包括指示剂化合物以指示微生物的存在。指示剂化合物包括例如PH指示剂、显色酶底物和氧化还原指示剂。当直接或间接转化为产物时，指示剂化合物通常对微生物菌落和/或菌落周围的培养基赋予颜色变化。颜色变化通常使得更容易检测培养基中的微生物菌落的存在(例如，其改善菌落和培养基之间的颜色对比度)，并且颜色变化还可用于将与特定指示剂化合物反应的特定菌落和不与指示剂化合物反应的另一微生物菌落相区分。
[0035]用于生长且区分微生物的许多类型的培养基包括两种或更多种指示剂化合物。例如，当由水性缓冲液和/或样品水合时，PETRIFILM大肠杆菌计数板中的培养基包含氧化还原指示剂(氯化三苯基四唑，下文“TTC”)和显色酶底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，下文“X-gluc”)。TTC与微生物细胞反应以形成略带红色的甲□，其将在革兰氏阴性选择性生长培养基中生长的任何细菌菌落的细胞群染色。相比之下，X-gluc仅与如下细菌反应，除能够在选择性生长培养基中生长之外，该细菌还具有β-D-葡糖苷酸酶活性(例如具有β -D-葡糖苷酸酶活性的大肠杆菌菌株)。X-gluc的水解致使靛青染料形成，该靛青染料将菌落的细胞群染成蓝色，并且在具有β -D-葡糖苷酸酶活性的菌落周围形成较不强烈的蓝色晕圈。
[0036]预期本公开的方法可基于其与多种指示剂化合物中的一种或多种的反应以及通过其各自的产气或不产气来用于辨别微生物菌落。微生物菌落可与一种或多种指示剂化合物反应，以产生指示微生物存在的有色或荧光产物。另外，与微生物菌落相关联的气泡的存在指示菌落属于能够将培养装置中存在的营养物质代谢为气态最终产物(例如二氧化碳)的一组微生物。
[0037]因此，在根据本公开的方法中使用的培养装置包括有效量的营养物质，该营养物质可被转化(例如通过发酵)为气态最终产物(例如二氧化碳)。培养装置还具有独特结构(即置于两个基本上平面的层之间的水合凝胶)，使得由微生物活性产生的气泡截留在培养装置中，基本上置换水合凝胶的一部分，由此形成位于平面层之间的可光学检测的空隙空间。在任何实施例中，营养物质可为碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖或者前述碳水化合物中的任何两种或更多种的组合。本领域普通技术人员将认识到多种营养物质，其由微生物活性转化为气态最终产物，并且可用于培养基中以识别根据本公开的产气菌落。
[0038]可选择在本公开的方法中使用的培养基，使得其有利于一种类型的微生物的生长超过其他种类型的微生物。例如，培养基可包括抑制某些微生物(例如革兰氏阴性菌)生长和/或有利于其他微生物生长的选择性成分(例如抗生素、氯化钠、胆汁盐、染料诸如结晶紫)。本领域的普通技术人员将认识到多种选择性试剂，其可用于促进某些微生物在根据本公开的方法使用的培养装置中的生长。
[0039]根据本公开的方法，根据本领域众所周知的程序将样品制备，接种到培养装置中并温育。样品制备可任选包括稀释、酶促消化、过滤和/或沉降，以在将样品引入培养装置中的营养培养基之内(例如倾倒铺平板)或之上(例如表面铺平板)之前，从样品中降低或去除非微生物碎片。
[0040]在适合于怀疑存在于样品中的微生物生长的温度下的足够温育期后，使用成像系统捕获培养装置中的微生物菌落的图像并应用各种图像分析方案，可检测且计数微生物菌落。用于计数和/或区分培养装置中的微生物菌落的成像系统的实例可在国际公开WO98/59314 ;以及美国专利7，298，885 ;8，094，916 ;和7，496，225中找到;所述专利全文以引用方式并入本文中。检测和/或计数培养装置中的微生物菌落的图像分析方案的实例可见于美国专利6，058，209和6，243，486，所述专利全文以引用方式并入本文中。
