非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素的制作方法
【专利摘要】非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素，其特征在于利用噻唑橙对G?四联体构型核酸适配体的特殊识别作用以及核酸适配体与目标物间的特异性结合检测四环素，包括以下步骤：通过圆二色谱测定核酸适配体与目标物结合前后的结构变化；通过测定荧光光谱图观察四环素、核酸适配体、噻唑橙体系的反应；建立基于荧光探针噻唑橙的非标记核酸适配体传感器检测四环素；通过测定荧光光谱图测定所建立的非标记核酸适配体传感器对四环素的选择性；运用所建立的非标记核酸适配体传感器测定实际样品中的四环素。本方法提供了一种对四环素有高选择性，同时又简单、快速、灵敏的检测方法，具有良好的实用价值，便于推广。
【专利说明】
非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素
技术领域
[0001] 非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素，属于分析化学技术领域。
【背景技术】
[0002] 四环素类抗生素作为一种广谱抗生素被广泛地用来控制细菌感染，在动物疾病的 治疗中发挥着举足轻重的作用。其中，四环素因高效性、广谱性和低成本性等特点，已成为 应用最为普遍的一类抗生素。四环素不仅作为药物广泛地应用于人类与动物疾病的预防与 治疗，同时也作为饲料添加剂被大量地使用，用于提高饲料利用效率和促进动物生长。
[0003] 然而，四环素化学性质相对稳定，且具有一定的持久性，造成了其在环境中的残 留，大量研究证实了四环素广泛存在于土壤和生态水中。不仅如此，在动物饲料中过度和不 适当的添加会造成四环素或其降解产物高水平的残留与累积在动物源性食品中，如牛奶、 肉类、鱼类和鸡蛋。
[0004] 当人们摄入带有四环素残留的这些食物，可能会造成牙齿发黄，机体耐药性增强、 过敏反应、胃肠道紊乱以及肝损伤，严重威胁人体健康。
[0005] 因此，为保障人体健康，许多国际组织规定了四环素在食品中的最大残留限量 (MRL)，如美国食品药品管理局、欧盟和联合国食品法典委员会限定牛奶中四环素的MRL分 别为900nM、225nM和100yg/Kg。而我国农业部允许四环素在牛奶中的MRL为100ng/mL。
[0006] 目前，四环素的常用检测方法是色谱分析方法，如毛细管电泳法、高效液相色谱 法、液相色谱一质谱联用法等，这些方法大多需要漫长而复杂的分析过程、昂贵的仪器以及 专业人员的操作，并不适合于现场快速检测。另一种常用的检测方法是酶联免疫吸附法，虽 然其检测灵敏度较高，但是选择性差，且费用较为昂贵。普遍而言，对四环素的筛选与检测 难点在于提高选择性，因为四环素类抗生素具有相似的化学结构，结构上的区别往往只在 于-H和-OH等取代基不同。因此，需要建立一种对四环素有高选择性，同时又简单、快速、灵 敏的检测方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种基于荧光探针噻唑橙建立非标记核酸适配体传感器检 测四环素的方法，以快速、简单、灵敏的检测四环素的残留量。
[0008] 技术问题:非标记核酸适配体传感器检测四环素基于以下原理：
[0009] 噻唑橙在游离状态下几乎没有荧光，当其插入到G-四联体构型的核酸适配体中 后，体系中会发生明显的荧光增强效应;四环素的核酸适配体为G-四联体构型，可使噻唑橙 的荧光强度显著增强。当在噻唑橙-核酸适配体荧光体系中加入目标物四环素后，四环素会 与其核酸适配体发生特异性地结合，从而引起核酸适配体G-四联体构型转变成B-构型，噻 唑橙被释放为游离状态导致荧光强度降低。通过这种荧光强度的变化，可以实现对四环素 的特异性检测。
[0010] 本发明的技术方案：
[0011] 包括以下步骤:通过圆二色谱测定核酸适配体与目标物结合前后的结构变化;通 过测定荧光光谱图观察四环素、核酸适配体、噻唑橙体系的反应;建立基于荧光探针噻唑橙 的非标记核酸适配体传感器检测四环素;通过测定荧光光谱图测定所建立的非标记核酸适 配体传感器对四环素的选择性;运用所建立的非标记核酸适配体传感器测定实际样品中的 四环素。
[0012] (1)通过圆二色谱测定核酸适配体与目标物结合前后的结构变化 [0013]①样品制备
[0014]将四环素的核酸适配体稀释至1虚，取lOOiiL作为样品组放入光径为lcm的比色杯 中；将四环素和四环素核酸适配体分别稀释至5yg/mL和lyM，然后混合涡旋8min使四环素和 核酸适配体充分反应，取1〇〇此混合溶液作为样品组放入光径为lcm的比色杯中；取100此 的三重蒸馏水作为空白组放入另一个lcm的比色杯中。
