专利名称：新型酶电极和使用该酶电极的燃料电池的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶电极。更具体地，涉及一种这样的酶电极，其中使用起催化剂作 用的酶进行氧化还原反应，且被改良以实现更高的输出，还涉及使用该酶电极以实现更 高输出的燃料电池。
背景技术：
近年来，因为可有效地从燃料(如不易与常规工业催化剂反应的葡萄糖和乙醇) 中提取电子，所以具有固定在负极和正极中至少一个电极上用作催化剂的氧化还原酶的 燃料电池(以下称为“生物燃料电池”)，作为下一代具有高容量和安全性的燃料电池，
已备受关注。用图5描述了一般的生物燃料电池的反应方案。在图5所示的使用葡萄糖作为 燃料的生物燃料电池中，葡萄糖的氧化反应在负极处进行(图5(a))，而大气中的氧(O2) 的还原反应在正极处进行(图5(b))。对电子流详细说明如下。在负极处，电子以如下顺序连续转移到葡萄糖、葡萄 糖脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、心肌黄酶、电子转移介质、然后转移到电 极(碳)。相反，在正极处，从负极释放的电子以如下顺序连续转移到电极(碳)，电子转 移介质，然后到胆红素氧化酶(BOD)，且用电子和从外部供应的氧气进行还原反应从而 产生电能。虽然这样的生物燃料电池作为高度安全的燃料电池而引起了注意，但是它们具 有如下问题，即，比其它燃料电池输出低。因此，最近研究了制造具有高输出的生物燃 料电池(如参考PTL 1和PTL2)。例如，根据PTLl中所述的生物燃料电池，电极由具有多孔结构的导电元件(金 属、导电聚合物、金属氧化物、碳材料等)构成，并且酶、电子转移介质等被固定在孔 中，从而提高每块有效面积的载酶密度并提高电流密度。根据PTL 2中所述的生物燃料电池，阴极由诸如碳的多孔材料以及固定在其上 的酶和电子转移介质构成，并且阴极的至少一部分设置为与气相的用作反应基质的空气 或氧气接触，因此可充分发挥高电极特性。除了通过修改电极结构来实现较高输出的技术，还有通过改变固定在电极上的 酶自身使燃料电池实现较高输出的技术。例如，PTL3公开了通过脱氢酶和心肌黄酶的融 合制备蛋白质，且该融合蛋白质固定在负极上从而有效地执行从基质到电极的电子转移 反应，且因此使得生物燃料电池具有较高输出。而且，PTL 4公开了如下技术，S卩，通过在电极上固定通过结合两种或多种不同 类型的酶蛋白质构成的结合蛋白质，从而由于形成结合蛋白质的两种类型的酶蛋白质之 间相对距离小，有效执行从基质到电极的电子转移反应，使得生物燃料具有较高输出。应该注意，为了提高生物燃料电池的输出，必须提高待固定在电极上的酶和反
3应基质(具体地，电子转移介质)之间的反应效率。酶和反应基质之间的反应由亲和性 (Km)和反应速度(kcat)表达，且这两个参数是通过酶与反应基质的组合确定的，因此， 必须寻找彼此兼容的酶和反应基质(具体地，电子转移介质)。然而，为了提高生物燃料电池的输出，需要在由电子转移介质等决定的电势保 持在高水平下而获得高电流；因此，在目前的情况下，酶和反应基质的组合受到限制， 且输出值受到限制。引用文献列表专利文献PTL 1:日本未审查专利申请公开第2006-234788号PTL 2 日本未审查专利申请公开第2006-93090号PTL 3 日本未审查专利申请公开第2007-163185号PTL 4 日本未审查专利申请公开号第2006-163268号
发明内容
技术问题如上所述，已经从各种角度开发了提高生物燃料电池输出的技术，但获得电能 的生物燃料电池的基本原理都是基于电极上的氧化还原反应；因此，不提高反应基质和 电极上的酶之间的反应效率就不能获得根本的解决方案。因此，本发明的主要目的是人工提高固定在生物燃料电池电极上的反应基质和 酶之间的兼容性，以便提高电极上的反应效率，因此使得生物燃料电池能够实现更高输