[0041]本公开涉及用于计数培养装置(例如薄膜培养装置)的图像中的微生物菌落的技术。该技术可用于改善对培养装置中的微生物菌落进行自动化计数的准确度。本文公开的计数规则可单独使用，或可与其他计数规则组合使用，例如国际专利公开WO 2005/062744和美国临时专利申请61/739,786(提交于2012年12月20日，并且名称为“METHOD OFDIFFERENTIATING MICROBIAL COLONIES IN AN IMAGE”(区分图像中的微生物菌落的方法))中公开的计数规则，所述专利均全文以引用方式并入本文中。
[0042]本文公开的计数规则通常作为计算机可执行的软件指令存储，并且由生物扫描系统或图像分析系统(例如处理器和图像分析软件，任选联接至扫描装置)中的处理器执行。另选地，该规则可在硬件诸如专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或本领域已知的各种硬件部件中实现。取决于被扫描的生长培养基，本文描述的规则可单独应用，或通过与其他计数规则的任何组合应用。在任何情况下，通过应用本文描述的规则，可改善培养装置(例如薄膜培养装置)上的微生物菌落的自动化计数的准确度。
[0043]在任何实施例中，本公开的方法采用用于检测和计数培养装置中的微生物菌落的系统。用于检测和计数培养装置中的微生物菌落的系统例如在国际专利公开WO 96/18720、WO 96/18167,WO 2005/062744中描述，所述专利均全文以引用方式并入本文中。
[0044]图1示出了用于检测和计数培养装置中的微生物菌落的系统20的一个实施例的透视图。系统20包括联接至外部计算机22的扫描仪21，所述外部计算机对由扫描仪生成的图像执行成像分析。外部计算机22可包括例如被编程以用于培养装置24的图像分析的微处理器。外部计算机22可包括个人计算机(PC)、台式计算机、膝上型计算机、手持式计算机、工作站、平板个人计算装置、移动装置等等。例如，软件程序可加载到外部计算机22上，以促进对由扫描仪21生成的培养装置24的图像的图像分析。
[0045]扫描仪21经由接口 25联接至外部计算机22。接口 25例如可包括通用串行总线(USB)接口、通用串行总线2(USB2)接口、IEEE 1394火线接口、小型计算机系统接口(SCSI)、高级技术附件(ATA)接口、串行ATA接口、外设组件互连(PCI)接口、常规串行或并行接口、无线连接等等。
[0046]培养装置24任选可包括用于识别培养装置24的标记29，例如条形码或其他类型的识别标记。还可使用RFID标签、二维可光学检测码等等作为标记。在任何情况下，标记29可识别在培养装置24上生长且测试的微生物类型。扫描仪21可设计为将培养装置24拉动到扫描仪21内的第一位置并生成标记29的图像，并且随后将培养装置24拉动到第二位置并生成生长区域27的图像。以这种方式，可通过系统20来生成培养装置的标记29和生长区域27的图像。另选地，单个图像可捕获标记29和生长区域27两者。在任一种情况下，标记29的扫描可有利于识别被使用的板的类型，使得一种或多种期望计数规则可以自动化的形式应用。
[0047]例如，培养装置24可包括由3M以商品名PETRIFILM板出售的薄膜培养装置。培养装置24可用于促进通常与由于产气微生物的食物污染相关联的微生物的快速生长和检测，所述产气微生物包括例如大肠杆菌、大肠菌群细菌、肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonel Iae)等等。培养装置一般包括通常用于生物生长以及细菌检测和计数的一类生长培养基。然而，本发明还可与如本文讨论的其他类型的生长培养基一起应用。
[0048]在任何实施例中，薄膜培养装置可具有包括透明膜覆盖片的前侧和包括半透明基材的背侧，例如PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板、PETRIFILM大肠菌群计数板和PETRIFILM肠杆菌科(Enterobacteriaceae)计数板。不受理论的约束，认为设置在半透明膜和透明膜之间的相对薄(例如大约1-2_厚)的培养基的组合提供了对于根据本公开辨别产气菌落有益的光学条件。