[0015] ②参数
[0016] 圆二色谱仪型号为PMS 450;光谱值范围为230nm到330nm;扫描速度为100nm/分 钟；带宽为lnm;反应时间为5s，数据间隔为0.2nm。将测得的CD值利用Origin软件进行处理 并作出⑶色谱图。
[0017] (2)通过测定荧光光谱图观察四环素、核酸适配体、噻唑橙体系的反应
[0018] 取四个1.5mL的离心管，编号为a，b，c，d，分别依次加入，a管（35虚的噻唑橙50此， 450yL娃哈哈纯净水），涡旋混合后测定荧光光谱图；b管（35yM的噻唑橙50yL，0.5yM核酸适 配体50yL，400yL娃哈哈纯净水），涡旋混合后测定荧光谱图；c管(35yM的噻唑橙50yL，0.5yM 核酸适配体50yL，500yg/mL四环素50yL，350yL娃哈哈纯净水），先将核酸适配体与四环素涡 旋混合l〇min，然后再加入噻唑橙和娃哈哈纯净水，混合测荧光光谱图；d管（35yM的噻唑橙 50yL，50yg/mL四环素50yL，400yL娃哈哈纯净水），混合后测荧光光谱图。
[0019] (3)建立基于荧光探针噻唑橙的非标记核酸适配体传感器检测四环素
[0020] 向含有50yL 0.5yM的核酸适配体的体系中，分别加入不同浓度的四环素标准溶液 (终浓度分别为：〇 ? 05，0 ? 5，5，10，30，40，50，80，90，100yg/mL)，涡旋混合8min后，在体系中 加入20yM的噻唑橙50此，混合后加入娃哈哈纯净水350yL测定荧光光谱图。根据(F〇-F)与四 环素的浓度的关系建立标准曲线，水溶液中四环素的检出限为2.0 Xl(r3iig/mL，线性范围为 0.05iig/mL-100iig/mL〇
[0021] (4)选择性测定
[0022] 选择实际样品中易出现残留的与四环素结构相似的抗生素进行了选择性实验，分 别为洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、土霉素和氯霉素。首先，分别将四环素、土霉素、氯霉 素、洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星的标准溶液稀释到500iig/mL;其次，将上述500iig/mL的抗 生素溶液各吸取50yL分别加入到含有50yL 0.5yM的核酸适配体的体系中，涡旋混合8min后 加入20yM的噻唑橙50yL，最后加入娃哈哈纯净水350yL混合均匀后测定荧光值。
[0023] (5)实际样品检测:选择牛奶作为实际样品进行检测。
[0024] 吸取4mL的牛奶加入到15mL的离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后加入 2mL 10%的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合lmin后，在温度为20°C的条件下超声15min;然 后，将上述溶液以13000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液转移至另一个15mL的离心管 中，再以10000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液备用。分析中，将提取的上清液稀释20 倍，等分为5份，加入不同浓度的四环素标准溶液进行测定(终浓度分别为：l，10,30,50,70ii g/mL)。根据(F〇-F)与四环素的浓度的关系建立标准曲线，牛奶中四环素的检出限为1.0 X 10-3yg/mL，线性范围为 lyg/mL-70iig/mL。
[0025]本发明的有益效果：
[0026] 本发明建立了一种对四环素有高选择性，同时又简单、快速、灵敏的检测方法，具 有良好的实用价值，便于推广。
【附图说明】
[0027] 图1四环素核酸适配体与四环素结合前(a)与结合后(b)的圆二色谱图；四环素，5y g/mL;四环素核酸适配体，lyM
[0028]图2噻唑橙在不同体系中的荧光光谱图；四环素，50iig/mL;四环素的核酸适配体， 0.05虚;噻唑橙，2虚
[0029] 图3递增浓度的四环素存在时体系中噻唑橙的荧光发射图谱，插图为相应的线性 标准曲线；四环素，0 ? 05iig/mL，0 ? 5yg/mL，5yg/mL，1 Oyg/mL，30iig/mL，40iig/mL，50iig/mL，80ii g/mL，90iig/mL，1 OOyg/mL;四环素的核酸适配体，0 ? 05iiM;噻唑橙，2yM
[0030] 图4体系中噻唑橙的荧光强度降低值(Fo-F)对不同抗生素的信号响应;a，四环素； b，土霉素;c，洛美沙星;d，氯霉素；e，恩诺沙星;f，氧氟沙星;被测抗生素，50iig/mL;四环素 核酸适配体，0.05yM;噻唑橙，2yM
