物学变化(例如生长或酶活性)或物理变化(例如脱水)的可能性。因此，在优选实施例中，第一图像在获得第二图像时约30秒内获得。
[0056]本领域普通技术人员将认识到，在其中成像装置被定位成面对培养装置的前侧并且照明器也被定位成使得照明指向培养装置的前侧的系统中，由成像装置产生的图像基本上包括由培养装置及其内容物反射的光。另外，本领域普通技术人员还将认识到，在其中成像装置被定位成面对培养装置的前侧并且照明器也被定位成使得照明指向培养装置的背侧的系统中，由成像装置产生的图像基本上包括由培养装置及其内容物透射和/或折射的光。
[0057]照射培养装置的“背侧”可包括使培养装置暴露于来自照射装置背侧的照明器的照明。在一个实施例中，使用来自照射培养装置背侧的照明器的100 %照明和来自照射培养装置前侧的照明器的0%照明，可获得第二图像。在另一个实施例中，例如，使用来自照射培养装置背侧的照明器的80%照明和来自照射培养装置前侧的照明器的20%照明，可获得第二图像。前侧照明与背侧照明的比率可选择成为培养装置中的特定类型的营养培养基提供最佳对比度。
[0058]在本公开的方法的任何实施例中，可能期望仅使用由背侧照明获得的图像或由前侧照明获得的图像。如图6和图7所示以及下文讨论的，背侧照明可提供在薄膜培养装置中的培养基和气泡(例如气泡的周边)之间的特别增强的对比度。
[0059]图像被提供给处理器34并且还可存储于存储器36中。在任何情况下，图像通过应用计数规则37进行分析，以便测定培养装置上的细菌计数。成像装置32的分辨率可为大约155个像素/厘米。在所述情况下，图像中的一厘米线长155个像素。
[0060]处理器34可包括执行存储器36中存储的软件的通用微处理器。另选地，处理器34可包括专用集成电路(ASIC)或其他专门设计的处理器。在任何情况下，处理器34执行多种计数规则37，以改善对培养装置上的微生物菌落的自动化计数的准确度。
[0061]存储器36是计算机可读介质的一个实例，其存储由处理器34应用的处理器可执行的软件指令。例如，存储器36可包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、非易失性随机存取存储器(NVRAM)、电可擦可编程只读存储器(EEPROM)、闪存存储器等等。计数规则37诸如下文描述的那些存储于存储器36中，并且可构成用于图像分析的更大型软件程序的一部分。
[0062]输出装置38通常包括用于将结果传达给用户的显示屏。然而，输出装置38还可包括其他类型的装置诸如打印机等等。输出装置38可构成扫描单元的一部分，诸如显示器(未示出)，或可对于扫描单元是外部的，诸如外部计算机22的显示屏(图1)。
[0063]图3是示出自动化培养装置分析的过程的流程图。如图3所示，处理器34接收培养装置的一个或多个图像(步骤41)。处理器34调用来自存储器36的多种软件例行程序，以识别培养装置上的微生物菌落(步骤42)。例如，细菌菌落可根据在与营养培养基中的一种或多种指示剂化合物反应(即直接地或间接地)后，它们产生的特有颜色进行识别。菌落识别的其他方面在本文中讨论。由处理器34执行的软件可允许基于菌落已在温育期间在其中生长的生长区域中的颜色变化来识别在培养装置上的生长区域并对细菌菌落进行自动化计数。任选地，处理器可调用例行程序，以计数所识别的微生物菌落。产气菌落可分离到与对在培养装置中不产生气体的菌落的计数分开的计数中。
[0064]根据本公开的方法，处理器34应用一种或多种规则，以改善对生长培养基上的微生物菌落的计数的准确度(步骤43)。取决于被分析的培养装置类型，规则可单独应用，或可使用规则的多种组合。规则可单独地由存储器36调用，或可构成更大型的图像分析软件程序的子例行程序。规则可单独应用，或可应用规则的多种集合。如果使用规则集合，则可基于被扫描以获得一个或多个图像的板的类型来选择应用规则的次序。对于规则应用所选择的次序可影响最终结果。多种规则子集也可以任何次序应用，并且对于规则子集所选择的次序也可影响最终结果。
