一种农药残留快速检测消除假阳性的检测方法
【专利摘要】一种农药残留消除假阳性的快速检测方法属于食品安全领域，具体涉及一种应用于生姜与大蒜农药快速检测的方法。一种农药残留快速检测消除假阳性的检测方法，具体包括以下步骤：步骤a、测试试剂配制，步骤b、样品前处理，步骤C、检测判断；本方法样品提取液经过加热处理，可以消除生姜及大蒜中次生物的干扰；同时提取液经过离心处理可以将色素及或其他固形物除去，减少对检测结果的干扰；此外，样品经绞碎处理，浸提更充分。
【专利说明】一种农药残留快速检测消除假阳性的检测方法 技术领域
[0001] -种农药残留消除假阳性的快速检测方法属于食品安全领域，具体涉及一种应用 于生姜与大蒜农药快速检测的方法。 【背景技术】
[0002] 常用农药中，对人毒性较大，容易引起中毒的是杀虫剂，而在杀虫剂中引起中毒事 件最多的是有机磷和氨基甲酸酯类农药，且这两类农药在实际生产中使用频率较高，这就 对有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测提出了更高的要求。目前，常用的有机磷和氨基 甲酸酯类农药检测方法有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法、 生物传感器法、免疫分析法、酶抑制法等。
[0003] 色谱检测法精度最高，但其检测过程复杂、检测时间长，蔬菜的品种多、来源广，并 且蔬菜的销售要保持新鲜，在流通市场停留的时间短，因此，色谱法很难在蔬菜销售之前完 成检测。而生物传感器法及免疫分析法因前期投入大、实验条件苛刻，当前在中国还仅用于 实验室。酶抑制法以准确性高、检测速度快、操作简单、成本低等优点得到广 泛应用，是现阶段常用的有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测方法，并已成为蔬菜 中有机磷和氨基甲酸酯类农药快速检测的国标方法。
[0004] 但是，酶抑制率法测定某些特别蔬菜中农药残留量存在假阳性，这一点在国家标 准GB/T 5009.199-2003的说明中就明确指出："葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及 番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性"，干扰检测结果，给农产品 质量安全的监管增加难度。
【发明内容】
[0005] 本发明设计了一种生姜及大蒜农药残留的快速检测方法，其目的在于解决酶抑制 率法中检测生姜和蒜中容易出现的假阳性问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 一种农药残留快速检测消除假阳性的检测方法，具体包括以下步骤： 步骤a、测试试剂配制 首先分别配制好需要的试剂为PH8.0磷酸盐缓冲液、显色剂、底物和乙酰胆碱酯酶液， 起配置方法如下： pH7.0-9.0磷酸盐缓冲液：取11.5-12.5g磷酸氢二钾(K2HP04)和3-3.5g磷酸二氢钾 (KH2P04)，溶于1000ml蒸馏水中便得到pH7.0-9.0磷酸盐缓冲液； 显色剂：取140-170mg硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和14.8-16.4mg碳酸氢钠(NaHC03)，用 17-23ml的上述磷酸盐缓冲液溶解，于2-5 °C冰箱保存。
[0007] 底物:取23-27mg硫代乙酰胆碱，加2.6-3.3ml蒸馏水溶解，摇匀后置于3-6°C冰箱 保存。
[0008] 乙酰胆碱酯酶液:根据酶的活性，用缓冲液溶解，摇匀后置于2-5°C冰箱保存。其中 酶液2.5-3.2min的吸光度变化应控制在0.3以上。
[0009] 步骤b、样品前处理 (1) 将选取的l、2-l、5g生姜与l、2-l、5g大蒜用清水冲洗干净，注意不要破坏样本表面 组织； (2) 将经过以上步骤1处理好的生姜与大蒜用绞碎机绞碎，各称取分别绞碎后获得生姜 0.8-1.2g与0.8-1、2g大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸盐缓冲液，充分振荡后，置于90-120°C水浴锅中加热处理，热处理时分开进行，生姜的处理条件是90-120°C持续2-3min，大 蒜的处理条件是80-110°C持续l_2min;将热处理好的提取液放置室温25-28°C保存； (3) :取上步骤2中放置于室温25-28Γ保存的样品，放入离心管中，5000转每分钟的离 心机持续旋转09-1.2 min，处理完成后的清液加以18-20°C保存。
[0010] 步骤C、检测判断 (1)空白对照液测试 取试管加入2-3ml磷酸盐缓冲液，再加入0.09-0.12ml乙酰胆碱酯酶液、0.3-0.5ml显色 剂，摇匀后放置于35-38°C恒温水浴锅存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml底物摇匀，马上 放人分光光度计于400-420nm处测定，记录下反应2.5-3.5min的吸光度变化值Δ A0的数 值。
