骤顺序中。第一附加步骤涉及对图像中具有气泡尺寸(例如直径或面积)的每个气泡的位置作图。第二附加步骤比较气泡的尺寸与预定尺寸值(或预定尺寸值范围)，以确定特定气泡的尺寸是小于、大于还是等于预定尺寸值，或者确定特定气泡的尺寸是否在预定范围内。因此，包括附加步骤的计数规则利用与每个气泡相关联的两个参数(即，气泡的尺寸和气泡与菌落的接近)，以作出气泡是否与微生物活性相关联的确定(即确定微生物菌落是否应计数为产气微生物菌落)。
[0079]在该方法的一些实施例中，将微生物菌落识别为产气微生物菌落可允许操作者识别菌落中的微生物属于其的特定分类或组。例如，如果培养基包含有利于革兰氏阴性肠细菌生长的营养物质和选择性试剂，并且培养基中的可发酵营养物质是乳糖，则微生物可推定识别为属于称为大肠菌群细菌的一组细菌。在另一个实例中，如果培养基包括有利于革兰氏阴性肠细菌生长的营养物质和选择性试剂，并且培养基中的可发酵营养物质是葡萄糖，则微生物可推定识别为属于称为肠杆菌科的细菌科。
[0080]图6是薄膜培养装置的生长区域的一部分的黑白图像。如实例I中所述，该图像在仅照射培养装置的背侧时获得。在生长区域内的是多个微生物菌落(71-73)。图6中还显示的是多个气泡(81-84)。可观察到气泡81-83具有的面积大于接近(即在小于或等于约三个菌落直径的距离内)气泡的至少一个微生物菌落(例如菌落71)。因此，根据本公开的方法，所有三个气泡(气泡81-83)均视为“生物成因”气泡(即它们由样品中的微生物产生)。相比之下，存在分布遍及培养装置的生长区域中的培养基的众多极小的气泡84。因为这些气泡(即气泡84)在它接种后不久(即在微生物菌落在培养装置中出现前数小时)在培养装置中显而易见，且因为气泡的面积(体积)在延长温育后不增加(例如，一般地，它们保持基本上小于典型微生物菌落直径)，所以它们视为“非生物成因”气泡(即它们不是由样品中的微生物产生的)，如上所述。图6中还显示的是对培养装置的生长区域的一部分的行扫描路径90。路径90横贯包括气泡82的图像的一部分。
[0081]当分析图6所示的图像的更大部分以确定气泡的面积时，观察到对于该图像，大约九十个非生物成因气泡(即气泡84)的平均面积小于或等于50个像素(即约50个像素的面积代表相对小的非生物成因气泡的尺寸上限)。相比之下，图6的二维图像中的生物成因(即与微生物活性相关联)气泡81-83各自的单独面积分别为大约625个像素、1125个像素和875个像素。因此，非生物成因气泡(即具有小于或等于约50个像素的那些气泡)的相对紧密簇和生物成因气泡(即具有大于或等于约500个像素的那些气泡)的相对松散簇之间的尺寸差距可用于设定下阈值(例如约75个像素、约100个像素、约200个像素或约250个像素)，所述下阈值可用于指定特定图像中的生物成因气泡。在任何实施例中，该阈值可使用动态计算(即基于特定培养装置的特定图像的气泡群体计算)进行设定，所述阈值基于非生物成因气泡组的最大尺寸参数值的设定百分比(例如约125%、约200%、约300%、约 400% )。
[0082]因此，根据本公开的方法，气泡可分类到至少两组中；具有约50个像素或更少的二维面积的第一组和具有大于约50个像素的二维面积的第二组。相应地，分类(例如根据尺寸)成第一组的气泡可识别为可疑非生物成因气泡(即，可能不是微生物相关联的)。相反地，分类(例如根据尺寸)成第二组的气泡可识别为可疑生物成因气泡(即，可能是微生物相关联的)。在该方法的任何实施例中，可为第二组分配尺寸下限。例如，第二组的尺寸下限可为比非生物成因气泡的估计尺寸上限大至少50%、大至少100%或大至少150%的尺寸参数值。根据该方法，包括具有落入第一组的尺寸上限和第二组的尺寸下限之间的尺寸参数值的气泡的任何培养装置可任选进行标记，以用于由技术人员查看。
