一种时间分辨荧光检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种时间分辨荧光检测方法，把特异反应体系的一株生物原料包被在磁珠上，将包被生物原料的磁珠与被测样本反应，清洗后加入另一株已标记β－二酮类稀土配合物的特异性生物原料，发生免疫反应，使磁珠、被测样本和荧光示踪物形成复合物，清洗后再加入荧光增强物，最后用时间分辨荧光仪检测，获得被测样本的浓度等信息。本方法可实现时间分辨荧光法半自动、全自动系统（即随机系统）检测，能解决解离增强镧系元素荧光免疫分析技术的不足之处，提高时间分辨荧光分析法的应用和推广。
【专利说明】
一种时间分辨荧光检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种时间分辨荧光检测方法。
【背景技术】
[0002] 时间分辨焚光免疫分析(Timeresolved Fluoroimmunoassay，TRFIA)是一种非同 位素免疫分析技术，它把镧系元素和配基结合起来形成螯合物，这些螯合物的发光特点，荧 光寿命较长，可达1~2ms，同时有很强的焚光效率，能够满足测量要求。时间分辨焚光分析 法，是关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波 长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵 敏度。
[0003] 目前市场上产品均是采用解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay DELFIA)是时间分辨焚光分析中的一种。它米 用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕(Eu 3+)连接，另一端与抗体/抗原分子上的 自由氨基连接，形成Eu3+标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复 合物在水中的荧光强度非常弱，因此需加入一种解离增强液，首先把Eu 3+从复合物上解离下 来，然后自由Eu3+与解离增强液中荧光增强物(螯合剂)螯合进入胶束的疏水内核，使Eu 3+的 荧光成行万倍增加。采用这种解离增强步骤分析方法，被称为解离增强镧系元素荧光免疫 分析。
[0004] 时间分辨荧光分析法(TRFIA)实际上是利用了发射荧光的波长与其激发光波长的 巨大差异(Stokes位移较大)克服了激发光对发射荧光的背景影响，由于Eu 3+和其配基形成 的螯合物的发射荧光的波长在很狭窄光谱范围内，同时，其荧光寿命又较长，这样特点就解 决激发光的杂散光和外界短寿命光对发射荧光影响，从而大幅度提高了光学分析的灵敏 度。因此TRFIA具有很高的分析灵敏度、宽阔的测量范围、优良的分析精密性和对多个待测 物同时检测的能力，成为方法学上颇具优势的非放射免疫分析技术之一。
[0005] 时间分辨荧光分析是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超 灵敏度检测技术，它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电 化学发光的非直接标记等缺点。使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信 噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存 时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干 扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑。
[0006] 随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，时间分辨荧光分析法 (TRFIA)具有越来越大的应用空间，但是目前市场上还没有时间分辨荧光分析法全自动检 测系统（即随机系统），因此影响这种检测方法的进一步应用和推广。这是由于目前大家均 是采用解离增强镧系元素荧光免疫分析法(DELFIA)，DELFIA系统的使用原理是采用解离增 强液需把标记Eu 3+解离下来，再增强镧系元素的长寿命荧光，由于解离增强液内有较强的酸 性和较强的离子强度，影响全自动检测系统中包被载体磁珠的单分散性，从而影响检测结 果，也在方法学上限制其使用和推广。