出ο技术方案问题的解决方案本申请的发明人进行了广泛研究以便提高电极上的反应基质和酶之间的反应效 率从而实现前述目的，结果，通过关注酶和反应基质之间的静电相互作用、亲水性和疏 水性相互作用而成功地人工提高了酶和反应基质之间的兼容性，并做出本发明。首先本发明提供了酶电极，其中利用作为催化剂的酶进行氧化还原反应，且通 过将对至少一个特定的氨基酸残基进行编码的密码子加入或插入到对酶进行编码的碱基 序列中来改变酶，从而提高与反应基质或电子转移介质的亲和性和/或反应速度，并固 定该酶。不特别限制改变酶的方法，只要该方法通过将至少一个对特定氨基酸残基进行 编码的密码子加入或插入到对酶进行编码的碱基序列中而提高与反应基质或电子转移介 质的亲和性和/或反应速度；然而，例如，静电相互作用可用于提高与反应基质或电子 转移介质的亲和性和/或反应速度。不特别限制氨基酸残基；然而，例如，可使用具有与反应基质或电子转移介质 的电荷相反的电荷的氨基酸残基。也不特别限制电子转移介质和氨基酸残基的具体类型；然而，例如，当其氧化 形式或还原形式是阴离子的介质用作电子转移介质时，可从赖氨酸残基、组氨酸残基和 精氨酸残基中选择氨基酸残基。
而且，通过利用亲水性或疏水性相互作用而提高与反应基质或电子转移介质的 亲和性和/或反应速度的方法可用作改变酶的方法。在这种情况下，当反应基质或电子转移介质是亲水性物质时，将亲水性氨基酸 用作氨基酸残基，而当反应物质或电子转移介质是疏水性物质时，将疏水性氨基酸用作 氨基酸残基，从而提高亲和性和/或反应速度。接下来，本发明提供了燃料电池，用酶作为催化剂在电极上进行氧化还原，通 过将至少一个对特定氨基酸残基进行编码的密码子加入或插入到对酶进行编码的碱基序 列中来改变酶，从而提高与反应基质或电子转移介质的亲和性和/反应速度，且所述酶 固定在正极和负极中的至少一个上。本发明使用的技术术语将在下面说明。本发明使用的“酶的改变”指的是，加入或插入对氨基酸残基进行编码的一个 或多个密码子，从而改变诸如稳定性和与反应基质或电子转移介质的亲和性和/或反应 速度的特性，而不改变酶蛋白质的功能。本发明的有益效果根据本发明的酶电极使得在电极上高效进行氧化还原反应，且因此可提高最终 的电能输出。
图1是示出了实施例1中Lys6基因的DNA测序结果的代替示图的曲线图。图2是示出实施例1中LysS基因的DNA测序结果的代替示图的曲线图。图3是示出实施例1中LyslO基因的DNA测序结果的代替示图的曲线图。图4是示出由实施例2中Lys6-BOD基因、Lys8-BOD基因和LyslO-BOD基因 表达的酶的BOD活性的有无的代替示图的照片。图5是示出一般生物燃料电池的反应方案的示意图。
具体实施例方式以下说明执行本发明的优选实施方式。注意，下面所述实施方式是本发明代表 性实施方式的实例，不能用这些实施方式狭隘地解释本发明的范围。<酶电极>根据本发明的酶电极是利用作为催化剂的酶进行氧化还原反应的电极，并且是 其上固定有已改变过的酶从而提高与反应基质或电子转移介质的亲和性和/或反应速度 的电极。通过将至少一个对特定氨基酸残基进行编码的密码子加入或插入对酶进行编码 的碱基序列中来完成的酶的改变。在这种情况下，“改变”指的是，通过在不改变酶的 性质的同时加入或插入至少一个特定氨基酸残基，来提高与反应基质或电子转移介质的 亲和性和/或反应速度。不特别限制改变酶的具体方法，只要是通过将至少一个对特定氨基酸残基进行 的密码子加入或插入到对酶进行编码的碱基序列中，来提高与反应基质或电子转移介质 的亲和性和/或反应速度；然而，例如，可通过利用静电相互作用或亲水性或疏水性相互作用来提高与反应基质或电子转移介质的亲和性和/或反应速度。