[0083]在该方法的一些实施例中，可分配可疑生物成因气泡的尺寸上限(例如通过运行对照培养装置，以建立给定微生物的生物成因气泡的最大尺寸)。在这些实施例中，超过第二组的尺寸上限的气泡将被分类到第三组中。第三组包括相对大的非生物成因气泡，其可在接种期间引入培养装置中，例如其可指示操作者使用问题。当在图像中观察到超过尺寸上限的气泡时，通知信息可发布给操作者。
[0084]图7示出图6所示的薄膜培养装置的相同部分的黑白图像。如实例I中所述，该图像在仅照射培养装置的前侧时获得。尽管生物成因气泡(即图6的气泡81-83)是可见的，但培养基和生物成因气泡之间的对比度明显更低。另外，气泡的外边缘在图7的图像中不像它在图6的背光图像中那样清晰描绘。图7中还显示的是对图6所示的生长区域的一部分的行扫描路径91。路径91对应于与图6的路径90中的那些相同的像素。
[0085]为了识别背光图像中的菌落的存在和位置，并且识别前光图像中的微生物菌落的存在和位置，图像分析算法通常逐行分析数字图像中的像素，比较第一像素或第一组像素的颜色色调和/或颜色强度与接近第一像素的第二像素或接近第一组像素的第二组像素的颜色色调和/或颜色强度。这类比较允许算法识别可指示图像中的微生物菌落、气泡或其他物体边缘的颜色和/或强度转变。图8示出沿图6的背光图像中的行90，来自像素的红色、绿色和蓝色的透射颜色强度的图。如由与气泡周边的相对边缘相关联的暗环带所证实的那样，气泡的锐利分界线在图中作为尖锐的负峰(分别为A和B)可见。图9示出沿图7的前光图像中的行91，得自像素的红色、绿色和蓝色的反射像素强度的图。
[0086]除提供分析图像以识别薄膜培养装置中的气泡的存在和各自尺寸的方法之外，本公开还提供了分析图像以识别薄膜培养装置中的特定气泡(例如“第一”气泡)的二维背景的方法。第一气泡的“二维背景”指在接近第一气泡的预定面积内的其他气泡的存在或不存在。接近气泡的存在和数目可用于确定第一气泡是可疑生物成因气泡(即可能与微生物活性相关联)还是可疑非生物成因气泡(即可能不与微生物活性相关联)。
[0087]例如，图1OA示出图6的图像所示的薄膜培养装置的更大部分的图像。在图1OA中，微生物菌落71、72、73、74和75通过其与培养基中存在的显色指示剂的相互作用是显而易见的。图1OA中还显而易见的是非生物成因气泡84以及生物成因气泡81、82、83、85、86和87。在一个方面，如本文描述的，基于其各自的尺寸和/或与微生物菌落的接近，生物成因气泡(81-83和85-87)可识别为生物成因的。在另一个方面，生物成因气泡可基于其二维背景进行识别。图1OA示出尽管非生物成因气泡基本上均匀分散在不包括微生物菌落的培养基的区域中(参见图10B)，但非生物成因气泡的尺寸基本上更小，或非生物成因气泡基本上不存在于包括一个或多个微生物菌落的培养基的区域(例如图1OA的区域101、102和103)中。该观察到的现象可用于识别可疑生物成因气泡，而无需观察接近特定可疑气泡的微生物菌落。
[0088]用于分析薄膜培养装置的图像中的特定气泡的二维背景的一种技术是将培养装置的生长区域的图像分成多个子区(subdivis1n)，每个子区具有均匀的预定尺寸和形状，并计数每个子区中的气泡数目。这可例如通过图像分析领域已知的屏蔽技术来完成。图10B-10D示出其中指示区域(分别为区域A1、A2和A3)由均匀尺寸和形状的屏蔽或框架封闭的图1OA图像。可观察到不涵盖任何微生物菌落的区域Al包括大约三十四个相对小的基本上均匀分布的非生物成因气泡。相比之下，涵盖至少两个微生物菌落的区域A2(图10C)包括总共大约七个在区域A2中并非基本上均匀分布的气泡。另外，涵盖一个微生物菌落的区域A3(图10D)包括总共约二十五个相对小的基本上均匀分布的非生物成因气泡。
[0089]根据本公开的方法，分析薄膜培养装置的图像可包括分析多个区域，以检测区域中存在的气泡数目。在任何实施例中，区域中的两个或更多个可重叠。在一个实施例中，用于分析每个区域的屏蔽可跨越图像逐行光栅扫描(rastered)，以观察邻近区域之间的差异，并且由此识别可能包括微生物菌落的特定目的区域(在图像内)。目的区域(例如图1OA的区域101、102和103)可通过相对于图像内的其他区域(例如具有相似尺寸的区域)，在目的区域中的较低气泡数目进行识别。