[0011] (2)样品液测试 取试管加入2-3ml经步骤b3处理好的样品液，再加入0.09-0.12ml乙酰胆碱酯酶液、 0.3-0.5ml显色剂，摇匀后放置于35-38 °C恒温水浴锅存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml 底物摇匀，马上放人分光光度计于400_420nm处测定，记录下反应2.5-3.5min的吸光度变化 值A At的数值。
[0012] (3)计算判断 通过步骤1、2测得Δ A0和Δ At的数值，用以下公式计算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A0 - Zl At]/M A0]X100..................(1) (4) 定性判定 当提取液的抑制率250%时，表示蔬菜中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药存在， 样品为阳性。
[0013] 本发明采用上述技术方案，本方法样品提取液经过加热处理，可以消除生姜及大 蒜中次生物的干扰；同时提取液经过离心处理可以将色素及或其他固形物除去，减少对检 测结果的干扰;此外，样品经绞碎处理，浸提更充分。 【附图说明】 【附图说明】
[0014] 图1为本发明生姜及大蒜中农药残留物的快速检测流程图。 【具体实施方式】
[0015] 实施例1 一种农药残留快速检测消除假阳性的检测方法，具体包括以下步骤： 步骤a、测试试剂配制 首先分别配制好需要的试剂为PH8.0磷酸盐缓冲液、显色剂、底物和乙酰胆碱酯酶液， 起配置方法如下： pH8.0磷酸盐缓冲液:取11.9g磷酸氢二钾(K2HP04)和3.2g磷酸二氢钾(KH2P04)，溶于 1000ml蒸馏水中便得到pH8.0磷酸盐缓冲液； 显色剂:取160mg硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸氢钠(NaHC03)，用17-23ml的 上述磷酸盐缓冲液溶解，于4 °C冰箱保存。
[0016] 底物:取25mg硫代乙酰胆碱，加3ml蒸馏水溶解，摇匀后置于4°C冰箱保存。
[0017] 乙酰胆碱酯酶液:根据酶的活性，用缓冲液溶解，摇匀后置于2-5°C冰箱保存。其中 酶液3min的吸光度变化应控制在0.3以上。
[0018] 步骤b、样品前处理 (1) 将选取的1.3g生姜与1.3g大蒜用清水冲洗干净，注意不要破坏样本表面组织； (2) 将经过以上步骤1处理好的生姜与大蒜用绞碎机绞碎，各称取分别绞碎后获得生姜 lg与lg大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸盐缓冲液，充分振荡后，置于100 °C水浴锅中加 热处理，热处理时分开进行，生姜的处理条件是l〇〇°C持续2-3min，大蒜的处理条件是100°C 持续l-2min;将热处理好的提取液放置室温25-28°C保存； (3) :取上步骤2中放置于室温25-28Γ保存的样品，放入离心管中，5000转每分钟的离 心机持续旋转〇. 9-1.2 min，处理完成后的清液加以18-20 °C保存。
[0019] 步骤C、检测判断 (1)空白对照液测试 取试管加入2.5ml磷酸盐缓冲液，再加入0. lml乙酰胆碱酯酶液、0.4ml显色剂，摇匀后 放置于37°C恒温水浴锅存放18min，再加入0. lml底物摇匀，马上放人分光光度计于412nm处 测定，记录下反应3min的吸光度变化值△ A 〇的数值。
[0020] (2)样品液测试 取试管加入2.5ml经步骤b3处理好的样品液，再加入0. lml乙酰胆碱酯酶液、0.4ml显色 剂，摇匀后放置于35-38°C恒温水浴锅存放18min，再加入0.1ml底物摇匀，马上放人分光光 度计于412nm处测定，记录下反应2.5-3.5min的吸光度变化值Δ A t的数值。
[0021] (3)计算判断 通过步骤1、2测得Δ A0和Δ At的数值，用以下公式计算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A0 - Zl At]/ /1 AO] X 100 (4) 定性判定 当提取液的抑制率250%时，表示蔬菜中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药存在， 样品为阳性。
[0022] 实施例2 一种农药残留快速检测消除假阳性的检测方法，具体包括以下步骤： 步骤a、测试试剂配制 首先分别配制好需要的试剂为PH8.0磷酸盐缓冲液、显色剂、底物和乙酰胆碱酯酶液， 起配置方法如下： PH8.0磷酸盐缓冲液：取11.5g磷酸氢二钾(K2HP04)和3g磷酸二氢钾(KH2P04)，溶于 1000ml蒸馏水中便得到pH8.0磷酸盐缓冲液； 显色剂:取140mg硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和14.8mg碳酸氢钠(NaHC03)，用17ml的上述 磷酸盐缓冲液溶解，于2 °C冰箱保存。