至于通过利用静电相互作用而提高亲和性和/或反应速度的具体方法，例如， 可将对具有与所使用的反应基质或电子转移介质相反的电荷的氨基酸残基进行编码的密 码子加入或插入到对酶进行编码的碱基序列编码中，以便提高所要固定的酶和反应基质 或电子转移介质之间的亲和性和/或反应速度。更具体地，在使用具有负电荷的反应基质或电子转移介质的情况下，将对具有 正电荷的氨基酸残基进行编码的密码子加入或插入对酶进行编码的碱基序列中，且在使 用具有正电荷的反应基质或电子转移介质的情况下，加入或插入对具有负电荷的氨基酸 残基进行编码的密码子；因此，可以提高表达的酶和反应基质或电子转移介质之间的亲 和性和/或反应速度。此外，因为将对具有电荷的氨基酸残基进行编码的密码子加入或插入到对酶进 行编码的碱基序列中，所以可由于静电相互作用而将酶固定在电极上，且因此使酶电极
稳定化。此外，可减少在电极上固定酶所需的材料，结果，可降低酶电极的制造工艺成 本。不特别限制可用于利用静电相互作用的电子转移介质。具有负电荷的电子转移 介质(其氧化形式或还原形式为阴离子的介质)的实例包括诸如ABTS(2，2’ -连氮基 双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)(2，2' -azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate)的色 素，以及诸如六氰合铁离子和八氰合钨离子的氰基金属络合物，并且电子转移介质(其 氧化形式或还原形式为阳离子的介质)的实例包括吡啶、联吡啶等与其配位的金属络合 物，如[Os (trpy3) ]3+/2\ [Os (py) 2 (bpy) 2]3+/2+ 和[Fe (dpy) ]3+/2+0具有正电荷的氨基酸的实例包括赖氨酸残基、组氨酸残基和精氨酸残基，并且 它们可单独使用或者作为两种或多种类型的组合使用。其中，特别优选组氨酸残基。一般地，当将酶固定在电极上时，执行使用 聚-L-赖氨酸的酶的固定方法；然而，当将对赖氨酸残基进行编码的密码子加入或插入 到对酶进行编码的碱基序列中时，存在如下优点，即，可以在不使用聚-L-赖氨酸的情 况下将酶固定在电极上，且因此可降低聚-L-赖氨酸材料的成本。具有负电荷的氨基酸残基的实例包括天冬氨酸残基和谷氨酸残基，这些氨基酸 残基可单独使用或作为两种或多种类型的组合使用。使用亲水性或疏水性相互作用提高亲和性的具体方法涉及当使用亲水性反应基 质或电子转移介质时，将对亲水性氨基酸残基进行编码的密码子加入或插入到对酶进行 编码的碱基序列中，并且当使用疏水性反应基质或电子转移介质时，将对疏水性氨基酸 残基进行编码的密码子加入或插入到对酶进行编码的碱基序列中，以便提高表达的酶和 反应基质或电子转移介质之间的亲和性和/或反应速度。不特别限制可在利用亲水性或疏水性相互作用时使用的电子转移介质。亲水性 电子转移介质的实例包括具有LogP值(即，亲水性/疏水性的一般参数)小于0的电子 转移介质，如氰基金属络合物(如六氰合铁离子和八氰合钨离子)、醌(如Q0)和色素 (如2，2’ -连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)。疏水性电子转移介质的实例包 括Log P值大于0的电子转移介质，如VK1、VK3、苯醌和蒽醌。