[0090]根据本公开的方法，分析图像还可包括识别图像的可疑区域(例如上述目的区域中的一个或多个)，其中相对于图像的另一部分，可疑区域具有基本上减少的气泡数目。在这些情况下，可疑区域的一部分(例如可疑区域的中心部分)中的气泡存在可指示与微生物活性相关联的生物成因气泡的存在。当检测到这种情况时，在可疑区域中检测到的气泡尺寸可确认可疑区域中的气泡是生物成因气泡。如果可疑区域中的气泡尺寸大于图像的其他区域中检测到的非生物成因气泡，则这强烈指示气泡是生物成因的。与其尺寸无关，接近位于可疑区域(即具有比图像中的其他培养基区域明显更少的气泡的图像区域)中的微生物菌落的气泡可为生物成因气泡，并且培养装置可报告为对于产气微生物阳性。另选地或另外地，图像可进行标记以用于由操作者查看。
[0091]具有计数规则的扫描系统和/或图像分析系统用于区分薄膜培养装置图像中的气泡和/或微生物菌落的用途已得到描述。计数规则可用于扫描系统中，以改善对培养装置上的微生物菌落的自动化计数的准确度。
[0092]分析薄膜培养装置图像的上述技术可用于检测接种到薄膜培养装置中的样品中的微生物的存在或不存在的方法中。在一个方面，该方法包括分析薄膜培养装置的生长区域的图像，以检测气泡且将多个气泡分类，其中将多个气泡分类包括根据与多个气泡中的每个气泡相关联的尺寸参数来将每个气泡分配至第一组或第二组。如本文描述的，可分析生长区域的图像以检测气泡。气泡可根据尺寸参数进行分类，并且如本文公开的，可分配关于每组的尺寸上限和/或尺寸下限。在任何实施例中，将气泡分类到第一组和第二组中可包括将第一气泡子集分类到第一可疑非生物成因气泡组中。在这些实施例中，如本文描述的，该方法还包括对第一可疑非生物成因气泡组分配尺寸参数值上限。在任何实施例中，将气泡分类到第一组和第二组中可包括将第二气泡子集分类成可疑生物成因气泡组中。在这些实施例中，如本文描述的，该方法还包括对可疑生物成因气泡组分配尺寸参数值下限。
[0093]在另一个方面，该方法包括分析薄膜培养装置的生长区域的图像的第一区域，以检测第一区域中的第一气泡数目，分析图像的第二区域，以检测第二区域中的第二气泡数目，并且比较第一气泡数目与第二气泡数目。如本文描述的，分析第一区域和第二区域可包括使用图像屏蔽来计数第一区域和第二区域内的气泡数目，其中所述图像屏蔽限定区域的指定大小和形状。在任何实施例中，该方法还可包括分析图像的第三区域，以检测第三区域中的第三气泡数目，并且比较第一气泡数目或第二气泡数目与第三气泡数目。第一区域、第二区域和/或第三区域可彼此间隔开，或所述区域中的至少两个可部分重叠。
[0094]在另外一方面，本文描述的方法中的两种或更多种可合并成单一方法，以检测薄膜培养装置中的微生物的存在或不存在。例如，该方法可包括分析薄膜培养装置的生长区域的图像的第一区域，以检测第一区域中的第一气泡数目，分析图像的第二区域，以检测第二区域中的第二气泡数目，比较第一气泡数目与第二气泡数目，分析图像以检测培养装置的生长区域中的气泡并将多个气泡分类，其中将多个气泡分类包括根据与多个气泡中的每个气泡相关联的尺寸参数来将每个气泡分配至第一组或第二组。在一些实施例中，该方法还可包括确定在第一区域、第二区域或第三区域中的任一个中的气泡是否分配至第一组或第二组。有利地，在该实施例中，在解释其附近的气泡数目和尺寸的背景下分析特定气泡的尺寸，由此使用两个分开标准来确认特定气泡是生物成因还是非生物成因的。
[0095]该技术已描述为软件实现的。在所述情况下，计算机可读介质存储处理器可执行指令，其体现上文描述的规则中的一种或多种。例如，计算机可读介质可包括非暂态计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、非易失性随机存取存