一种银杏内酯b含量的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种银杏内酯B含量的检测方法，包括：(1)色谱条件与系统适用性试验；(2)对照品溶液的制备；(3)供试品溶液的制备；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液，注入液相色谱仪，通过高效液相色谱?蒸发光散射检测器(HPLC?ELSD)分析检测其含量，即得。本发明检测方法应用方便快速，结果准确可靠，可以用于银杏内酯B的定性与定量分析，本发明经方法学验证表明，专属性、线性范围、稳定性、重复性、加样回收率等均符合要求。适于工业化生产使用，有较大的应用价值。
【专利说明】
-种银杏内醋B含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及药物检测方法，具体设及中药提取物的检测方法，尤其设及一种银杏 内醋B含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 银杏叶所含化学成分复杂，其中黄酬类和祗类内醋化合物具有重要的药用价值和 市场价值，目前已有许多银杏叶系列产品。随着社会的进步和经济的发展，银杏叶祗类内醋 的重要性越来越受到人们的关注。银杏叶祗类内醋是仅在银杏叶中发现的一类具有特殊结 构及显著药理活性的重要成分，迄今尚未发现存在于其他任何植物中，更重要的是它们具 有独特的药理作用和治疗价值。常见的银杏叶祗类内醋为银杏内醋A、B、C，白果内醋B，均为 强血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)受体括抗剂，它们独特的药理作用 和治疗价值已引起世界范围制药工业的极大兴趣，市场上已有银杏内醋注射液产品。随着 研究的深入，发现银杏内醋B活性最强，药效优于总内醋，银杏内醋B是脂溶性物质，能顺利 通过血脑屏障，银杏内醋B注射液临床试验初步证明，该药可W治疗包括急性缺血性脑梗塞 在内的脑缺血性疾病，有望成为急性脑缺血类疾病治疗药物的新选择。由于银杏内醋B至今 没有公开的质量标准，而质量标准对其含量检测是控制质量的重要项目，因此，研究银杏内 醋B的含量检测方法对银杏内醋B的开发有积极作用。
[0003] 高效液相色谱化PLC)结合蒸发光散射检测器化LSD)的检测方法常用于检测银杏 内醋含量，ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检 ，不受其官能团的影响。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度 或者检测未知物。ELSD灵敏度比示差折光检测器高，对溫度变化不敏感，基线稳定，适合与 梯度洗脱液相色谱联用。《中国药典》2015版一部中对银杏叶祗类内醋含量的测定，W十八 烷基硅烷键合硅胶为填充剂，W正丙醇-四氨巧喃-水（1:15:84)为流动相；用化SD检测。理 论板数按白果内醋峰计算应不低于2500。但是每个样品的检测时间长达45min，因此，不能 满足银杏叶内醋B高效率的测定，需要进一步改进检测方法;发明专利《一种银杏叶提取物 中祗类内醋的检测方法(专利号化2014 1 0321649.3)》，介绍了快速检测银杏内醋含量的 方法，但对银杏内醋B单一成分检测的专属性不好，而且在甲醇溶液里，银杏内醋B单体溶液 更易降解。因此设计针对银杏内醋B单一成分的检测方法有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计专属性好，经济环 保，效率高的银杏内醋B含量的检测方法。
[0005] 本发明提供了 一种银杏内醋B含量的检测方法，
[0006] 本发明方法包括W下步骤：
[0007] (1)色谱条件与系统适用性试验:色谱柱W十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，W有 机相/水相为流动相，梯度洗脱;蒸发光散射检测器检测，理论板数按银杏内醋B峰计算应不 低于4000，各峰分离度大于2.0;
[0008] (2)对照品溶液的制备:精密称取银杏内醋B对照品适量，加含0.1%甲酸的甲醇制 成每1ml含5mg的溶液，摇匀，得5mg/ml胆备液；
[0009] 对照品溶液1的制备精密吸取胆备液2ml至25ml量瓶，加含0.1%甲酸的60%甲醇 水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；
[0010] 对照品溶液2的制备精密吸取胆备液3ml至25ml量瓶，加含0.1%甲酸的60%甲醇 水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；