[0049]为了改善对培养装置上的微生物菌落的自动化计数的准确度，本公开的方法的多个方面建立了可在图像处理期间应用的规则。换句话讲，下文更详细地描述的规则可构成在系统20或图像分析系统(未示出)中执行的菌落计数算法的一部分，所述系统或图像分析系统不直接接收来自成像装置的图像。取决于被扫描的生长培养基类型和可能遇到的问题，该规则可单独使用，或通过与其他图像分析规则(国际专利公开WO 2005/062744中所述的计数规则)的任何组合来使用。通过改善对生长培养基例如薄膜培养装置等等上的微生物菌落的自动化计数的准确度，应用一种或多种计数规则可改善生物扫描系统诸如系统
20 ο
[0050]图2是可对应于系统20(图1)的生物扫描系统30的框图。系统30包括成像装置32，其生成生长培养基的一个或多个图像并将所述图像提供至处理器34。处理器34联接至存储器36。存储器36存储多个处理器可执行软件指令，其有利于对由成像装置32生成的图像进行图像分析。特别地，存储器36存储一种或多种计数规则37，其在图像分析期间应用，以改善对培养装置上的微生物菌落的自动化计数的准确度。输出装置38接收由处理器34确定的结果并且将结果提供给用户。
[0051]例如，成像装置32可包括2维单色照相机，其用于生成培养装置的一个或多个图像。多种照明器(未示出)可用于照射培养装置的前部和背部。例如，照明器可用一种或多种颜色照射培养装置，并且培养装置的一个或多个图像可由成像装置32生成。另外，对于培养装置的每个图像，控制器(未示出)可控制前侧照明与背侧照明的比率。可用于使薄膜培养装置成像的成像装置的非限制性实例在美国专利8，094，916 (其全文以引用方式并入本文中)中有所描述，所述成像装置提供前侧和背侧照明，任选使用多种照明颜色。
[0052]根据本公开分析图像的方法涉及使用培养装置的至少一个图像。任选地，该方法可使用两个图像；每个图像使用照射培养装置的不同条件获得，以更准确地辨别产气微生物菌落。第一图像可在照射培养装置的“前侧”(即培养装置面对成像装置的侧面)时获得。薄膜培养装置的前侧是具有透明覆盖片的侧面。第二图像可在照射培养装置的“背侧”时获得。薄膜培养装置的背侧是与覆盖片相背对的侧面。在被构造成检测产气微生物菌落的许多PETRIFILM板(例如PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板、PETRIFILM大肠菌群计数板、PETRIFILM快速大肠菌群计数板和PETRIFILM肠杆菌科(Enterobacteriaceae)计数板)中，薄膜培养装置的背侧包括半透明聚合物膜。
[0053]照射培养装置的“前侧”可包括使培养装置暴露于来自照射装置前侧的照明器的照明。在一个实施例中，使用来自照射培养装置前侧的照明器的100 %照明和来自照射培养装置背侧的照明器的0%照明，可获得第一图像。在另一个实施例中，例如，使用来自照射培养装置前侧的照明器的80%照明和来自照射培养装置背侧的照明器的20%照明，可获得第一图像。前侧照明与背侧照明的比率可选择成为培养装置中的特定类型的营养培养基提供最佳对比度。
[0054]在该方法的任何实施例中，第一图像是在用前侧照明与背侧照明的第一比率(例如100%:0%)照射该装置时产生的，并且第二图像是在用前侧照明与背侧照明的第二比率(例如0%:100%)照射该装置时产生的，所述第二比率低于所述第一比率。在任何实施例中，第一比率可大于1:1。在任何实施例中，第二比率可小于1:1。
[0055]应当指出的是，如本文所用，“第一图像”指在培养装置接收主要来自板前侧的照明时获得的图像，并且如本文所用，“第二图像”指在培养装置接收主要来自板背侧的照明时获得的图像。术语“第一图像”和“第二图像”的使用不预期暗示获得图像的时间次序。相应地，培养装置的第一图像可在培养装置的第二图像之前或之后获得。另外，图像之一(例如分别的第一图像或第二图像)无需通过在获得另一图像(例如分别的第二图像或第一图像)之后立即使培养装置成像来获得。推荐第一图像和第二图像在时间上足够紧密地获得，以避免在图像采集之间的间隔时间期间发生显著生