兔，动 脉采血，然后采用辛酸-硫酸铵法纯化即得兔抗FGF23多克隆抗体。
[0064] 用10mmol/L的TRIS缓冲液稀释兔抗FGF23多克隆抗体至浓度约1.0mg/mL，取浓度 为1.25mg/mL的活化生物素(N-羟基琥珀酰亚胺生物素），按抗体稀释液:生物素=10:1体积 比混合，通过化学反应将生物素与兔抗FGF23多克隆抗体交联；取制备后的生物素标记 FGF23抗体，加入1 %的BSA和0.018%的Bronidox L做为稳定剂和防腐剂，4°C密封保存，所 述FGF23多克隆抗体工作液的效价为1:5000。
[0065] 三)FGF23单克隆抗体溶液：
[0066] 取FGF23单克隆抗体，用10mmol/L的TRIS缓冲液与25mol/L EDTA混合，得到FGF23 单克隆抗体工作液，所述FGF23单克隆抗体工作液效价为1:1000。
[0067] 所述FGF23单克隆抗体的制备操作为:对小白鼠采用皮下注射方式，对其进行免疫 接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的上述FGF23抗原0.2mL/只，第3周、第4周及第5周分别注射 浓度为lmg/mL FGF23抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液;免疫达到预期效果后拉颈处 死小鼠，收集血液，适量分装后保存(小鼠血液，可分离血清，其中含有鼠抗FGF23多抗）。
[0068] 同时，在生物安全柜中解剖小鼠，取其脾脏筛选淋巴B细胞，完成后与外购的骨髓 瘤细胞融合，通过有限稀释法挑选目标克隆融合细胞，最后接种培养以生产单克隆抗体。 [0069]四）酶结合物
[0070] 链霉亲和素冻干粉购自英国Abeam公司。取链霉亲和素冻干粉O.lg，加入到10mL 1 Ommo 1 /L TRIS缓冲液中溶解混匀；取HRP固体用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸 钠法将HRP与链霉亲和素交联。取制备后的HRP标记链霉亲和素，再加入1 %的BSA、0.1 %的 Tween 20和0.0075%的Bronidox L做为稳定剂和防腐剂，取12mL分装，4°C密封保存。所述 酶结合物的工作浓度为1.5μg/ml。
[0071] 五)其他
[0072 ]微孔板、底物液、终止液和冲洗液均由其他商业公司提供。
[0073] 实施例2:运用实施例1所述的试剂盒对FGF23检测
[0074] 使用前，将所有溶液平衡至室温（18-22Γ)。确定实验所需微孔板数量。每一样本 设两个平行孔。另外，每轮实验共需要18孔用于标准品和质控。将适当数量的微孔板置于塑 料框架上。将未使用的微孔板与干燥剂一起密封于锡箱袋中。具体包括以下步骤：
[0075] 1) -次孵育
[0076]向适当的孔中加入50yL FGF23校准品（1-7)，质控品或待测样本，再加入50yL生物 素抗体溶液。用封口膜密封微孔板，室温(18-22 °C)孵育过夜20-24小时。
[0077] 2)清洗
[0078]清洗缓冲溶液(20 X )以1体积浓缩缓冲溶液+20体积蒸馏水的比例稀释。手工清洗 微孔板5次。若使用自动洗板机，通常清洗5次。确保每次手工或自动清洗后将微孔中的溶液 倒干净。进入下一步前，在吸水纸上拍干，弃去残余液体。
[0079] 3)二次孵育
[0080]向各孔加入100yL酶结合物溶液。用封口膜密封微孔板，室温（18-22°C)下避光孵 育60 ±5分钟。
[0081] 4)清洗
[0082] 见第2步。
[0083] 5)与生色底物溶液孵育
[0084]向各孔加入100yL底物溶液，用封口膜密封，室温（18-22 °C)下避光孵育10-30分 钟。
[0085] 6)终止显色反应
[0086]向各孔加入50yL终止溶液。
[0087] 7)测定吸光度
[0088] 在30min内以630nm为参照，测定450nm下的吸光度。
[0089] 检测范围
[0090] 如果待测样本的吸光度高于校准品7,我们推荐血清样本1:11稀释（1 + 10,如?ομL 样本+100μ1检测缓冲液）；血浆样本1:41稀释(1+40，10μ1样本+400μ1检测缓冲液)后重新检 测。
[0091 ]质量控制
[0092] 【参考值(参考范围）】
[0093] 各类健康人样本的平均值举例如下。
[0094]
[0095] 【检验结果的解释】
[0096] 结果处理
[0097] 450nm波长(参考630nm波长)读取吸光度(0D值）。可以使用软件或坐标纸根据校准 品的吸光度数值建立标准曲线(参见图1)。可以从这个标准曲线上获得样本的浓度。检测结 果使用4参数对数曲线回归拟合。不同的曲线拟合方法需要用户自己评价。计算样本的最终 浓度还应该考虑各自的稀释倍数。
[0098] 实施例3:试剂盒质量分析
[0099] -、批次间差异：<7.0%
[0100]批次间差异:4个不同操作员使用2个不同批次的试剂盒(该试剂盒的制备和组成， 使用方法如实施例1和2所示，以下实验中的用到试剂盒也同上)检测2个已知浓度FGF23参 考品样本10次。
[0101]
[0102] 检测极限：0.08pmol/l
[0103] 检测极限为0.08pmol/l，此值为低于21个校准品0吸光度测定平均值加三个标准 差所对应的浓度。
[0104] 二、精确度 <12%
[0105] 批内检测：1个操作员使用一个批次的试剂盒检测2个已知浓度FGF23参考品样本6 次。
[0106] 批间检测:4个不同操作员使用2个不同批次的试剂盒检测2个已知浓度FGF23参考 品样本10次。
[0107]
[0109] 三、稀释/线性96%
