一种从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针及其制备方法和应用

本发明涉及代谢物分析，具体的说涉及一种从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、代谢物小分子是生物体赖以生存的物质基础，细胞代谢逐渐被认为是一系列常见疾病的关键驱动因素。代谢物在细胞的生物合成、细胞成长、信号转导和免疫调节过程中起到了重要的作用。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，研究代谢组在某一时刻细胞内所有代谢物的集合。其研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量，建立起代谢物水平与异常生理状态之间的联系，进而用于疾病的诊断和治疗。

2、常见的代谢物包括氨基、羧基、巯基、羟基、磷酸、醛酮类化合物，这些化合物具有不同的物理化学性质，可以作为物质基础参与生命体的构建，同时可以参与信号通路的转导，影响生物体的生理状态，目前已经成为代谢物分析的重点。代谢物小分子常规的分析技术包括核磁共振技术(nmr)、超高效液相色谱-质谱联用技术(uplc-ms)和气相色谱-质谱联用技术(gc-ms)，允许并行测定数百种代谢物。其中质谱法(ms)由于其优异的检测范围和灵敏度，是研究人体样品中复杂代谢物混合物的主要技术。

3、生物样本中成分往往比较复杂，除目标代谢物分子外，还含有大量的无机盐、有机盐、磷脂、蛋白等会对测试结果产生严重干扰，需要对样本进行预处理，除去或减弱干扰，以得到稳定性高，重复性好的结果。尽管目前有衍生化试剂对氨基类化合物进行衍生，以降低化合物的极性，提高色谱柱分离效果，提高检测的灵敏度。但存在的问题是，衍生不能除去大量的基质，过量的衍生化试剂也会对检测产生干扰，污染和堵塞色谱柱，降低仪器寿命。

4、将衍生化试剂固定在固相材料上，可以在选择性偶联代谢物之后，通过简单的分离，将杂质分离，后续通过洗涤，可以将偶联的小分子代谢物纯化。后在温和条件下将目标代谢物释放出来，用于后续检测。而磁性材料的引入可以简化分离过程，提高分离的效率。通过该方法可以实现对亚代谢组的分析。

5、由于质谱检测过程中存在北京干扰，对代谢物小分子的峰提取以及定性定量分析至关重要。在峰提取以及定性分析上，一般通过与标准品的保留时间、精确分子量、质谱碎裂规律进行确证。在定量方面，往往通过标准品建立的标准曲线进行分析。但生物样本往往复杂，里面的成分会对目标代谢物的离子化效率产生干扰，这导致实际样本的离子化响应与标准曲线存在偏差，难以获得生物样本中目标代谢物的真实含量。在真实样本中建立的标准曲线可以极大提高目标分子的定量准确度。标准品种类制约了生物样本中多数代谢物的准确定量，急需建立新型的生物样本中代谢物准确的相对定量技术方法。

6、因此，提供一种能对真实样本中的代谢物分子进行提取、定性以及准确定量的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种从复杂样本中选择性捕获代谢物的探针及其制备方法和应用，该探针可以提高检测的灵敏度，对目标代谢物进行全定量。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针，所述磁性分子探针具有如通式(ⅰ)所示结构：

4、

5、其中，通式(ⅰ)中黑色圆点为具有磁性响应的磁芯；x为提高离子响应标签，y为同位素标签，z为靶向偶联基团；侧链含有作为正交断裂基团的二硫键；

6、x和y的位置可以互换，或者只存在一个，或者x和y都不存在；

7、所述代谢物为氨基化合物、羧基化合物、巯基化合物、羟基化合物、磷酸化合物和醛酮类化合物中的任意一种或多种混合。

8、进一步，所述具有磁性响应的磁芯材质为铁、钴、镍、四氧化三铁或含有上述材质的包被材料。

9、更进一步，所述包被材料的包被物为氨基化二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸和聚脲中的任意一种。

10、优选的，磁芯材质可以为任意具有磁响应的材料，可以选自铁粉、四氧化三铁、镍粉、钴粉及其组合物，还可以为磁芯与其他材料的组合物，例如二氧化硅包被的四氧化三铁、二氧化硅氨基包被的四氧化三铁、二氧化硅羟基包被的四氧化三铁、二氧化硅羧基包被的四氧化三铁。磁芯表面含有氨基以及取代氨基，用于后续衍生。