[0031] 图5体系中的噻唑橙在含有递增浓度四环素的牛奶基质中的荧光发射图谱，插图 为相应的线性工作曲线四环素，lyg/mL，10iig/mL，30iig/mL，50iig/mL，70iig/mL ;四环素的核 酸适配体，0.05yM;噻唑橙，2yM
【具体实施方式】
[0032] (1)通过圆二色谱测定核酸适配体与目标物结合前后的结构变化
[0033] 材料/试剂：四环素核酸适配体、四环素均购买于生工生物工程股份有限公司（中 国上海）。
[0034]方法:将四环素的核酸适配体稀释至1處，取100此作为样品组放入光径为lcm的比 色杯中；将四环素和四环素核酸适配体分别稀释至5yg/mL和liiM，然后混合涡旋8min使四环 素和核酸适配体充分反应，取1〇〇此混合溶液作为样品组放入光径为lcm的比色杯中；取100 此的三重蒸馏水作为空白组放入另一个lcm的比色杯中。用型号为PMS 450的圆二色谱仪在 光谱值范围为230nm到330nm、扫描速度为100nm/分钟、带宽为lnm、反应时间为5s、数据间隔 为0 ? 2nm的条件下进行测定圆二色谱图。
[0035] 结果:核酸适配体的结构在与目标物结合前后发生了明显变化，由G-四联体构型 变成了 B-构型。
[0036] (2)由于实验所用的体系受到核酸适配体、噻唑橙浓度的影响，所以需要优化二者 的反应浓度。
[0037] 材料/试剂：四环素核酸适配体购买于生工生物工程股份有限公司（中国上海）；噻 唑橙购买于美国西格玛奥德里奇公司（美国圣路易斯）。
[0038] 方法:取三组1.5mL离心管(每组7个），每组试管编号依次为1-7，均加入20虚的噻 唑橙溶液50此，再依次加入不同浓度的核酸适配体(0.01，0.05,0.25,0.5，1.5,2.5,5處)50 yL，涡旋混合后用娃哈哈纯净水将体系稀释到500yL，测定荧光值，。
[0039] 结果:结果表明，体系中选用核酸适配体浓度0.05yM为最佳。
[0040] 方法:取三组1.5mL离心管(每组10个），每组试管编号依次为1-10，均加入0.5處的 核酸适配体溶液50yL，再依次加入不同浓度的噻唑橙(0.005，0.05，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4， 5yM)50yL，涡旋混合后用娃哈哈纯净水将体系稀释到500yL，测定荧光值。
[0041] 结果:结果表明，体系中选用噻唑橙浓度2yM为最佳。
[0042] (3)建立基于荧光探针噻唑橙的非标记核酸适配体传感器检测四环素
[0043] 材料/试剂：四环素核酸适配体、四环素均购买于生工生物工程股份有限公司（中 国上海）；噻唑橙(购买于美国西格玛奥德里奇公司（美国圣路易斯）。
[0044] 方法：四环素对噻唑橙-核酸适配体体系的荧光猝灭作用方法检测四环素：向含有 50此0.5yM的核酸适配体的体系中，分别加入不同浓度的四环素标准溶液（四环素浓度分 别为0.05，0.5，5，10，30，40，50，80，90，100yg/mL)，涡旋混合8min后，在体系中加入20虚的 噻唑橙50yL，混合后加入娃哈哈纯净水350yL测定荧光光谱图。
[0045] 结果:根据(Fo-F)与四环素的浓度的关系建立标准曲线，水溶液中四环素的检出 限为2 ? 0 X 10-3yg/mL，线性范围为 0 ? 05yg/mL-100yg/mL。
[0046] (4)方法的选择性测定
[0047]材料/试剂：四环素核酸适配体、四环素、土霉素和氯霉素均购买于生工生物工程 股份有限公司（中国上海）；洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和噻唑橙均购买于美国西格玛奥 德里奇公司（美国圣路易斯）。
[0048] 方法:选择实际样品中易出现残留的与四环素结构相似的抗生素进行了选择性实 验，分别为洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、土霉素和氯霉素。首先，分别将四环素、土霉素、 氯霉素、洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星的标准溶液稀释到500yg/mL;其次，将上述500iig/mL 抗生素溶液各吸取50yL分别加入到含有50yL 0.5yM的核酸适配体的体系中，涡旋混合8min 后加入20yM的噻唑橙50yL，最后加入娃哈哈纯净水350yL混合均匀后测定荧光值。
[0049] 结果:结果显示只有加入四环素的体系中出现荧光猝灭效应，即该基于荧光探针 噻唑橙建立的非标记核酸适配体传感器对于实际样品中四环素的检测具有较好的选择性。