[0007] 发明专利CN201310168516.2，公开了一种新型的f3-二酮类稀土配合物及其制备 方法，以大分子二酮类为母体原料，然后将其在协同配体邻菲罗啉的作用下与稀土离子 进行配位得到新型的二酮类大分子稀土配合物。该专利的荧光材料作为有机电致发光材 料主要应用于彩电行业，缺乏与蛋白接合的基团，不能应用于免疫检测领域。
[0008] 发明专利CN201110287991.2,公开了一种纳米微球时间分辨荧光探针，为一高分 子材料包裹稀土元素荧光配合物的纳米微球，其特征在于稀土元素荧光配合物包括下列摩 尔比的物质:稀土元素离子二酮体类螯合剂:荧光增强协同剂=1:4:5,其中所述稀土元 素离子为Eu 3+和其他镧系离子以100:1-1000:1摩尔比的双掺混合物。该专利的时间分辨荧 光探针为乳胶纳米微球，精密性较差，线性也较差，只适用于快速诊断行业。
【发明内容】
[0009] 本发明为了克服上述技术问题，提供了一种时间分辨荧光检测方法。可实现时间 分辨荧光法半自动、全自动系统（即随机系统)检测，能解决解离增强镧系元素荧光免疫分 析技术的不足之处，提高时间分辨荧光分析法的应用和推广。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下： 一种时间分辨荧光检测方法，包括以下步骤： 1) 把特异性生物原料包被在磁珠上； 2) 用0-二酮类稀土配合物作为荧光示踪物，标记到另一特异性生物原料上，备用； 3) 将1)所得包被特异性生物原料的磁珠与被测样本反应，清洗磁珠，加入2)所得被标 记的另一特异性生物原料，反应后，清洗磁珠； 4) 向反应体系中加入荧光增强物，用时间分辨荧光仪检测反应体系中标记物的荧光， 获得被测样本信息。
[0011] 本发明用于包被磁珠和标记荧光示踪物的生物原料为细胞、包涵体、蛋白质（抗 原、半抗原、抗体等）、氨基酸、多肽、核苷酸、有机化合物及其它有特异反应的任何体系。 整个特异生物反应过程如下：首先把特异反应体系的一株生物原料包被在磁珠上，将 包被生物原料的磁珠与被测样本反应，清洗后加入另一株已标记0-二酮类稀土配合物的 特异性生物原料，发生免疫反应，使磁珠、被测样本和荧光示踪物形成复合物，清洗后再加 入荧光增强物，最后用时间分辨荧光仪检测，获得被测样本的浓度等信息。
[0012] 将生物原料包被在磁珠上是指以下两种包被方式:一种直接把生物原料通过化学 反应，用化学键方式连接到磁珠上；另一种方式是磁珠表面先包被链亲和素(亲和素，抗生 物素单抗），特异反应体系中的一株生物原料标记生物素，最后通过生物素和链亲和素(或 抗生物素单抗)反应，把反应体中的一株生物原料包被在磁珠上。
[0013] 将0-二酮类稀土配合物作为荧光示踪物标记在另一株生物原料方式有两种；一 种是直接把荧光材料通过化学键与生物原料连接起来，另一种方式是，把荧光材料通过化 学键与链亲和素(或亲和素)连接起来，在生物原料标记生物素，最后荧光材料通过生物素 与键亲和素反应，把生物材料连接起来。
[0014] 本发明所述的e-二酮类稀土配合物为Eu3+与0-二酮类化合物的配合物。
[0015] 优选地，所述的0-二酮类化合物为四齿0-二酮类化合物。
[0016] 进一步优选地，所述的四齿0-二酮类化合物为4,4'_双（l'，r，r，2'，2'，3'，3'-七氣_4'，6'-己二酬基)氣横基-邻-二联苯(BHHCT)、1，10-双-(8'-氣横基噻吩基_4，4_5， 5，-6,6-7,7_ 全氟 _1，3,8，10)_ 葵四酮(BCT0T)或者 1，10_ 双 _(8'_ 氯磺基二联苯基 _4,4，_5， 5，-6，6-7，7-全氟-1，3，8，10)-葵四酮(BCD0T)。以上四齿-二酮类化合物具有能够连接蛋 白的基团。
[0017] 进一步优选地，当0 -二酮类化合物为四齿0-二酮类化合物时，荧光增强物为三 正辛基氧膦(T0P0)、邻菲罗啉(phen)和表面活性剂。