11、更优选的，磁芯为表面包被有聚脲合物氨基的四氧化三铁(fsp,fe3o4@sio2-polymers-nh2)。

12、采用上述进一步方案的有益效果在于：本发明上述方案包裹聚合物的磁珠比表面积更大，具有更高的负载，效率更高。

13、进一步，所述连接链x含有吡啶环。

14、更进一步，x为以下结构的任意一种：

15、

16、其中，r为h、ch3、ch2ch3、ch2ch2oh中的一种；m为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9中任意一个；n为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9中任意一个；

17、优选的，x为以下结构的任意一种：

18、

19、采用上述进一步方案的有益效果在于：上述方案可以明显提高探针质谱检测过程中的离子化效率。

20、进一步，所述连接链y含有甘氨酸或同位素标记的甘氨酸。

21、更进一步，y具有如下通式结构：

22、

23、其中，o为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9中任意一个；标签中的原子组成可以为12c、13c、14n、15n、16o、18o、h、d。

24、优选的，连接链y为含有同位素标记的标签，其为以下结构的任意一种：

25、

26、采用上述进一步方案的有益效果在于：引入同位素标记，可以辅助代谢物的定性和定量。

27、进一步，连接链z为代谢物靶向偶联基团，其为以下结构的任意一种：

28、

29、其中，p为1，2，3，4，5，6，7，8，9中一个。

30、优选的，z为以下结构的任意一种：

31、

32、采用上述进一步方案的有益效果在于：上述方案可以实现对不同类型目标代谢物的选择性偶联。

33、进一步，所述从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针可以选择以下结构

34、

35、

36、

37、

38、

39、

40、

41、本发明还提供了上述从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针的制备方法，包括以下步骤：

42、1)四氧化三铁@二氧化硅磁珠(fe3o4@sio2,fs)的制备：

43、

44、将乙醇加入至四氧化三铁粉末中，超声分散，并置于水浴中机械搅拌，然后逐滴加入nh3·h2o，再逐滴加入原硅酸四乙酯，反应结束后，经磁分离、洗涤、干燥获得灰褐色粉末fe3o4-sio2，即fs；

45、2)四氧化三铁@二氧化硅磁珠-聚合物(fe3o4@sio2-polymers,fsp)的制备：

46、

47、将fs粉末悬浮在dmf中，然后加入至ep管中，除去溶剂，备用；将edci、nhs加入离心管中，并加入mes溶液，完全溶解后将离心管中的混合物加入到含有fs的ep管中，搅拌反应，反应结束后，经磁分离除去溶剂，洗涤残留物，得到fe3o4-sio2-polymers，即fsp；

48、3)四氧化三铁@二氧化硅磁珠-聚合物-氨基(fe3o4@sio2-polymers-nh2,fsp-nh2)的制备：

49、

50、将1,3-二氨基丙烷与mes混合并添加到fsp中反应，反应结束后，通过磁分离除去溶剂，残留物依次用dmf、水和dmso洗涤，得到fe3o4-sio2-polymers-nh2，即fsp-nh2；

51、4)fe3o4-sio2-polymers-nh-cs-nh2(fsp-nh-cs-nh2)的制备：

52、

53、将fmoc-cs溶于二甲基亚砜中，加入hatu和dipea，然后将上述混合物加入至步骤3)制得的fsp-nh2中，反应结束后，通过磁分离除去溶剂，并用dmso洗涤残留物，然后加入dmf和dbu，反应结束获得fe3o4-sio2-polymers-nh-cs-nh2，即fsp-nh-cs-nh2；

54、5)4-((6-((((9h-fluoren-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-1-oxo-1-((pyridin-3-ylmethyl)amino)hexan-2-yl)amino)-4-oxobutanoic acid的合成：

