2型糖尿病唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质谱应用技术领域，具体地说，涉及一种2型糖尿病唾液蛋白指纹 图谱分子诊断模型建立方法。
【背景技术】
[0002] 2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是临床常见的老年代谢紊乱性疾 病，生化检查主要表现为患者空腹血糖及(或者)餐后血糖的升高，症状典型者可以同时伴 有口干多饮、多食易饥、尿量增多以及体重减轻等表现，在病程后期，患者多出现心、脑、肾 等组织器官的血管粥样硬化性病变，导致血管管腔狭窄，从而引起一系列心、脑、肾等组织 器官供血不足、代谢障碍甚至衰竭的临床表现。病情危重者，则由于碳水化合物、脂肪、蛋白 质等物质代谢严重失常，或者胰岛素使用不当，血糖在短时间内急剧飙升，引起患者出现病 情危重的状态，例如糖尿病酮症酸中毒昏迷(DKA)、高血糖高渗性昏迷，倘若抢救不及时，患 者多有生命危险。此外，2型糖尿病的致残率极高，有的老年性患者因为血糖反复或持续性 升高，出现了白内障、青光眼、失明、尿毒症，甚至肢体坏疽、截肢等严重不良后果，严重影响 患者生活质量，增加社会经济负担。目前，随着人们现在生活水平的提高、平均寿命年龄的 延长、人口的老龄化以及人们饮食习惯的西方化，我国的2型糖尿病患者人口总数已经高居 于世界首位，而且处于快速增长的阶段，与此同时，我国2型糖尿病患者的患病年龄日趋于 年轻化，形势非常严峻。
[0003] 机体胰岛素分泌相对不足(胰岛素缺乏)和(或)胰岛素的生物效应降低(胰岛素抵 抗)是2型糖尿病患者血糖持续性居高不下的重要原因，是2型糖尿病发病的主要机制。为了 更好的防治2型糖尿病，减少或者阻止2型糖尿病的并发症出现，目前已经对其发病机制进 行更深层次的研究。例如患者胰岛素分泌或功能减退，除了与体型肥胖、运动过少等环境因 素有关外，也跟基因等遗传因素有关，其中基因核转录因子7类似物2(tran SCripti〇n factor 7-like 2，TCF7L2)是引起2型糖尿病最重要的一个遗传基因，它除了可以通过直接 影响β细胞的生长、分化以及功能来干扰胰岛素的分泌，也可以通过间接的引起胰岛功能的 缺陷，从而引起血糖的异常。随着科学的进步，人们对2型糖尿病的研究逐渐由基因转向基 因表达的蛋白质研究，例如有人发现2型糖尿病患者跟正常人比较，存在唾液激素原转化酶 (Prohormone convertase，PC)含量明显偏低的现象，这种酶是一种内切蛋白酶，能够对神 经内分泌激素的前身进行加工，而且能够作用于胰岛细胞，使其分泌的胰岛素原去除部分 肽段形成胰岛素，其含量的降低则可以导致胰岛素的形成不足，从而引起血糖升高。
[0004] 随着人类基因组计划(human genomic project，HGP)的完成，人们逐渐将研究革巴 向转变对蛋白质组(pro teome)的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提 出，指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强 调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图 的同时，分别发表了 Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所 未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学 (proteomics)是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模 式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互作 用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整体层 次上对蛋白质进行动态研究。
[0005] 蛋白质是生命活动的执行者，是基因表达的产物，其表达、修饰、功能以及彼此相 互作用均受到遗传及环境因素的影响，于是机体出现疾病状态必然会引起蛋白质含量或者 存在形式的变化，这些变化的蛋白质分子可以为临床疾病诊断的物质基础提供依据。蛋白 质组学主要是运用现代先进的检测技术，检测机体从小到一个细胞到大至整个机体的全部 基因所表达的蛋白质的特性，比较分析生理或病理状态、用药及不用药状态下的差异表达 蛋白质，找出不同状态下个体表达差异的蛋白质，从而为生命的物质基础、疾病的早期检测 与诊断等研究寻找分子诊断标志物提供依据。