[0011] (3)供试品溶液的制备:取银杏内醋B约50mg至IOml量瓶，加含0.1%甲酸的甲醇溶 解稀释至刻度，摇匀;精密吸取该溶液Iml至IOml量瓶，加含0.1%甲酸的60%甲醇水溶液稀 释至刻度，摇匀，即得；
[0012] (4)测定法:分别精密吸取对照品溶液1，对照品溶液2,供试品溶液各15山，注入液 相色谱仪，记录色谱图，用外标两点法对数方程分别计算银杏内醋B的含量，即得。
[0013] 本发明方法所述步骤(1):色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶。
[0014] 蒸发光散射检测器的漂移管溫度为55°C~90°C，气体流速1.化/min~4.化/min。
[0015] 流动相为有机相/水相，有机相与水相的体积比为25:75~47:53;有机相为色谱级 甲醇，水相为纯化水;水相和有机相分别含0.05 %~0.3 %甲酸。
[0016] 流动相流速为1.0~2.0mL/min。
[0017] 柱溫箱溫度30°C~55°C。
[001引梯度洗脱程序：
[0019]
[0020] 本发明方法的供试品银杏内醋B通过下列方法制备：
[0021] (该方法参考专利化201310624971.9《一种银杏内醋A与银杏内醋B的精制方法》）
[0022] 取市售银杏叶提取物浸膏(含量标准为总内醋含量>6%，总黄酬含量>24%，银 杏酸含量《lOppmHOOOg，用水2000血稀释至0.5g生药/mL,每次加入1000 ml乙酸乙醋进行 萃取，共萃取S次，合并乙酸乙醋萃取液，于45°C减压浓缩至无溶剂，加入10%乙醇100mL使 浓缩液浓度约为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30%乙醇洗脱树脂除杂，W 除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度IBV/h，再用40%乙醇W同样流速洗脱树 月旨，收集后3BV洗脱液，于45°C减压浓缩至Ig/ml的浸膏，加入500ml 70 %甲醇，加热至溶解， 4°C冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，得到银杏内醋B的粗品，将得到的银杏内醋B粗品 加80%乙醇50ml，加热至溶解，于4°C静置2地，析出结晶，抽滤，结晶于80°C烘干最终得到银 杏内醋B。作为供试品检测银杏内醋B含量。
[0023] 本发明使用的奥泰化SD3300检测器，由于不同型号的化SD使用的理想条件不尽相 同，本发明人针对银杏内醋B的特点，对检测方法的各种重要条件经过了很多次的研究和改 进试验，设计了相适应的HPLC条件和ELSD参数设置，可W准确快速测定银杏内醋B的含量。
[0024] 本发明方法有显著效果：
[0025] (1)通常，在配制银杏内醋B溶液时加入憐酸使其稳定，但是，憐酸的挥发性不好， 导致检测时在图谱中发生干扰。本发明予W改进，配制银杏内醋B溶液时加入适量甲酸，避 免了银杏内醋B在中性溶液中的降解现象，使其稳定性好。延长了银杏内醋B对照品的使用 时间，保证了准确度，尤其当处理大量样品时，能增强样品稳定性，有利于确保检测的稳定 和准确性。
[0026] (2)本发明方法样品配制溶液中有甲酸，流动相中加入甲酸更利于峰形稳定，柱效 提高，在主峰附近基线噪音降低。
[0027] (3)银杏内醋B的含量用外标两点法对数方程计算得到，本发明中，将对照品配制 成不同浓度，进样量相同，作为外标两点对照，若手动进样，有利于减小误差。
[0028] (4)由于流动相进行梯度洗脱时容易发生基线下沉现象，本发明结合具体实际情 况，设计出比较理想的HPLC条件和化SD参数，调节漂移管溫度和气体流速，解决了运些问 题。
[0029] 本发明检测方法应用方便快速，结果准确可靠，可用于银杏内醋B的定性与定量分 析，本发明经方法学验证表明，专属性、线性范围、稳定性、重复性、加样回收率等均符合要 求。适于工业化生产使用，有较大的应用价值。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例W举例的方式给出，并不 构成对本发明的限制。
[0031] 用于实施例的银杏叶提取物购买自市售产品，质量要求符合2015版中国药典"银 杏叶提取物"各项质量标准。
[0032] 仪器:安捷伦1100高效液相色谱仪，C皿MStation工作站，美国奥泰化SD3300蒸发 光散射检测器，梅特勒?托利多化204电子天平，梅特勒?托利多XP205电子天平。
[0033] 试药:银杏内醋B对照品，含量测定用，购买自中国药品生物制品检定所。
[0034] 甲醇:色谱纯；甲酸:分析纯;水：自制双蒸水。
[0035] 样品:银杏叶提取物。
[0036] 实施例1:本发明银杏内醋B样品制备