亲水性氨基酸残基的实例包括丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨 酸残基、蛋氨酸残基、色氨酸残基、苯基丙氨酸残基和脯氨酸残基，并且这些氨基酸残 基可单独使用或作为两种或多种类型的组合使用。疏水性氨基酸残基的实例包括甘氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、半胱氨 酸残基、酪氨酸残基、天冬酰胺残基(asparagineresidue)、谷氨酸残基、赖氨酸残基、组 氨酸残基、精氨酸残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基，且这些氨基酸残基可单独使用或 作为两种或多种类型的组合使用。根据本发明的可固定在酶电极上的酶的类型没有特别限制，可自由选择任何已 知的酶。例如，当将根据本发明的酶电极用作正极时，可固定具有氧化酶活性和用作反 应基质的酶，例如漆酶、胆红素氧化酶(BOD)或抗坏血酸氧化酶。在将根据本发明的酶电极用作负极时可固定的酶没有特别限制；然而，例如， 当使用含有糖作为反应基质的基质时，优选固定通过氧化来降解糖的氧化酶。氧化酶的 实例包括葡萄糖脱氢酶、葡萄糖酸-5-脱氢酶、葡萄糖酸-2-脱氢酶、醇脱氢酶、醛还原 酶、醛脱氢酶、乳酸脱氢酶、羟基丙酮酸还原酶、甘油酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、果糖脱 氢酶和半乳糖脱氢酶。而且，当将根据本发明的酶电极用作负极时，除了上述氧化酶，还可固定氧化 的辅酶和辅酶氧化酶。氧化的辅酶的实例包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD+)和吡咯喹啉醌(PPQ2+)。辅酶 氧化酶的实例是心肌黄酶。而且，可将电子转移介质固定在本发明的酶电极上，以便使由氧化还原反应产 生的电子向电极顺利转移。可固定在本发明的酶电极上的电子转移介质的类型没有特别 限制，可自由选择任何已知的电子转移介质。例如，当将根据本发明的酶电极用作正极 时，可固定ABTS(2，2，-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)、K3[Fe(CN)6]等 作为电子转移介质。而且，例如，当将根据本发明的酶电极用作负极时，可固定2-氨基-3羧基-1， 4_萘醌(ACNQ)、维生素K3、2-氨基-1，4-萘醌(ANQ)、2-氨基-3-甲基-1，4-萘 醌(AMNQ)、2，3-二氨基-1，4-萘醌、锇(Os)、钌(Ru)、铁(Fe)、钴(Co)等的金 属络合物、诸如苄基紫精的紫精化合物、具有醌骨架的化合物、具有烟酰胺结构的化合 物、具有核黄素结构的化合物、或具有核苷酸磷酸盐结构的化合物。注意，可使用任何已知材料作为用于根据本发明的酶电极的材料，而没有特别 限制，只要该材料可电连接到外部。其实例包括金属，如Pt、Ag、Au、Ru、Rh、Os、 Nb、Mo、In、Ir、Zn、Mn、Fe、Co、Ti、V、Cr、Pd、Re、Ta、W、Zr> GefPHf; 合金，如阿留麦尔镍合金(alumel)、黄铜、硬铝、青铜、镍格林合金、钼铑、海波可、 坡莫合金、坡明德合金、德银和磷青铜；导电聚合物，如聚乙炔；碳材料，如石墨和炭 黑；硼化物，如Hffi2、NbB、CrBjPB4C;氮化物，如TiN和ZrN ；硅化物，如VSi2、 NbSi2> MoSi2和TaSi2,以及这些物质的混合物。<燃料电池>根据本发明的燃料电池是在具有起催化剂作用的酶的电极上进行氧化还原反应 的燃料电池，并且是将改变的酶固定在正极和负极的至少一个上从而提高与反应基质或电子转移介质的亲和性和/或反应速度的燃料电池。通过将至少一个对特定氨基酸残基进行编码的密码子加入或插入到对酶进行编 码的碱基序列中来完成酶的改变。