[0018] 进一步优选地，所述的表面活性剂为Triton x 100、Tween 20或者Tween 40〇 [0019]进一步优选地，步骤4)中的荧光增强体系为25mM的磷酸缓冲液，其中含三正辛基 氧勝5-10111〇1凡、邻菲罗啉5-101]1〇1凡、1'1'；[1:011叉 100 0.15%(质量分数）411为7.5。
[0020] 优选地，所述的0-二酮类化合物为二齿二酮类化合物。
[0021] 进一步优选地，所述的二齿二酮类化合物为4,7_双氯磺酸基苯基-1，10-菲咯 啉 _2,9_二羧酸(80?0八）。
[0022]进一步优选地，当0-二酮类化合物为二齿二酮类化合物时，步骤4)中的荧光增 强物为含钇的荧光增加体系；所述的荧光增强体系为25mM的磷酸缓冲液，其中含钇Y3+ 5-10mol/L、三正辛基氧膦5-10mol/L、噻吩甲酰三氟丙酮5-10mol/L、Triton x 100 0.15%(质 量分数），pH为7.0~8.0。
[0023]本发明检测方法反应体系的反应场所是在反应杯中，它可以是酶标板或管式反应 器内，反应过程在一定温、湿度条件下（18°〇30°(：范围内），摇动、振荡或旋转磁场下进行。 [0024]本发明的有益效果在于： 1、本发明的反应体系从加样、反应、清洗到报告检测结果全过程可实现自动化，也适用 于半自动时间分辨荧光检测系统。它可以应用于检测生物活性物质和生物样品免疫分析， 如内分泌激素的检测、肿瘤标志物的检测、抗体检测、病毒抗原分析、药物代谢分析以及各 种体内或外源性超微量物质的分析，也可以用于核酸探针分析和细胞活性分析、生物大分 子分析。
[0025] 2、目前的时间分辨荧光检测均采用解离增强方式，由于解离增强体系中增强液会 使磁珠团聚，从而影响磁微珠的单分散性，因此，无法实现时间分辨荧光检测的自动化和半 自动化。本发明首次将磁珠包被生物原料技术用于时间分辨荧光检测，无需解离增强关系， 没有磁珠团聚现象。填补了时间分辨在全自动化系统检测的空白。
[0026] 3、现有的的四齿0-二酮类化合物和二齿二酮类化合物作为荧光示踪物，在使 用过程中由于荧光发光效率不高，很少被使用。本发明采用的荧光增强体系解决了发光效 率不高的问题，且无需解离增强关系，实现了时间分辨的全自化。
【附图说明】
[0027] 图1为实施例6中促甲状腺激素的工作曲线。
[0028] 图2为实施例7中促甲状腺激素的工作曲线。
【具体实施方式】
[0029]下面结合【具体实施方式】对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
[0030] 实施例1 一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:包括以下步骤： 1) 把特异性生物原料包被在磁珠上； 2) 用0-二酮类稀土配合物作为荧光示踪物，标记到另一特异性生物原料上，备用； 3) 将1)所得包被特异性生物原料的磁珠与被测样本反应，清洗磁珠，加入2)所得被标 记的另一特异性生物原料，反应后，清洗磁珠； 4) 向反应体系中加入荧光增强物，用时间分辨荧光仪检测反应体系中标记物的荧光， 获得被测样本信息。
[0031] 实施例2 本实施例在实施例1的基础上： 所述的0-二酮类化合物为4,4'_双（1'，1'，1'，2'，2'，3'，3'_七氟-4'，6'_己二酮基） 氯磺基-邻-三联苯(BHHCT)。
[0032]步骤4)中的荧光增强物为25mM的磷酸缓冲液，其中含三正辛基氧膦5mol/L、邻菲 罗啉5111〇1/1、1^^〇11叉 40 0.15%，？11为7.5。
[0033] 实施例3 本实施例在实施例1的基础上： 所述的0-二酮类化合物为1，10-双_(8 ' -氯磺基噻吩基-4，4-5，5，-6，6-7，7-全氟-1， 3,8，10)_ 葵四酮(BCT0T)。
[0034]步骤4)中的荧光增强物为25mM的磷酸缓冲液，其中含三正辛基氧膦10m〇l/L、邻菲 罗啉10111〇1/1、1^^〇11叉 100 0.15%，？11为7.5。
[0035] 实施例4 本实施例在实施例1的基础上： 所述的0-二酮类化合物为1，10-双_(8 ' -氯磺基二联苯基-4，4，-5，5，-6，6-7，7-全氟-1，3,8，10)_ 葵四酮(BCD0T)。