[0023]底物:取23mg硫代乙酰胆碱，加2.6ml蒸馏水溶解，摇匀后置于3°C冰箱保存。
[0024]乙酰胆碱酯酶液:根据酶的活性，用缓冲液溶解，摇匀后置于2°C冰箱保存。其中酶 液2.5min的吸光度变化应控制在0.3以上。
[0025] 步骤b、样品前处理 (1) 将选取的1.2g生姜与.1.2g大蒜用清水冲洗干净，注意不要破坏样本表面组织； (2) 将经过以上步骤1处理好的生姜与大蒜用绞碎机绞碎，各称取分别绞碎后获得生姜 0.8g与0.8g大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸盐缓冲液，充分振荡后，置于90°C水浴锅中 加热处理，热处理时分开进行，生姜的处理条件是90 °C持续2min，大蒜的处理条件是80 °C持 续lmin;将热处理好的提取液放置室温25-28 °C保存； (3) :取上步骤2中放置于室温25-28Γ保存的样品，放入离心管中，5000转每分钟的离 心机持续旋转〇. 9-1.2 min，处理完成后的清液加以18-20 °C保存。
[0026] 步骤C、检测判断 (1)空白对照液测试 取试管加入2ml磷酸盐缓冲液，再加入0.09ml乙酰胆碱酯酶液、0.3ml显色剂，摇匀后放 置于35°C恒温水浴锅存放15min，再加入0.08ml底物摇匀，马上放人分光光度计于400nm处 测定，记录下反应2.5min的吸光度变化值Δ A 〇的数值。
[0027] (2)样品液测试 取试管加入2ml经步骤b3处理好的样品液，再加入0.09ml乙酰胆碱酯酶液、0.3ml显色 剂，摇匀后放置于35-38°C恒温水浴锅存放15min，再加入0.081ml底物摇匀，马上放人分光 光度计于400nm处测定，记录下反应2.5min的吸光度变化值△ A t的数值。
[0028] (3)计算判断 通过步骤1、2测得Δ A0和Δ At的数值，用以下公式计算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A0 - Zl At]/ /1 AO] X 100 (4) 定性判定 当提取液的抑制率250%时，表示蔬菜中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药存在， 样品为阳性。
[0029] 实施例3 一种农药残留快速检测消除假阳性的检测方法，具体包括以下步骤： 步骤a、测试试剂配制 首先分别配制好需要的试剂为PH8.0磷酸盐缓冲液、显色剂、底物和乙酰胆碱酯酶液， 起配置方法如下： pH8.0磷酸盐缓冲液:取12.5g磷酸氢二钾(K2HP04)和3.5g磷酸二氢钾(KH2P04)，溶于 1000ml蒸馏水中便得到pH8.0磷酸盐缓冲液； 显色剂:取170mg硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和16.4mg碳酸氢钠(NaHC03)，用23ml的上述 磷酸盐缓冲液溶解，于2-5 °C冰箱保存。
[0030]底物:取27mg硫代乙酰胆碱，加3.3ml蒸馏水溶解，摇匀后置于6°C冰箱保存。
[0031]乙酰胆碱酯酶液:根据酶的活性，用缓冲液溶解，摇匀后置于5°C冰箱保存。其中酶 液3.2min的吸光度变化应控制在0.3以上。
[0032] 步骤b、样品前处理 (1) 将选取的1.5g生姜与.1.5g大蒜用清水冲洗干净，注意不要破坏样本表面组织； (2) 将经过以上步骤1处理好的生姜与大蒜用绞碎机绞碎，各称取分别绞碎后获得生姜 1.2g与1.2g大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸盐缓冲液，充分振荡后，置于120°C水浴锅 中加热处理，热处理时分开进行，生姜的处理条件是120°C持续3min，大蒜的处理条件是110 °C持续2min;将热处理好的提取液放置室温25-28°C保存； (3) :取上步骤2中放置于室温28°C保存的样品，放入离心管中，5000转每分钟的离心机 持续旋转1.2 min，处理完成后的清液加以18-20°C保存。
[0033] 步骤C、检测判断 (1)空白对照液测试 取试管加入3ml磷酸盐缓冲液，再加入0.12ml乙酰胆碱酯酶液、0.5ml显色剂，摇匀后放 置于35-38°C恒温水浴锅存放20min，再加入0.1 lml底物摇匀，马上放人分光光度计于420nm 处测定，记录下反应2.5-3.5min的吸光度变化值Δ A〇的数值。
[0034] (2)样品液测试 取试管加入2-3ml经步骤b3处理好的样品液，再加入0.09-0.12ml乙酰胆碱酯酶液、 0.3-0.5ml显色剂，摇匀后放置于35-38 °C恒温水浴锅存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml 底物摇匀，马上放人分光光度计于400_420nm处测定，记录下反应2.5-3.5min的吸光度变化 值A At的数值。