[0037] 取市售银杏叶提取物浸膏(含量标准为总内醋含量>6%，总黄酬含量>24%，银 杏酸含量《IOppm)1000 g，用水2000血稀释至0.5g生药/mL,每次加入1000 ml乙酸乙醋进行 萃取，共萃取S次，合并乙酸乙醋萃取液，于45°C减压浓缩至无溶剂，加入10%乙醇100mL使 浓缩液浓度约为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30%乙醇洗脱树脂除杂，W 除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度IBV/h，再用40%乙醇W同样流速洗脱树 月旨，收集后3BV洗脱液，于45°C减压浓缩至Ig/ml的浸膏，加入500ml 70 %甲醇，加热至溶解， 4°C冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，得到银杏内醋B的粗品2.15g，将得到的银杏内醋B 粗品加80%乙醇50ml，加热至溶解，于4°C静置24h，析出结晶，抽滤，结晶于80°C烘干最终得 到银杏内醋BI.93g。作为供试品检测银杏内醋B含量。（该银杏内醋B制备方法参考自《一种 银杏内醋A与银杏内醋B的精制方法》(授权专利号化201310624971.9))
[0038] 实施例2本发明银杏内醋B含量检测及专属性研究
[0039] (1)色谱条件与系统适用性试验:色谱柱W十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，W有 机相/水相为流动相，梯度洗脱;蒸发光散射检测器检测，理论板数按银杏内醋B峰计算应不 低于4000，各峰分离度大于2.0;
[0040] (2)对照品溶液的制备:精密称取银杏内醋B对照品适量，加甲醇(含0.1%甲酸)制 成每1ml含5mg的溶液，摇匀，得5mg/ml胆备液；
[0041 ]对照品溶液1的制备精密吸取胆备液2ml至25ml量瓶，加60%甲醇水溶液(含0.1% 甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得。
[0042] 对照品溶液2的制备精密吸取胆备液3ml至25ml量瓶，加60%甲醇水溶液(含0.1% 甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得。
[0043] (3)供试品溶液的制备：取实施例1制得的银杏内醋B约50mg至IOml量瓶，精密称 定，加甲醇（含0.1 %甲酸）溶解稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液Iml至IOml量瓶，加 60 %甲醇水溶液(含0.1 %甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得；
[0044] 同时取适量60 %甲醇水溶液(含0.1 %甲酸)作为空白对照溶液。
[0045] (4)测定法:分别精密吸取对照品溶液1，对照品溶液2,供试品溶液，空白对照溶液 各15iU，注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标两点法对数方程计算银杏内醋B的含量，即 得。
[0046] 分析柱:C18柱，流速ImL/min，柱溫箱溫度45 °C。蒸发光散射检测器条件:漂移管溫 度70°C，气体流速2.化/min.。流动相条件:有机相甲醇(含0.1 %甲酸）与水相(含0.1 %甲 酸），有机相与水相的体积比变化30:70~45:55;梯度洗脱程序 「nrvi7l
LUU48J 结呆显不银否巧鹏B峰化艮巧，对称巧局，埋化巧恢数8500，主峰附化榮侦峰分罔 均达到2.OW上，用外标两点法对数方程计算银杏内醋B的含量为93.9%;空白对照溶液基 线平稳，噪音低，无杂峰，表明该方法专属性良好。
[0049] 实施例3:本发明银杏内醋B含量的检测
[0050] 使用实施例2中所用的对照品和供试品，进样检测：分别精密吸取对照品溶液15y L，注入液相色谱仪，测定，分析柱:C18柱，流动相流速0.7mL/min，柱溫箱溫度，40°C。蒸发光 散射检测器条件：漂移管溫度65°C，气体流速1.8L/min.。流动相条件：有机相甲醇（含 0.05%甲酸)与水相(含0.05%甲酸），甲醇与水的体积比变化25:75~46:54;梯度洗脱程序
L0052J 本方法相对于实施例2,银否内鹏B出峰时同略为延长2分钟，峰形良好，对称性高， 理论塔板数9000，主峰附近杂质峰分离均达到2.5 W上，用外标两点法对数方程计算银杏内 醋B的含量为94.2%。实施例4:本发明银杏内醋B含量的检测
[0053]使用实施例2中所用的对照品和供试品，进样检测：分别精密吸取对照品溶液15y L，注入液相色谱仪，测定，分析柱:C18柱，流动相流速1.2mL/min，柱溫箱溫度，50°C。蒸发光 散射检测器条件:漂移管溫度70°C，气体流速2.化/min.。流动相条件:有机相甲醇(含0.3% 甲酸)与水相(含0.3%甲酸），甲醇与水的体积比变化30:70~47:53;梯度洗脱程序 [0化4]
