一种铜离子检测试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种铜离子检测试剂盒及其应用。所述铜离子检测方法包括将可能含有铜离子的测试样品与半胱氨酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，之后加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成第二混合体系，其后加入柠檬酸钠和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第三混合体系，通过测定最终所获混合物在可见光波段的吸光值，从而实现对测试样品中铜离子的检测。基于铜离子检测方法制得铜离子检测试剂盒，所述铜离子检测试剂盒包括过氧化物酶的特征底物、金核铂壳纳米粒子、半胱氨酸以及辅助试剂。本发明的铜离子检测试剂盒及检测方法具有测试简便快速、成本低，灵敏度和稳定性高、准确性好等优点，可应用于环境、食品等样品中铜离子的检测。
【专利说明】
一种铜离子检测试剂盒及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种铜离子检测试剂盒及其应用，尤其涉及一种基于金核铂壳纳米模拟酶的铜离子检测方法及铜离子检测试剂盒，属于分析化学领域。
【背景技术】
[0002]酶是一类生物催化剂，是一种具有催化功能的蛋白质，在适宜的环境中可进行催化化学反应，但是由于酶固有的特性，限制了一些应用，比如蛋白酶容易变性和水解、成本较高且使用条件严格。因此，开发一种具有类似催化活性的模拟酶尤为重要。模拟酶是一类非蛋白结构但与天然酶具有相似催化性能的人工合成催化剂。2007年阎锡蕴研究小组首次发现磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3(k NPs)具有内在的过氧化物模拟酶特性，纳米粒子作为模拟酶的研究备受人们关注。诸如CoFe204、FeS等磁性纳米粒子、二氧化铺纳米粒子、金属纳米粒子、碳纳米材料等纳米微粒模拟酶的相关研究工作。与天然酶相比，模拟酶的制备、纯化和储存都比较容易，且价格低廉，能够在比较苛刻的化学环境中使用。因此，开发纳米模拟酶具有很高的应用前景。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种铜离子检测试剂盒及其应用。
[0004]为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括:
[0005]本发明实施例中提供了一种铜离子检测方法包括:
[0006](I)将可能含有铜离子的测试样品与半胱氨酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，并在室温下孵育30min以上；
[0007](2)向步骤(I)最终所获混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成第二混合体系，并在室温下孵育1min以上；
[0008](3)向步骤(2)最终所获混合体系中加入柠檬酸钠和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第三混合体系，并在室温下反应1min以上，通过测定最终所获混合物在可见光波段的吸光值，从而实现对测试样品中铜离子的检测。
[0009]较为优选的，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为21-40nm，其中金核的尺寸为15-30nm，铀壳的厚度为3-5nm0
[0010]较为优选的，所述过氧化物酶的特征底物包括3，4_二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0011 ]较为优选的，所述第一混合体系中所含半胱氨酸的浓度为5-25μΜ。
[0012]较为优选的，所述第二混合体系中所含金核铂壳纳米粒子的浓度为1-10ρΜ。
[0013]较为优选的，所述第二混合体系中所含过氧化物酶的特征底物的浓度为0.1mM-10.0mM0
[0014]较为优选的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为5.0-8.0。
[0015]本发明的实施例中提供了一种较为具体的铜离子检测方法包括以下步骤:
[0016]1、
[0017]i)将一系列不同浓度的标准铜离子溶液、半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合形成一系列第一混合体系，在室温下孵育30min以上；
[0018]? )向步骤i)最终所获的一系列混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成一系列第二混合体系，并在室温下孵育1min以上；
[0019]iii)向步骤?? )最终所获的一系列混合体系中依次加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，并均匀混合形成第三混合体系，反应1min以上，再分别测定各混合反应物在可见光波段的吸光值，据此建立铜离子浓度-吸光值标准曲线；
[0020]Π 、
[0021]a)将测试样品、半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合形成第一混合体系，在室温下孵育30min以上；
[0022]b)向步骤a)最终所获的混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成第二混合体系，并在室温下孵育1min以上；
[0023]c)向步骤b)最终所获的混合体系中依次加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，并均匀混合形成第三混合体系，反应1min以上，再测定混合反应物在可见光波段的吸光值，并依据前述铜离子浓度-吸光值标准曲线，测得测试样品中的铜离子浓度。