[0065]图4示出了根据本公开的方法100的一个实施例。该方法包括在照射培养装置的前侧时获得第一图像的步骤51，以及在照射培养装置的背侧时获得第二图像的步骤52。培养装置的前侧和背侧可用如本文公开的成像系统进行照射。方法100还包括分析第一图像以识别培养装置中的微生物菌落位置的步骤53。方法100还包括分析第二图像以识别培养装置中的气泡位置的步骤54。
[0066]分析第二图像以识别气泡的位置可包括将气泡识别为可与培养装置中的培养基辨别的物体(图像中)。将气泡识别为可与培养基辨别的物体可通过应用由Weiss (美国专利6，381，353)公开的图像分析技术来完成。分析图像可包括RGB (红色/绿色/蓝色)图像处理算法。另选地或另外地，分析图像可包括HSI (色调、饱和度和强度)、HSL(色调、饱和度和亮度)、HSV (色调、饱和度和值)算法或它们组合。因为由产气菌落产生的气泡通常置换设置在薄膜培养装置的覆盖片和基材之间的培养基的一些或全部，所以气泡可作为图像中具有比周围培养基和/或微生物菌落基本上更少的颜色的区域。然而，薄膜培养装置的独特构型允许检测图像中的气泡存在的另选方法-检测围绕气泡的相对暗的环带。
[0067]不受理论的约束，接触培养基的气泡边缘可用作透镜以允许光在整个气泡上的透射。另外，边缘可用作镜子以反射透射光的图像。因此，因为培养基和菌落通常是有色的，并且颜色通常暗于构成薄膜培养装置的背部的基材，所以培养基和/或菌落的透射(和反射)图像构成围绕相对浅色的气泡中心部分的相对深色的环带。该暗环带可作为鲜明的颜色和/或亮度变化检测到，其可容易地从培养基和通常暗于培养基的微生物菌落辨别，如图6所示和实例I中所述。
[0068]第一图像和第二图像如此获得，以便以至少一种颜色的阴影来限定图像中的物体。因此，分析第一图像和/或第二图像以识别每个图像中的微生物菌落可包括根据本领域众所周知的图像分析方法将图像中的物体识别为菌落。例如，Weiss描述了基于一个或多个标准包括物体尺寸、可见度、颜色、表面质量和形状来识别图像中的物体(例如微生物菌落)的技术(美国专利6，243，486，其全文以引用方式并入本文中)。如上所述，检测与包括TTC的指示剂化合物反应的微生物菌落的方法可被构造成检测颜色为红色的阴影，并且检测与包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-葡糖苷酸的指示剂化合物反应的微生物菌落的方法可构造成检测颜色为蓝色的阴影。
[0069]分析第一图像和/或第二图像以识别图像中的微生物菌落包括识别图像中检测到的任何菌落的位置。培养装置中的菌落位置用于比较培养装置中的菌落位置与气泡位置。菌落或气泡的位置可通过图像中的X-Y坐标进行识别。因此，在一个优选实施例中，第一图像和第二图像两者均在获得第一图像之后但在获得第二图像之前不移动或以其他方式处理培养装置的情况下而获得。另选地，对准界标(例如PETRIFILM板的两个或更多个拐角或者在任何培养装置上制备的对准界标)可用于适当定向图像，以便测定并比较第一图像和第二图像中的物体(例如菌落、气泡)位置。
[0070]在分析第一图像和第二图像以识别培养装置中的微生物菌落和气泡的位置后，方法100还包括比较微生物菌落和气泡的位置的步骤55。比较位置可包括计算特定微生物菌落和接近该菌落的一个或多个气泡之间的距离(例如以像素表示)。该距离可用于确定气泡是否与特定菌落相关联，并且由此推断该特定菌落是否是产气微生物菌落。
[0071 ] 由制造商提供的与PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板一起使用的解读指南提供了关于确定气泡是否与特定菌落相关联的指导。部分地，该指导涉及气泡与微生物菌落的接近。一般来讲，接触特定微生物菌落的气泡视为与该菌落相关联(即由其产生)。另夕卜，定位在等于约三个菌落直径的距离内的气泡视为与该菌落相关联(即由其产生)。因此，根据本公开分析图像(例如本文公开的第一图像或第二图像)以识别产气微生物的存在或位置包括分析图像以识别一个或多个气泡的存在或位置。气泡相对于任何接近微生物菌落的位置用于确定气泡是否由构成该菌落的微生物产生。