[0036]步骤4)中的荧光增强物为25mM的磷酸缓冲液，其中含三正辛基氧膦6mol/L、邻菲 罗啉6111〇1/1、1^^〇11叉 20 0.15%，？11为7.5。
[0037] 实施例5 本实施例在实施例1的基础上： 所述的0-二酮类化合物为4，7-双氯磺酸基苯基-1，10-菲咯啉-2，9-二羧酸。
[0038]步骤4)中的荧光增强物为25mM的磷酸缓冲液，其中含钇Y3+ 5-10m〇l/L、三正辛基 氧膦5-10mol/L、噻吩甲酰三氟丙酮5-10mol/L、Triton x 100 0.15%，pH为7.5。
[0039] 实施例6 采用四齿二酮类化合物，用增强荧光反应体系检测促甲状腺素 具体工艺方法如下： 1. 1、把抗人TSH的亚单元单克隆抗体包被磁珠上。
[0040] 把lmg的抗人TSH 亚单元单克隆抗体(购于Mitsubishi chem. Co.)用pH8.0的 0.05M硼酸缓冲溶液，2~8 °C透析四次，最后取出体积不超过lml。
[0041]把10ml的粒径2微米（固含量2%)表面带羧基的磁微粒用磁铁吸在某一位置，吸出 上清液，取5毫升25mM MES缓冲液(pH7.4)溶解，再加入混合均匀后加入5毫克NHS(N-羟基琥 珀酰亚胺)活化剂和2~5毫克EDC(碳二亚胺)活化剂，并充分搅拌30分钟；把活化后的磁珠 用磁铁吸住，把上清液吸走，然后加入2毫升硼酸缓冲液(pH8.2)。
[0042]把透析好的抗人TSH的亚单元单克隆抗体放入活化的磁珠，低温振荡反应24小 时后，用磁铁吸住，把上清液吸出，再注入10微升1%BSA封闭液，室温下振荡封闭12小时后， 磁铁吸住，把上清液吸出，最后把稀释液加入，2~8 °C低温贮存 1.2、把四齿0-二酮类化合物(BHHCT)和Eu3+的螯合物标记在抗人-TSH的a-亚单元单 克隆抗体 BHHCT-Eu3+的结构式如下：
首先把lmg抗人-TSHa-亚单元单克隆抗体(购于Mitsubishi chem. Co.)用pH9.2的 0.05M碳酸缓冲溶液，2~8°C透析四次。加入0.2~0.5mg的BHHCT-Eu3+低温反应1~4小时。
[0043] 用Sephadex G-50柱层析分离标记了BHHCT-Eu3+的单抗和没在标记的单抗，用蛋白 仪区分不同分子量的蛋白，同时检定标记到单抗的BHHCT-Eu 3+的比例。
[0044] 1.3、配制荧光增强液 配制10-5mol的三正辛基氧膦(T0P0)、0.05%的表面活性剂Triton X-100、0.025M磷酸 缓冲液(PH7.5)配制荧光增强液。
[0045] 1.4、促甲状腺素试剂盒的制备 配制TSH标准品：配制TSH标准溶液，具体浓度分别是0、0.09、0.84、4.4、22.5、115 mlU/ L〇
[0046] 把1.1制备的抗人TSH 亚单元单克隆抗体标记的磁珠和1.2标记BHHCT-Eu3+的抗 人-TSH的a-亚单元单克隆抗体分浓度调试，确定最合适的配比，然后与TSH标准品组合在一 起，反应过程如下，取一定量的1.1制备的抗人TSH 亚单元单克隆抗体标记的磁珠放入管 式反应器中加入标准品反应，旋转磁场反应1小时后，用电磁场分离磁珠，上清液取走，清 洗，再加入1.2标记BHHCT-Eu 3+的抗人-TSH的a-亚单元单克隆抗体，旋转磁场反应1小时后， 用电磁场分离磁珠，上清液取走，清洗，加入1.3制备的荧光增强液，旋转磁场振荡5分钟检 测。依次把剩下的五个标准品反应，检测，测定条件为:激发波长340nm;接收波长615nm; 迟延时间0.2ms;窗口时间0.4ms;循环时间1.0ms。结果如下：促甲状腺素的工作曲线见 图1，该工作曲线具有较好的线性，结合表1数值和图1可知，该检测方法具有较好的灵敏度， 且实现了荧光检测的自动化。
[0047] 表1时间分辨荧光免疫检测法测定促甲状腺素
实施例7 采用二齿二酮类化合物，增强荧光反应体系检测促甲状腺素 具体工艺方法如下： 2.1、把抗人TSH的亚单元单克隆抗体包被磁珠上(按1.1操作）。
[0048] 2.2、把二齿0-二酮类化合物(8〇?〇44113+)标记链亲和素上 BCPDA-Eu 3+的结构式如下：