[0035] (3)计算判断 通过步骤1、2测得Δ A0和Δ At的数值，用以下公式计算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A0 - Zl At]/ /1 AO] X 100 (4) 定性判定 当提取液的抑制率250%时，表示蔬菜中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药存在， 样品为阳性。
[0036] 检测分析 根据以上3个实施方式的方式，做了以下实验数据比对。
[0037]不同浓度农药液测试验证:在沸水浴加热时间为3min的条件下，验证不同浓度农 药缓冲液与不经加热处理的农药缓冲液测试结果，按照步骤c的检测过程，验证两种条件下 对判定结果一致性;对5种有机磷和氨基甲酸酯类农药验证结果如下表所示。结果表明，两 种情况下对抑制率的检测结果没有显著影响，且在50%抑制率的定性判定线结果完全一致， 因此3min热处理时间对定性判定没有显著影响。
[0038] 注表示一致，-表示不一致
分别抽取生姜和大蒜各5个批次，每个批次取3个不同实施例的处理样品，按照本发明 的检测方法，T1、T 2、T 3分别实施例1、实施例2实施例3的检测方法，检测结果与国标G B / T5009-2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》酶抑制率发对比，并用 气象色谱法做定量验证；用本发明方法检出的30组生姜及大蒜数据，经色谱法验证未出现 过假阳性结果，而国标法则出现11次假阳性结果(如下表所示）。
【主权项】
1. 一种农药残留快速检测消除假阳性的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤： 步骤a、测试试剂配制 首先分别配制好需要的试剂为PH8.0磷酸盐缓冲液、显色剂、底物和乙酰胆碱酯酶液， 起配置方法如下： PH8.0磷酸盐缓冲液：取11 .5-12.5g磷酸氢二钾（K2HP04)和3-3.5g磷酸二氢钾 (KH2P04)，溶于1000ml蒸馏水中便得到pH8.0磷酸盐缓冲液； 显色剂：取14〇-17〇11^硫代二硝基苯甲酸(0了咄)和14.8-16.411^碳酸氢钠(他!^〇3)，用 17-23ml的上述磷酸盐缓冲液溶解，于2-5°C冰箱保存； 底物:取23-27mg硫代乙酰胆碱，加2.6-3.3!111蒸馏水溶解，摇匀后置于3-6°(：冰箱保存； 乙酰胆碱酯酶液:根据酶的活性，用缓冲液溶解，摇匀后置于2-5 °C冰箱保存； 其中酶液2.5-3.2min的吸光度变化应控制在0.3以上； 步骤b、样品前处理 (1) 将选取的1.2-1.5g生姜与.1.2-1.5g大蒜用清水冲洗干净，注意不要破坏样本表面 组织； (2) 将经过以上步骤1处理好的生姜与大蒜用绞碎机绞碎，各称取分别绞碎后获得生姜 0.8-1.2g与0.8-1.2g大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸盐缓冲液，充分振荡后，置于90-120°C水浴锅中加热处理，热处理时分开进行，生姜的处理条件是90-120°C持续2-3min，大 蒜的处理条件是80-110°C持续l_2min;将热处理好的提取液放置室温25-28°C保存； (3) :取上步骤2中放置于室温25-28Γ保存的样品，放入离心管中，5000转每分钟的离 心机持续旋转〇. 9-1.2 min，处理完成后的清液加以18-20 °C保存； 步骤C、检测判断 (1) 空白对照液测试 取试管加入2-3ml磷酸盐缓冲液，再加入0.09-0.12ml乙酰胆碱酯酶液、0.3-0.5ml显色 剂，摇匀后放置于35-38°C恒温水浴锅存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml底物摇匀，马上 放人分光光度计于400-420nm处测定，记录下反应2.5-3.5min的吸光度变化值Δ A0的数 值； (2) 样品液测试 取试管加入2-3ml经步骤b3处理好的样品液，再加入0.09-0.12ml乙酰胆碱酯酶液、 0.3-0.5ml显色剂，摇匀后放置于35-38 °C恒温水浴锅存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml 底物摇匀，马上放人分光光度计于400_420nm处测定，记录下反应2.5-3.5min的吸光度变化 值A At的数值； (3) 计算判断 通过步骤1、2测得Δ A0和Δ At的数值，用以下公式计算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A〇 - Zl At]/M A0]X100..................(1) (4) 定性判定 当提取液的抑制率2 50%时，表示蔬菜中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药存在， 样品为阳性。
【文档编号】G01N21/31GK106093032SQ201610769289
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月31日
【发明人】林燕, 孟月志
【申请人】孟月志