 1.50pmol/L，质控品 2 中 FGF23 浓度约为 4.50pmol/L，并加入 1% 的BSA和 0.018% 的Bronidox 5L做为稳定剂和防腐剂，各取0.4mL分装，冻干后4°C密封保存。
[0056] 3)标准品制备：
[0057] 标准品1-7取FGF23合成肽冻干粉，分别用10mm〇l/L的TRIS缓冲液稀释至FGF23浓 度为Opmol/L，0 · 20pmol/L，0 · 60pmol/L，1 · 80pmol/L，5 · OOpmo 1/L，10 · 00pmol/L和 20.00pmol/L。各取0.4mL分装，冻干后4°C密封保存。
[0058] 二)生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体
[0059] FGF23抗原的氨基酸组成如SEQ ID NO: 1所示，其可以通过诱导表达得到，也可以 通过合成得到。
[0060] SEQ ID N0:1：
[0062] FGF23抗原通过诱导表达参照常规方法制备:获得编码FGF23的DNA片段，将该片段 插入pET质粒载体中，然后转化入大肠杆菌中构建重组表达菌株(pET-FGF23/BL21)，再利用 IPTG进行诱导表达，通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化融合蛋白，得到氨基酸组成如SEQ ID NO: 1所示的FGF23抗原，纯度鉴定合格后即可用作抗原免疫动物。
[0063] 兔抗FGF23多克隆抗体制备:取家兔采用皮下注射方式，对其进行免疫接种，初次 免疫注射lmg/mL浓度的上述FGF23抗原0.2mL/只，第3周、第4周及第5周分别注射浓度为 lmg/mL FGF23抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液;免疫达到预期效果后处死家