首先把lmg链亲和素用pH9.2的0.05M碳酸缓冲溶液，2~8°C透析四次。加入0.2~0.5mg 的二齿二酮类Eu3+螯合物(BCPDA-Eu3+)低温反应1~4小时。
[0049] 用Sephadex G-50柱层析分离标记了BCPDA-Eu3+的单抗和没在标记的单抗，用蛋白 仪区分不同分子量的蛋白，同时检定标记到单抗的BCPDA-Eu 3+的比例。
[0050] 2.3、把长臂生物素标记在抗人-TSH的a-亚单元单克隆抗体 首先把11^的抗人4511的€ [-亚单元单克隆抗体在4-8°(：0.謂的？85溶液(？11约8.3，含 0.9%NaCl，不含NaN3)透析四次，取样抗体浓度不低于0.5 mg/ml。
[00511用N，N-二甲基甲酰胺溶解活化的长臂生物素（Sigma)成10mg/ml;该溶液在使用前 半小时内配制，取一定量的生物素溶液(使生物素与抗体的质量比为1:2)，在磁搅拌下逐滴 加入抗人-TSH的a-亚单元单克隆抗体溶液中，搅拌反应5min后于4~8°C静置60min。
[0052] 将反应混合溶液对4~8°C 0.1M的PBS(PH约7.4，含0.9%NaCl，含有NaN3)透析6 次，取出生物素标记抗体，加入BSA(进口）使BSA含量为0.1%(W/W)，于2-8 °C或-20 °C保存。 [0053] 2.4、配制共荧光增强液 配制HT5摩尔浓度的三正辛基氧膦(T0P0)、1(T5摩尔浓度的二酮类化合物如萘甲 酰三氟丙酮(P-NTA)(或噻吩甲酰三氟丙酮（TTA))、表面活性剂Triton X-100(或Tween 20)、10%的乙醇和25mM磷酸(pH7.2)缓冲液、10_5摩尔浓度钇(Y)离子组成。
[0054] 2.5、促甲状腺素试剂盒的制备 配制TSH标准品：配制TSH标准溶液，具体浓度分别是0、0.09、0.84、4.4、22.5、115 mlU/ L〇
[0055] 把2.1制备的抗人TSH 亚单元单克隆抗体标记的磁珠、2.2标记BCPDA-Eu3+的链 亲和素和2.3标记长臂生物素的抗人-TSH的a-亚单元单克隆抗体分浓度调试，确定最合适 的配比，然后与TSH标准品组合在一起，反应过程如下，取一定量的2.1制备的抗人TSH的0-亚单元单克隆抗体标记的磁珠放入管式反应器中加入标准品反应，旋转磁场反应1小时后， 用电磁场分离磁珠，上清液取走，清洗，再加入2.3标记长臂生物素的抗人-TSH的a-亚单元 单克隆抗体，旋转磁场反应1小时后，用电磁场分离磁珠，上清液取走，清洗，加入2.2标记 BCPDA-Eu 3+的链亲和素反应10分钟，用电磁场分离磁珠，上清液取走，清洗，最后加入2.4制 备的共荧光增强液，旋转磁场振荡5分钟检测。依次把剩下的五个标准品反应，检测，测定条 件为：激发波长340nm;接收波长615nm;迟延时间0.2ms;窗口时间0.4ms;循环时间 1.0ms。结果如下:促甲状腺素的工作曲线见图2,该工作曲线具有较好的线性，结合表2数值 和图2可知，该检测方法具有较好的灵敏度，且实现了荧光检测的自动化。
[0056]表2时间分辨荧光免疫检测法测定促甲状腺素
本发明的时间分辨荧光检测实现了荧光检测的自动化，该自动化检测方法如下： 待检测样本溶液中含包被了时间分辨荧光标记物的磁微球，将待检测样本溶液分成等 量的若干份，分批次汇聚磁微球并进行荧光标记物时间分辨荧光的检测，得到多次检测的 统计结果，从而完成对整个样本溶液中荧光标记物的含量检测；单次时间分辨荧光检测的 步骤如下： 1) 在两端开口的石英管中持续通入样本溶液，同时启动激发光光源，石英管的一侧设 置电磁铁，在电磁铁的磁场作用下，使流动溶液中的磁微球驻留在电磁铁的前端，随着液体 的流动，石英管内的磁微球汇集数量不断增加，形成汇集点； 2) 停止通入样本溶液，光线通过激发光路聚焦在汇集点的磁微球上，经至少10微秒后 关闭激发光光源;再经10-2000微秒的设定时间后，收集磁微球结合的焚光标记物的时间分 辨荧光信号，并转换为电信号，进行时间分辨荧光标记物的含量检测。
[0057]磁微球的自动化检测具有以下优点： 1、通过电磁铁将磁微球聚集在检测区域，使磁微球在检测区域的浓度提高了成千倍， 荧光标记物的荧光强度则可提高上万倍，而溶液中的杂质所产生的背景干扰信号不会被增 强，有效消减由于清洗不彻底对检测结果带来的干扰。