[0072]分析图像(例如本文公开的第一图像或第二图像)以识别一个或多个气泡的存在或位置还可包括分析图像以确定图像中的一个或多个气泡的尺寸参数(例如半径、直径和/或面积)。例如，尺寸参数可通过计算气泡的半径、直径或面积中的像素数目来确定。当在图像中观察到多个气泡时，关于多个气泡中的每个气泡的尺寸参数可例如在柱状图中进行比较。柱状图可示出图像中发现的气泡的尺寸(例如半径、直径或面积)分布。另外，柱状图可示出气泡的尺寸分布中的间隙。这些间隙可用于区分非生物成因气泡与生物成因气泡。
[0073]全文以引用方式并入本文中的国际专利公开W02012/012104描述了在薄膜培养装置中可观察到的小型非生物成因气泡的存在。该专利申请还公开了随着微生物菌落发展，在微生物菌落周围的区域内的非生物成因气泡的缩小或消失。非生物成因气泡和微生物菌落周围的区域(即缺乏非生物成因气泡的区域)在下文描述的图6中明确可见。因此，本公开的方法的任何实施例还可包括计算菌落周围的区域中的气泡数目。例如，菌落周围的区域面积可小于或等于菌落面积约五倍。该方法任选可包括将在接近微生物菌落的区域内可观察的气泡数目与培养装置中的营养培养基的另一区域(例如“对照”区域)中可观察的气泡数目进行比较，所述另一区域不含菌落。当作出该比较时，如果接近微生物菌落的区域内可观察的气泡数目基本上低于对照区域中可观察的气泡数目，则接近微生物菌落的第一气泡的存在可指示微生物菌落是产气微生物菌落，而与第一气泡的尺寸无关。
[0074]在任何实施例中，本公开的方法还可包括比较第一气泡的尺寸参数与第二气泡的尺寸参数。当多个气泡存在于图像中时，比较第一气泡的尺寸参数与第二气泡的尺寸参数可包括对于多个气泡中的每个气泡产生尺寸参数值的柱状图。尺寸参数值(例如半径、直径或面积)的分布可揭示具有类似尺寸的气泡的簇。簇可分成一个或多个组。
[0075]柱状图可用于确定阈值尺寸参数值(例如关于气泡半径、直径或面积)或尺寸参数范围，其用于辨别由产气微生物产生的第一气泡与不由产气微生物产生的第二气泡。有利地，比较在培养装置中观察到的多个气泡的尺寸可用于辨别趋于具有相对一致尺寸的非生物成因气泡与通常大于非生物成因气泡的由微生物菌落产生的气泡。
[0076]由制造商提供的与PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板一起使用的解读指南提供了关于确定气泡是否与特定菌落相关联的另外指导。一般来讲，当气泡接近特定微生物菌落且气泡具有的直径约等于或大于接近菌落的直径时，气泡视为与该菌落相关联(即由其产生)。然而，本领域普通技术人员将认识到可存在这样的情况(例如当样品和/或培养装置包括抑制微生物产气的营养物质时)，其中与产气菌落相关联的气泡可具有小于它与之相关联的产气微生物菌落的尺寸参数值(例如直径)。
[0077]图5是示出根据本公开将菌落区分为多个菌落类型的规则的流程图。如图2所示，处理器34调用存储于存储器36中的软件，以识别第一图像和第二图像中的菌落和气泡的位置且将所述位置作图(步骤61)。特别地，处理器34确定使用第一图像识别且定位的菌落是否对应接近使用第二图像识别且定位的气泡的位置(步骤62)。如果在分析第一图像和第二图像时发现接近气泡的菌落，则处理器34应用接近系数以确定气泡是否与该接近菌落相关联(即由其产生)。如果如上所述，气泡在菌落的预定距离内(例如在相当于约三个菌落直径内)，则培养装置中的菌落计数为第一类型(例如“产气”;参见图5，步骤63)。如果如上所述，气泡不在菌落的预定距离内(例如比相当于约三个菌落直径更远)，则培养装置中的菌落计数为第二类型(例如“非产气”；参见图5，步骤64)。
[0078]任选地，附加步骤(未示出)可加入图5中示出的计数规则中。附加步骤可在步骤61后以及步骤63或步骤64前的任何点插入步