根据本发明的燃料电池的电极细节与上面讨论的酶电 极的细节相同；因此，这里省略其说明。除了电极之外，根据本发明的燃料电池的结构、功能等没有特别限制，并可进 行自由设计，只要使用了根据本发明的酶电极即可。因为在根据本发明的燃料电池电极上高效地进行氧化还原反应，所以可提高获 得的电能的输出。而且，因为电极自身的稳定性高，所以可提供具有良好耐用性的燃料 电池。<电子设备>根据本发明的燃料电池可产生大输出电流和电压，此外，具有耐用性；因此， 其适用于所有类型的已知电子设备。不特别限制电子设备的结构、功能等，只要可使用根据本发明的燃料电池即 可，并且包括所有电操作设备。其实例包括电子设备，如收集、移动设备、机器人、 个人计算机、游戏机、车载设备、家用电器和工业产品；移动产品，如汽车、自行车、 飞机、火箭和宇宙飞船；医学设备，如分析仪、起搏器发电机和诸如生物传感器的体内 设备；以及发电系统和热电联产系统，如通过分解垃圾来发电的系统。实施例1在实施例1中，制备基因，其中对特定氨基酸残基进行编码的密码子结合在对 酶进行编码的碱基序列中，从而改变可固定在根据本发明的酶电极上的酶。具体地，用可固定在根据本发明的酶电极上的作为酶实例的BOD和作为氨基酸 残基的赖氨酸残基来制备将赖氨酸残基结合到胆红素氧化酶(以下称为“BOD” )末端 的基因。首先，将分别结合有四个、六个、八个和十个赖氨酸残基的ρΜΕΤ α B载体 Lys4、Lys6、Lys8和LyslO制备为为BOD基因载体，如表1所示。[表1]
权利要求
1.一种酶电极，其中，利用酶作为催化剂进行氧化还原反应，并且通过将至少一个编码特定的氨基酸残基的密码子加入或插入到编码所述酶的碱基序 列中来改变所述酶，从而提高与反应基质或电子转移介质的亲和性和/或反应速度，并 固定所述酶。
2.根据权利要求1所述的酶电极，其中，通过静电相互作用来提高与所述反应基质或 电子转移介质的亲和性和/或反应速度。
3.根据权利要求1或2所述的酶电极，其中，所述氨基酸残基具有与所述反应基质或 电子转移介质的电荷相反的电荷。
4.根据权利要求3所述的酶电极，其中，所述电子转移介质是其氧化形式或还原形式 为阴离子的介质，并且所述氨基酸残基是从赖氨酸残基、组氨酸残基和精氨酸残基中选 择的一种氨基酸。
5.根据权利要求1所述的酶电极，其中，通过亲水性或疏水性相互作用提高与所述反 应基质或电子转移介质的亲和性。
6.根据权利要求5所述的酶电极，其中，所述反应基质或所述电子转移介质是亲水性 物质，并且氨基酸是亲水性氨基酸。
7.根据权利要求5所述的酶电极，其中，所述反应基质或电子转移介质是疏水性物 质，并且所述氨基酸是疏水性氨基酸。
8.—种燃料电池，其中，利用酶作为催化剂在电极上进行氧化还原反应，并且 通过将至少一个编码特定的氨基酸残基的密码子加入或插入到编码所述酶的碱基序列中来改变所述酶，从而提高与反应基质或电子转移介质的亲和性和/或反应速度，并 且所述酶固定在正极和负极中的至少一个上。
全文摘要
本发明提供了利用酶作催化剂进行氧化还原反应的酶电极。在该酶电极中，固定在酶电极上的酶通过将至少一个对预定氨基酸残基进行编码的密码子加入或插入到对该酶进行编码的碱基序列而被改性，从而提高与反应基质或电子转移介质的亲和性和/或反应速度。由于电极上的氧化还原反应高效进行，所以该酶电极可提高所获得的电能输出。因此，适用于所有类型的燃料电池、生物传感器和电子设备。
文档编号H01M8/16GK102017265SQ200980115610
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月23日 优先权日2008年5月8日
发明者中川贵晶, 后藤义夫, 汲田英之, 角田正也, 酒井秀树 申请人:索尼公司