[0006] 近年来，随着现代科学及生物化学的微量检测分析技术的发展创新，唾液作为一 种临床容易采集而且操作过程完全没有创伤性的体液逐渐进入了人们研究活动的视角，且 具有无法估计的科研潜力以及临床应用前景。首先，相比血清标本而言，唾液标本的采集更 安全，具有无创性，采集过程中患者无痛苦，易于接受，而且无血源性疾病传播的风险存在； 与尿液标本相比，唾液标本具有可实时采样、更方便的优点。此外，唾液检测需要的样本量 小、成本低、易于储存和运输。最重要的是，唾液标本成分与血液、尿液等体液成分具有极高 的相似性，对疾病诊断具有极强的敏感性和特异性。
[0007] 唾液是人体常见的一种重要体液，其包涵大量的激素、蛋白质、酶、抗体、补体、细 胞因子及各种微生物等血液成分，这些血液成分通过顺浓度梯度被动的跨细胞膜转运或逆 浓度梯度的主动转运等途径分泌在唾液当中，且随体内病理生理变化的影响而呈动态变化 过程。研究唾液的PH值、电解质、生化指标、微生物、免疫指标、蛋白质等成分变化与疾病的 关系，发现唾液成分的变化可作为疾病诊断、疗效判断、药物监测的参考指标，在临床疾病 的诊治活动中具有重要的潜在应用价值。根据目前的文献资料显示，唾液不仅能够作为艾 滋病、乙型肝炎等传染性疾病、口腔恶性肿瘤及乳腺癌等恶性肿瘤的诊断标志，而且也可以 应用于糖尿病、关节炎、心脏病及肾脏疾病等各个系统疾病的诊断，从而成为目前西方国家 研究者热衷的取代血清学检查的首选标本。
[0008] 唾液具有消化食物、润滑、防御保护、缓冲、机械清洗、抗菌以及内分泌等生物作 用，而蛋白质和多肽是唾液成分中最主要的具有生物学功能的物质，目前已发现唾液蛋白 质和多肽有2300多种，主要有α-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、溶菌酶、乳铁蛋白、 黏蛋白等蛋白质，其中有98%的唾液蛋白质是富酷蛋白及转铁蛋白。然而，通过对已发现的 唾液蛋白质的功能进行分类，发现功能未知的蛋白质占有28.7% (比例最大），与免疫功能 相关的蛋白质占21%，与蛋白质复制及修复相关的蛋白质占1.6%，与细胞动力及分泌相关 的蛋白质占4.8%，与转录和核糖体相关的蛋白质占2.3%，与细胞繁殖及细胞循环相关的 占4.2%，而与信号传导、代谢、细胞骨架及内膜相关的蛋白质分别占9.7%、5.2%、7.1 % 等。可见，生物功能尚处于未知状态的唾液蛋白质仍占有相当大的比例，需要进一步研究挖 掘，且意义重大。新近研究证实，大通量、大精度的蛋白组学技术的应用，使唾液蛋白质生物 标记用于疾病的早期诊断预防、生物蛋白质靶向治疗、预后监测判断等均成为可能。
[0009] 因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的2型糖尿 病唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该技术领域急需解决的技术难题。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，本发明要解决现有2型糖尿病检测技术方法复杂，灵敏度低，特异性差， 检测时间长，标本用量大的问题，提供了一种2型糖尿病唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建 立方法。
[0011] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种2型糖尿病唾液蛋白指纹图谱分子诊 断模型建立方法，包括以下步骤：
[0012] (1)样品收集；
[0013] (2)样品预处理:收集的唾液样品在2h内置于转速3000r/min的4°C低温离心机离 心lOmin，并按照50μ1/管分装于冻存管(EP管），置于-80°C冰箱冷冻保存备用；
[0014] (3)纳米磁珠活化；
[0015] (4)唾液样品上样:④取5μ1唾液样品，加10μ1的U9裂解液，混合孵育30min后，加入 185μ1的Wash Buff er稀释（唾液最终上样量为2.5μ1);⑤向含有活化磁珠的PCR管中加入 100μΙ处理好的唾液样品（注意避免产生气泡），室温孵育30min，置于磁