LUUJJ」 J ,卞民-白-門肖曰〇山山丰叫|口"7哄少-乙'7」-1：了 ,山丰/1夕防3^了 ,WJ仰、|工间心仁 塔板数8000，主峰附近杂质峰分离均达到2. OW上，但基线噪音比实施例2略高，仍在合理范 围内。用外标两点法对数方程计算银杏内醋B的含量为94.5%。
[0056]实施例5比较甲酸对样品溶液稳定性的影响 [0化7]对照品溶液为实施例2使用。
[0058] 含甲酸供试品溶液的制备:取银杏内醋B(实施例1制得)50mg至IOml量瓶，精密称 定，加甲醇（含0.1 %甲酸）溶解稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液Iml至IOml量瓶，加 60%甲醇水溶液(含0.1 %甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得；
[0059] 不含甲酸的供试品溶液制备:取银杏内醋B(实施例2制得)50mg至IOml量瓶，精密 称定，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液Iml至IOml量瓶，加60%甲醇水溶液 稀释至刻度，摇匀，
[0060] 即得；
[0061] 检测方法同实施例2。
[0062] 表1配制溶液中是否加甲酸银杏内醋B含量的结果
[0OA31
[0064] 结果表明：供试品配制溶液中加甲酸，五天后含量与最初一致;供试品溶液中不加 甲酸，五天后含量下降约2%，因此，甲酸有增加样品稳定性的作用，同理也可W延长对照品 的使用时间。
[0065] 实施例6检测方法的线性实验
[0066] 精密量取实施例2中的对照品胆备液，加60%甲醇水溶液(含0.1 %甲酸），分别稀 释成浓度为0.1 mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，Img/ml 的溶液，精密吸取各溶液 15ii L，按实施例2方法检测，W对照品含量(iig)对数值为横坐标，峰面积对数值为纵坐标，经线 性回归；回归方程见下表。
[0067] 表2标准曲线线性回归表 rOOARi LUUU7」 乂州i'|7U M'化巧川人/ /玄口、J /]忍化-I王乂
[0070]取实施例2中的供试品溶液分别于第0，2，4，6，8，2地取15化检测，检测方法同实施 例2，测定峰面积，RSD%为0.89%，表明本发明方法稳定性良好。
[0072]
[0071] 亲3稳吿忡檢测峰而巧结果
[0073]
[0074] 实施例8检测方法重现性实验
[0075] 更换另一试验人员操作，在另外一台液相安捷伦1260和化SD3300上操作。
[0076] 对照品溶液:配制方法同实施例2。
[0077] 供试品溶液:取同一批银杏内醋B(实施例1制得)50mg，精密称定，按照实施例2中 的方法制备。
[0078] 检测方法同实施例2。
[0079] 表4重复检测银杏内醋B含量的结果
[0080]
[Guou 巧术巧化|:议」：：迎/^玄，下1^化0仍-巧白白乂]：埋化，《|]1守巧白白'村^/占、門朋日'日里户」 94.3 %，RSD %为0.43 %。本次检测结果同实施例2中的一致，表明本方法重现性良好。
[0082] 实施例9检测方法回收率实验
[0083] 采用加样回收法，分别精密称取已知含量的银杏内醋B(实施例1制得)25mg，40mg， 50mg，每份3个平行，再分别加入银杏内醋B对照品（购买自中国药品生物制品检定所)5mg， 按照实施例2供试品制备的方法处理，最终定容至lOmL，再精密吸取上述溶液Iml至IOml量 瓶，加60%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得作为供试品溶液，对照品溶液 同实施例2,检测方法同实施例2。
[0084] 表巧日样回收率实验结果
[0085]
[0086] 通过加样回收率实验结果可知：本方法回收率较好，银杏内醋B的平均回收率为 99.3%，RSD 为 1.16%
[0087] 实施例10:比较银杏内醋B含量检测一流动相中不含甲酸
[0088] 使用实施例2中所用的对照品和供试品，进样检测：分别精密吸取对照品溶液15y L，注入液相色谱仪，测定，分析柱:C18柱，流速ImL/min，柱溫箱溫度45°C。蒸发光散射检测 器条件:漂移管溫度70°C，气体流速2.化/min.。流动相条件:有机相甲醇与水相，均不含甲 酸，有机相与水相的体积比变化30:70~45:55;梯度洗脱程序
[0089]