[0110] 用本试剂盒检测筛选样本，分别挑取阳性样本血清、EDTA血浆、肝素血浆、枸缘酸 钠血浆各一份，阴性样本血清、血浆各一份，然后用阴性血清分别以比例1:1、1:3、1:7稀释 阳性样本血清，用阴性血浆分别以比例1:1、1:3、1:7稀释阳性样本EDTA血浆、肝素血浆、枸 缘酸钠血浆，每个稀释样本作4次平行测试，计算其平均值，平均回收率=(稀释理论值-稀 释测试均值)/稀释理论值(稀释理论值=原样本测试值/稀释倍数）。
[0111]
[0112]以上所述实施例仅用于说明本发明针对实际应用时的一种【具体实施方式】，其描述 较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，做出的若干变形和改进都属于 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种FGF23检测试剂盒，其特征是，主要包括有： (A) 生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体：兔抗FGF23多克隆抗体的效价为1:4550 - 5050； (B) FGF23单克隆抗体预包被的微孔板，包被用FGF23单克隆抗体效价为1:950 - 1: 1050； 所述生物素标记的FGF23抗体与FGF23单克隆抗体溶液的用量比为1:1。2. 根据权利要求1所述的FGF23检测试剂盒，其特征是，还包括过氧化物酶与链霉亲和 素偶联后得到的酶结合物，所述酶结合物的工作浓度为1. 〇 - 2. Oμg/ml。3. 根据权利要求1所述的FGF23检测试剂盒，其特征是，所述兔抗FGF23多克隆抗体效价 为1:5000。4. 根据权利要求1-3任一项所述的FGF23检测试剂盒，其特征是，所述FGF23单克隆抗体 效价为1:1〇〇〇。5. -种FGF23检测试剂盒的制备方法，其特征是，主要包括以下步骤： 1) 制备生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体:取兔抗FGF23多克隆抗体，用TRIS缓冲液 进行稀释，得到FGF23多克隆抗体浓度为0.9-1. Omg/mL的抗体稀释液，取浓度为1.20-1.30mg/mL的生物素，按抗体稀释液:生物素=9~11:1体积比混合，通过化学反应将生物素 与兔抗FGF23多克隆抗体交联，得到生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体工作液，所述兔抗 FGF23多克隆抗体的效价为1:4550 - 5050; 2) 制备FGF23单克隆抗体溶液：取FGF23单克隆抗体，加入TRIS与EDTA的混合液，得到 FGF23单克隆抗体工作液，所述FGF23单克隆抗体工作液效价为1:950 - 1:1050。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，制备所述兔抗FGF23多克隆抗体或所述 FGF23单克隆抗体的FGF23抗原的氨基酸组成如SEQ ID N0.1所示。7. 根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征是，所述FGF23单克隆抗体的制备包括如 下步骤:对小白鼠采用皮下注射方式，对其进行免疫接种，初次免疫注射FGF23抗原，第3周、 第4周及第5周分别注射FGF23抗原与不完全弗氏佐剂等体积的混合溶液，免疫达到预期效 果后拉颈处死小鼠，收集血液，适量分装后保存；同时，解剖小鼠，取其脾脏筛选淋巴B细胞， 完成后与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法挑选目标克隆融合细胞，最后接种培养以生产 单克隆抗体。8. 根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征是，所述兔抗FGF23多克隆抗体制备包括 如下步骤:取家兔采用皮下注射方式，对其进行免疫接种，初次免疫注射0.8-1.2mg/mL浓 度的FGF23抗原0.2 ± 0.05mL/只，第3周、第4周及第5周分别注射浓度为0.8-1.2mg/mL FGF23抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液;免疫达到预期效果后处死家兔，动脉采血， 然后采用辛酸-硫酸铵法纯化即得兔抗FGF23多克隆抗体。9. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述FGF23检测试剂盒还包括酶结合物， 该酶结合物的制备包括以下步骤： 1) 取链霉亲和素，溶解于TRIS缓冲液中； 2) 取HRP干粉，用去离子水稀释，采用简易过碘酸钠法将HRP与链霉亲和素交联，得到 HRP标记链霉亲和素； 3) 取HRP标记链霉亲和素为酶结合物，用TRIS缓冲液和EDTA的混合液将酶结合物的工 作浓度稀释为1.0 - 2. Oμg/ml。
【专利摘要】本发明公开了一种FGF23检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒主要包括有：生物素标记的兔抗FGF23多克隆抗体：效价为1:4550－5050；FGF23单克隆抗体溶液，该FGF23单克隆抗体效价为1:950－1:1050；所述生物素标记的FGF23抗体与FGF23单克隆抗体溶液的用量比为1：1。所述FGF23检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/68, G01N33/535
【公开号】CN105699664
【申请号】CN201610211645
【发明人】陈柏龄, 郭志程
【申请人】陈柏龄, 广州菲康生物技术有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月5日