[0058] 2、常规反应试验清洗的目的是减少杂质，提高荧光标记物与背景信号占比；自动 化检测通过提高磁微球密度，提高荧光标记物与背景信号占比，来提高实验精度，特别适用 于免清洗的反应体系检测荧光标记物含量。
[0059] 3、将反应池的液体样本分成若干份，分别依次进行荧光标记物检测，用多次的检 测结果的统计值，代替对反应池中荧光标记物进行一次检测的常规方法，提高了反应池的 检测准确性，减少系统检测波动。
【主权项】
1. 一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:包括以下步骤： 1) 把特异性生物原料包被在磁珠上； 2) 用β-二酮类稀土配合物作为荧光示踪物，标记到另一特异性生物原料上，备用； 3) 将1)所得包被特异性生物原料的磁珠与被测样本反应，清洗磁珠，加入2)所得被标 记的另一特异性生物原料，反应后，清洗磁珠； 4) 向反应体系中加入荧光增强物，用时间分辨荧光仪检测反应体系中标记物的荧光， 获得被测样本信息。2. 根据权利要求1所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:所述的β-二酮类 稀土配合物为Eu3+与β-二酮类化合物的配合物。3. 根据权利要求2所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:所述的β-二酮类 化合物为四齿β-二酮类化合物。4. 根据权利要求3所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:所述的四齿β-二 酬类化合物为4，4'-双（1 '，1'，1'，2'，2'，3'，3'h氣_4'，6'-己二酬基)氣横基-邻-二联 苯、I，10-双-(8 ' -氯磺基噻吩基-4，4-5，5，-6，6-7，7-全氟-1，3，8，10)-葵四酮或者1，10_ 双 _(8 ' -氣横基二联苯基 _4，4，_5，5，_6，6-7，7_全氣-1，3，8，10)-奏四酬。5. 根据权利要求3所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:步骤4)中的荧光增 强物为含三正辛基氧膦、邻菲罗啉和表面活性剂的荧光增强体系。6. 根据权利要求5所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:所述的表面活性剂 为Triton X IOCKTween 20或者Tween 40〇7. 根据权利要求5所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:所述的荧光增强体 系为25mM的磷酸缓冲液，其中含三正辛基氧膦5-10mol/L、邻菲罗啉5-10mol/L、Triton X 100 0·15%，ρΗ为7.0~8.0。8. 根据权利要求2所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:所述的β-二酮类 化合物为二齿二酮类化合物。9. 根据权利要求8所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于:所述的二齿β-二酮 类化合物为4，7-双氯磺酸基苯基-1，10-菲咯啉-2，9-二羧酸。10. 根据权利要求9所述的一种时间分辨荧光检测方法，其特征在于：步骤4)中的荧光 增强物为含钇的荧光增加体系；所述的荧光增强体系为25mM的磷酸缓冲液，其中含钇Y 3+ 10-5mol/L、三正辛基氧膦5-10mol/L、i3-噻吩甲酰三氟丙酮(或β-萘甲酰三氟丙酮）10- 5mol/ UTriton X 100(或Tween 20、Tween 40)0.15%，2~20%的乙醇，25禮的磷酸缓冲液。!1为7.0 ~8 · 0〇
【文档编号】G01N21/64GK105911041SQ201610379774
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】吴俊清, 章健, 吴冠英
【申请人】章健, 吴俊清, 吴冠英