[0024]较为优选的，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-5.0。
[0025]本发明实施例中还提供了一种铜离子检测试剂盒包括:
[0026]过氧化物酶的特征底物，
[0027]金核铂壳纳米粒子，用以催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物，
[0028]半胱氨酸，
[0029]以及，辅助试剂，包含适于使铜离子催化氧化半胱氨酸形成胱氨酸的缓冲液，以及适于使所述金核铂壳纳米粒子催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物的、且适于使所述金核铂壳纳米粒子与半胱氨酸相互作用的缓冲液。
[0030]与现有技术相比，本发明的优点包括:
[0031](I)本发明提供的一种铜离子检测试剂盒及检测方法，利用铜离子催化半胱氨酸氧化生成胱氨酸，抑制半胱氨酸与金核铂壳纳米粒子(AuOPt NPs)及显色底物的相互作用，使AuOPt NPs过氧化物模拟酶催化的底物显色吸光值恢复，并基于此原理开发了高灵敏的铜离子(Cu2+)检测方法，其对Cu2+检测的线性范围为20-500nM，灵敏度可达到ΙΟηΜ。
[0032](2)本发明提供的一种铜离子检测试剂盒及检测方法，具有简便快速、成本低，稳定性尚等优点，可应用于环境、食品等样品中对铜尚子的检测。
【附图说明】
[0033]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0034]图1是本发明实施例1合成的金核铂壳纳米粒子的TEM图；
[0035]图2是本发明实施例1中Cu2+浓度-吸光值标准曲线图；
[0036]图3是本发明实施例1中对于不同重金属离子的选择性的测试谱图。
【具体实施方式】
[0037]鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
[0038]本发明提供的一种金核铂壳纳米粒子具有很高的类过氧化物酶的催化活性，金核铂壳纳米模拟酶对于诸如TMB-H2O2显色体系具有更高的催化效率，能够耐受高温，高湿，并且不受酶抑制剂的影响，半胱氨酸是一种含有巯基的氨基酸，它能够和金核铂壳纳米材料相互作用，导致此过氧化物模拟酶-TMB-H2O2催化显色体系的显色特征吸光值降低；而铜离子能够催化半胱氨酸氧化为胱氨酸，巯基基团被氧化为二硫键，抑制半胱氨酸和金核铂壳纳米模拟酶的相互作用，从而使显色体系的吸光值恢复。铜离子的浓度在一定范围内和显色体系的吸光值呈线性正相关关系。基于以上发现，本案发明人提供了一种灵敏度高，选择性好的铜离子检测试剂盒及铜离子检测方法。
[0039]在一些实施例中提供了一种铜离子检测方法，其包括:
[0040](I)将可能含有铜离子的测试样品与半胱氨酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，并在室温下孵育30min以上；
[0041](2)向步骤(I)最终所获混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成第二混合体系，并在室温下孵育1min以上；
[0042](3)向步骤(2)最终所获混合体系中加入柠檬酸钠和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第三混合体系，并在室温下反应1min以上，通过测定最终所获混合物在可见光波段的吸光值，从而实现对测试样品中铜离子的检测。
[0043]进一步的，所述金核铀壳纳米粒子的粒径为21-40nm，其中金核的尺寸为15-30nm，铂壳的厚度为3_5nm0
[0044]进一步的，所述过氧化物酶的特征底物包括3，4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2，2_联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐中的任意一种或两种以上的组入口 ο
[0045]进一步的，所述第一混合体系中所含半胱氨酸的浓度为5_25μΜ。
[0046]进一步的，所述第二混合体系中所含金核铀壳纳米粒子的浓度为1-10ρΜ。
[0047]进一步的，所述第二混合体系中所含过氧化物酶的特征底物的浓度为0.1mM-10.0mM0
[0048]进一步的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为5.0-8.0。
[0049]进一步的，所述的铜离子检测方法具体包括:
[0050]1、
[0051 ] i)将一系列不同浓度的标准铜离子溶液、半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合形成一系列第一混合体系，在室温下孵育30min以上；
[0052]? )向步骤i)最终所获的一系列混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成一系列第二混合体系，并在室温下孵育1min以上；
[0053]m)向步骤?? )最终所获的一系列混合体系中依次加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，并均匀混合形成第三混合体系，反应1min以上，再分别测定各混合反应物在可见光波段的吸光值，据此建立铜离子浓度-吸光值标准曲线；
[0054]Π 、
[0055]a)将测试样品、半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合形成第一混合体系，在室温下孵育30min以上；