[0050] (5)实际样品检测:选择牛奶作为实际样品进行检测
[0051] 材料/试剂：四环素核酸适配体、四环素均购买于生工生物工程股份有限公司（中 国上海）；噻唑橙购买于美国西格玛奥德里奇公司（美国圣路易斯），牛奶购买于当地农场。 [0052] 方法：吸取4mL的牛奶加入到15mL的离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后 加入2mL 10%的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合lmin后，在温度为20°C的条件下超声15min; 然后，将上述溶液以13000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液转移至另一个15mL的离心 管中，再以1 0000转/分钟的转速离心l〇min，吸取上清液备用。分析中，将提取的上清液稀释 20倍，等分为5份，如权利要求5所述的方法，加入不同浓度的四环素标准溶液进行测定(终 浓度分别为：1，10，30，50，70yg/mL)。
[0053]结果:根据(Fo-F)与四环素的浓度的关系建立标准曲线，牛奶中四环素的检出限 为 1.0X 10-3]ig/mL，线性范围为 lyg/mL-70iig/mL。
【主权项】
1. 非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素，其特征在于利用噻唑橙对G-四联体构型 核酸适配体的特殊识别作用以及核酸适配体与目标物间的特异性结合检测四环素的残留 量，包括以下步骤:建立基于荧光探针噻唑橙的非标记核酸适配体传感器检测四环素;测定 所建立的非标记核酸适配体传感器对四环素的选择性;运用所建立的非标记核酸适配体传 感器测定实际样品中的四环素。2. 如权利要求1所述的方法，其中建立基于荧光探针噻唑橙的非标记核酸适配体传感 器检测四环素的步骤如下： 向含有50yL 0.5μΜ的核酸适配体的体系中，分别加入不同浓度的四环素标准溶液，涡 旋混合8min后，在体系中加入20μΜ的噻唑橙50yL，混合后加入娃哈哈纯净水350yL测定荧光 光谱图；噻唑橙的荧光猝灭程度将随着四环素浓度的不同而不同；根据(Fo-F)与四环素的 浓度的关系建立标准曲线，水溶液中四环素的检出限为2.0 X I(T3yg/mL，线性范围为0.05μ g/mL-100yg/mL 〇3. 如权利要求1所述的方法，其中测定所建立的非标记核酸适配体传感器对四环素的 选择性的实验步骤如下:选择实际样品中易出现残留的与四环素结构相似的抗生素进行了 选择性实验，分别为洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、土霉素和氯霉素;首先，分别将四环素、 土霉素、氯霉素、洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星的标准溶液稀释到500yg/mL;其次，将上述 500yg/mL抗生素溶液各吸取50yL分别加入到含有50yL 0.5μΜ的核酸适配体的体系中，涡旋 混合8min后加入20μΜ的噻唑橙50yL，最后加入娃哈哈纯净水350yL混合均匀后测定荧光值； 结果显示只有加入四环素的体系中出现荧光猝灭效应，即该基于荧光探针噻唑橙建立的非 标记核酸适配体传感器对于实际样品中四环素的检测具有较好的选择性。4. 如权利要求1所述的方法，其中所述运用所建立的非标记核酸适配体传感器对实际 样品中四环素的测定步骤如下：首先，进行牛奶样品前处理，吸取4mL的牛奶加入到15mL的 离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后加入2mL10%的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合 Imin后，在温度为20 °C的条件下超声15min;然后，将上述溶液以13000转/分钟的转速离心 IOmin，吸取上清液转移至另一个15mL的离心管中，再以10000转/分钟的转速离心10min，收 集上清液，稀释20倍后分为若干份;然后，加入不同浓度的四环素标准溶液，按照权利要求2 所述的方法，进行测定;根据(FO-F)与四环素的浓度的关系建立标准曲线，牛奶中四环素的 检出限为I ·〇Χ lOig/mL，线性范围为lyg/mL_70yg/mL。
【文档编号】G01N21/64GK105911042SQ201610450706
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】孙春燕, 苏瑞芳, 许景月, 张悦, 吕婧淇
【申请人】吉林大学