[0090]本实施例方法相对于实施例2,银杏内醋B出峰时间一致，但峰形较差，对称性不及 实施例2好，理论塔板数5000,各峰分离达到2.OW上，但基线噪音比实施例2略高，尤其是主 峰附近，用外标两点法对数方程计算银杏内醋B的含量为93.6%。由此说明，流动相中加入 甲酸，利于提高柱效。
【主权项】
1. 一种银杏内酯B含量的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机 相/水相为流动相，梯度洗脱;蒸发光散射检测器检测，理论板数按银杏内酯B峰计算应不低 于4000,各峰分离度大于2.0; (2) 对照品溶液的制备:精密称取银杏内酯B对照品适量，加含0.1%甲酸的甲醇，制成 每lml含5mg的溶液，摇勾，得5mg/ml|C备液； 对照品溶液1的制备精密吸取贮备液2ml至25ml量瓶，加含0.1%甲酸的60%甲醇水溶 液稀释至刻度，摇匀，即得； 对照品溶液2的制备精密吸取贮备液3ml至25ml量瓶，加含0.1%甲酸的60%甲醇稀水 溶液释至刻度，摇匀，即得； (3) 供试品溶液的制备：取银杏内酯B50mg至10ml量瓶，精密称定，加甲醇（含0.1 %甲 酸)溶解稀释至刻度，摇匀;精密吸取该溶液lml至10ml量瓶，加含0.1 %甲酸的60 %甲醇水 溶液稀释至刻度，摇匀，即得； (4) 测定法:分别精密吸取对照品溶液1，对照品溶液2,供试品溶液各15μ1，注入液相色 谱仪，记录色谱图，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯Β的含量，即得。2. 根据权利要求1所述一种银杏内酯Β含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)色谱 柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶。3. 根据权利要求1所述一种银杏内酯Β含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)蒸发 光散射检测器的漂移管温度为55°C~90°C，气体流速1 .OL/min~4.0L/min。4. 根据权利要求1所述一种银杏内酯B含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)流动 相为有机相/水相，有机相与水相的体积比为25:75~47:53;有机相为色谱级甲醇，水相为 纯化水;水相和有机相分别含0.05%~0.3%甲酸;流动相流速为1.0~2. OmL/min。5. 根据权利要求1所述一种银杏内酯B含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)柱温 箱温度30°C~55°C。6. 根据权利要求1所述一种银杏内酯B含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)梯度 洗脱程序： 时间分钟 有机相％ 水相％ 0 30 70 5 45 55 10 45 55 15 30 70 20 30 70 。7. 根据权利要求1所述一种银杏内酯B含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)供试 品银杏内酯B通过下列方法制备： 取银杏叶提取物浸膏，含量标准为总内酯含量多6%，总黄酮含量多24%，银杏酸含量 SlOppm lOOOg，用水2000mL稀释至Ο · 5g生药/mL，每次加入1000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃 取三次，合并乙酸乙酯萃取液，于45 °C减压浓缩至无溶剂，加入10 %乙醇100ml使浓缩液浓 度约为〇. 5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30 %乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶 性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度lBV/h，再用40%乙醇以同样流速洗脱树脂，收集后 3BV洗脱液，于45 °C减压浓缩至lg/ml的浸膏，加入500ml 70 %甲醇，加热至溶解，4 °C冰箱静 置24h析晶，析出晶体后，抽滤，得到银杏内酯B的粗品，将得到的银杏内酯B粗品加80%乙醇 50ml，加热至溶解，于4°C静置24h，析出结晶，抽滤，结晶于80°C烘干最终得到银杏内酯B，作 为供试品检测银杏内酯B含量。
【文档编号】G01N30/02GK105954432SQ201610562926
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】胡林森, 李丁, 孙蓉, 刘斐, 肖志勇, 吕署, 吕署一
【申请人】上海信谊百路达药业有限公司