[0056]b)向步骤a)最终所获的混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成第二混合体系，并在室温下孵育1min以上；
[0057]c)向步骤b)最终所获的混合体系中依次加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，并均匀混合形成第三混合体系，反应1min以上，再测定混合反应物在可见光波段的吸光值，并依据前述铜离子浓度-吸光值标准曲线，测得测试样品中的铜离子浓度。
[0058]进一步的，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-5.0。
[0059]在一些实施例中提供了一种铜离子检测试剂盒，其包括:
[0060]过氧化物酶的特征底物，
[0061 ]金核铂壳纳米粒子，用以催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物，
[0062]半胱氨酸，
[0063]以及，辅助试剂，包含适于使铜离子催化氧化半胱氨酸形成胱氨酸的缓冲液，以及适于使所述金核铂壳纳米粒子催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物的、且适于使所述金核铂壳纳米粒子与半胱氨酸相互作用的缓冲液。
[0064]进一步的，所述金核铀壳纳米粒子的粒径为21-40nm，其中金核的尺寸为15-30nm，铂壳的厚度为3-5。
[0065]进一步的，所述过氧化物酶的特征底物包括3，4_二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2，2_联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐中的任意一种或两种以上的组入口 ο
[0066]进一步的，所述辅助试剂包括pH值为5.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液，以及，pH值为
4.0-5.0的柠檬酸钠缓冲溶液的。
[0067]在一些实施例中提供了上述的铜离子检测试剂盒或上述的铜离子检测方法于检测铜离子中的应用。
[0068]例如:将半胱氨酸和待测溶液及磷酸盐缓冲溶液混合，再)加入金核铂壳纳米粒子溶液，然后加入反应缓冲液和反应底物，均匀混合形成混合反应体系，反应1min以上，再测定该混合反应体系在可见光波段，优选在波长为650nm处的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测溶液中的Cu2+浓度。
[0069]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图及若干优选实施例对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0070]在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
[0071]以下各实施例中，所涉及的原料，如金核铂壳纳米粒子溶液、半胱氨酸及其它试剂均可通过市售途径获取。
[0072]实施例1
[0073](I)利用柠檬酸钠还原法合成平均粒径为15nm的金纳米粒子溶液:取30mL合成的金纳米溶液(3nM)和10mL，1.0mM六氯铂酸钾(K2PtCl6)混合于洁净的锥形瓶里置于磁力搅拌器上搅拌并加热至800C，然后向混合溶液中缓慢加入1mL，5mM的还原剂-抗坏血酸，溶液颜色由酒红色逐渐变为棕色，使混合溶液保持80°C继续搅拌30min以保证溶液中的1(2?比16完全被还原，即得到粒径约为21nm的金核铂壳纳米粒子，如图1所示的TEM图。
[0074](2)将10ul，100yM半胱氨酸溶液、70ul —系列不同浓度的铜离子溶液(0-500nM)(含10mM磷酸盐缓冲溶液)依次加入到酶标板中，充分混合后室温下孵育30min;
[0075](3)将步骤(I)中得到的金核铂壳纳米溶液稀释100倍，取20ul加入步骤(2)中的混合溶液中，充分混合后室温下孵育15min;
[0076](4)向步骤(3)中孵育好的混合溶液中依次加入52yL柠檬酸檬酸钠缓冲溶液(0.04M，pH 4.0)、29yL I.5mM的TMB溶液、19yL 3.3M的H2O2溶液，震荡均匀后测定反应20min时650nm处的吸光值。由此方法获得Cu2+的检测标准曲线如图2所示，检测灵敏度可达到10.011]\1，检测线性范围为20-50011]\1。
[0077](5)自来水中Cu2+的检测:将自来水用0.22μπι微孔过滤膜过滤。参照上述步骤(1)-
(3)方法，即可完成自来水中Cu2+的检测，样品中Cu2+的浓度参照步骤⑷所建立的标准曲线计算得到。
[0078]另外，参照步骤(1)-(4)的操作及基本相同的反应条件，还对其它金属离子进行了比对性的检测，其最终检测结果可参阅图3(其中铜离子浓度为200nM，其他金属离子浓度均为ΙΟΟμΜ)。
[0079]实施例2
[0080](I)利用柠檬酸钠还原法合成平均粒径为30nm的金纳米粒子溶液，取30mL合成的金纳米溶液(2nM)和10mL，2.0mM六氯铂酸钾(K2PtCl6)混合于洁净的锥形瓶里置于磁力搅拌器上搅拌并加热至80 0C，然后向混合溶液中缓慢加入1mL，1mM的还原剂-抗坏血酸，溶液颜色由酒红色逐渐变为棕色，使混合溶液保持80°C继续搅拌30min以保证溶液中的1(2?比16完全被还原，即得到粒径约为40nm的金核铀壳纳米粒子。
[0081 ] (2)将10ul，100yM半胱氨酸溶液、70ul —系列不同浓度的铜离子溶液(0-500nM)(含10mM磷酸盐缓冲溶液)依次加入到酶标板中，充分混合后室温下孵育30min;
[0082](3)将步骤(I)中得到的金核铂壳纳米溶液稀释200倍，取20ul加入步骤(2)中的混合溶液中，充分混合后室温下孵育20min;
[0083](4)向步骤(3)中孵育好的混合溶液中依次加入52yL柠檬酸檬酸钠缓冲溶液(0.04M，pH 4.0)、29yL 1.0mM的TMB溶液、19yL 2.2M的H2O2溶液，震荡均匀后测定反应20min时650nm处的吸光值。依据本实例所获得Cu2+的检测结果，亦可得出与实施例1相近之标准曲线。
[0084](5)自来水中Cu2+的检测:将自来水用0.22μπι微孔过滤膜过滤。参照上述步骤(1)-⑶的操作，即可完成自来水中Cu2+的检测，样品中Cu2+的浓度参照(4)所建立的标准曲线计算得到。
[0085]应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种铜离子检测方法，其特征在于包括: (1)将可能含有铜离子的测试样品与半胱氨酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，并在室温下孵育30min以上； (2)向步骤(I)最终所获混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成第二混合体系，并在室温下孵育1min以上； (3)向步骤(2)最终所获混合体系中加入柠檬酸钠和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第三混合体系，并在室温下反应1min以上，通过测定最终所获混合物在可见光波段的吸光值，从而实现对测试样品中铜离子的检测。2.根据权利要求1所述的铜离子检测方法，其特征在于:所述金核铂壳纳米粒子的粒径为21-40nm，其中金核的尺寸为15-30nm，铂壳的厚度为3-5nm。3.根据权利要求1所述的铜离子检测方法，其特征在于:所述过氧化物酶的特征底物包括3，4_二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2，2_联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐中的任意一种或两种以上的组合。4.根据权利要求1所述的铜离子检测方法，其特征在于: 所述第一混合体系中所含半胱氨酸的浓度为5-25μΜ; 和/或，所述第二混合体系中所含金核铂壳纳米粒子的浓度为1-1OpM; 和/或，所述第二混合体系中所含过氧化物酶的特征底物的浓度为0.1mM-10.0mM。5.根据权利要求1所述的铜离子检测方法，其特征在于:所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为.5.0-8.0ο6.根据权利要求1-5中任一项所述的铜离子检测方法，其特征在于包括:1、 i)将一系列不同浓度的标准铜离子溶液、半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合形成一系列第一混合体系，在室温下孵育30min以上； ?)向步骤i)最终所获的一系列混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成一系列第二混合体系，并在室温下孵育1min以上； iii)向步骤H )最终所获的一系列混合体系中依次加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，并均匀混合形成第三混合体系，反应1min以上，再分别测定各混合反应物在可见光波段的吸光值，据此建立铜离子浓度-吸光值标准曲线； Π、 a)将测试样品、半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合形成第一混合体系，在室温下孵育30min以上； b)向步骤a)最终所获的混合体系中加入金核铂壳纳米粒子，充分混合形成第二混合体系，并在室温下孵育1min以上； c)向步骤b)最终所获的混合体系中依次加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，并均匀混合形成第三混合体系，反应1min以上，再测定混合反应物在可见光波段的吸光值，并依据前述铜离子浓度-吸光值标准曲线，测得测试样品中的铜离子浓度。7.根据权利要求6所述的铜离子检测方法，其特征在于:所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-5.0。8.一种铜离子检测试剂盒，其特征在于包括: 过氧化物酶的特征底物， 金核铂壳纳米粒子，用以催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物， 半胱氨酸， 以及，辅助试剂，包含适于使铜离子催化氧化半胱氨酸形成胱氨酸的缓冲液，以及适于使所述金核铂壳纳米粒子催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物的、且适于使所述金核铂壳纳米粒子与半胱氨酸相互作用的缓冲液。9.根据权利要求8所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于: 所述金核铂壳纳米粒子的粒径为21_40nm，其中金核的尺寸为15-30nm，铂壳的厚度为.3-5nm； 和/或，所述过氧化物酶的特征底物包括3，4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐中的任意一种或两种以上的组合。10.根据权利要求9所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于:所述辅助试剂包括pH值为.5.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液，以及，pH值为4.0-5.0的柠檬酸钠缓冲溶液的。
【文档编号】G01N21/76GK105891189SQ201610204752
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】彭池方, 潘娜, 朱妍, 王丽英
【申请人】江南大学