55、

56、取n-boc-n'-fmoc-赖氨酸溶解在dmf中，加入hatu、dipea、苄胺吡啶，反应完成后，采用乙酸乙酯稀释，水洗，除去溶剂得到固体，将所得固体加入二氯甲烷，混匀后加入甲醇溶解，然后加入盐酸二氧六环反应，反应完成后除去溶剂；将上述反应产物加入200ml乙腈充分溶解，然后加入含1.0eq丁二酸酐的乙腈溶液100ml，再加入dipea至反应体系呈弱碱性，反应完成后除去溶剂、洗涤得到7.34g产物；取7.34g产物加入1.60g丁二酸酐，3.34ml三乙胺，再加入30ml甲醇和50ml乙腈溶解，反应产生白色固体，过滤收集固体，乙腈洗涤，得到目标产物，命名为pynh2；

57、6)fsp-py-gly-nh2磁珠的合成：

58、

59、将pynh2和hatu溶于dmso，混合均匀，然后加入dipea和fsp-nh-cs-nh2反应完成后，洗涤，将所得产物中加入dmf和dbu，脱fmoc，反应完成后，洗涤；然后将fmoc-gly、hatu和dipea溶于dmso后，加入反应产物中，反应完成后洗涤，加入dbu脱fmoc，得到fsp-py-gly-nh2磁珠(fsp-nh2-cs-py-gly-nh2磁珠)；

60、7)从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针的合成：取fsp-py-gly-nh2磁珠进一步反应得到从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针。

61、进一步，步骤1)中所述四氧化三铁的质量、nh3·h2o的体积和原硅酸四乙酯的体积比为4g:10ml:10ml；

62、所述水浴温度为40℃；

63、采用上述进一步方案的有益效果在于：采用上述方案可以实现对fe3o4-sio2的高效合成。

64、进一步，步骤2)中所述edci的摩尔质量与nhs的摩尔质量与mes溶液的体积的比为125mmol：125mmol：5ml；

65、所述mes溶液的浓度为100mm，溶剂为质量浓度0.5％吐温；

66、fs粉末的质量与混合物的体积的比为2mg：3ml；

67、搅拌速率为1800rpm，搅拌时间为2h；

68、采用上述进一步方案的有益效果在于：上述方案有利于可以实现聚合物对磁珠的高效包裹。

69、进一步，步骤3)中所述1,3-二氨基丙烷与mes的体积比为1:9。

70、采用上述进一步方案的有益效果在于：可以实现对磁珠表面聚合物的高效氨基化。

71、进一步，步骤4)中所述fmoc-cs的质量与hatu的质量与dipea的体积比为10mg：12mg：100μl；

72、所述dmf和dbu的体积比为1:1；

73、采用上述进一步方案的有益效果在于：可以实现对fmoc保护基团的高效去除。

74、进一步，步骤5)中所述n-boc-n'-fmoc-赖氨酸与hatu与dipea与苄胺吡啶的当量比为1:1.2:2:1.1；

75、所述二氯甲烷与甲醇与盐酸二氧六环的体积比为4:1:1；

76、采用上述进一步方案的有益效果在于：可以实现对n-boc-n'-fmoc-赖氨酸的高效合成以及脱boc保护。

77、进一步，步骤6)中pynh2与hatu与dipea的当量比为1:2:3；

78、所述dmf和dbu的体积比为1:1；

79、所述fmoc-gly与hatu与dipea的当量比为1:1.2:3。

80、采用上述进一步方案的有益效果在于：可以将fmoc-gly高效偶联在磁珠之上。

81、进一步，步骤7)的磁性分子探针的合成为以下步骤的任意一种：

82、7-1)fsp-nh2-cs-py-gly-ncs的合成：

83、

84、取300mg fsp-nh-cs-py-gly-nh2磁珠，称取100mg 4-羧基苯基异硫氰酸酯，加入255mg hatu，0.293ml dipea，溶于dmso中，室温反应30min，得到fsp-nh2-cs-py-gly-ncs探针，即为从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针；

85、7-2)fsp-nh2-cs-py-gly-cooh的合成：

86、

87、取300mg fsp-nh-cs-py-gly-nh2磁珠，称取丁二酸酐1.0g，加入100mg dmap，反应1h，得到fsp-nh2-cs-py-gly-cooh探针，，即为从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针；

88、7-3)fsp-nh2-cs-py-gly-mal的合成：

89、

90、取300mg fsp-nh-cs-py-gly-nh2磁珠，称取86.8mg 2-马来酰亚胺基乙酸，加入255mg hatu，0.293ml dipea，溶于dmso中，室温反应30min，得到fsp-nh2-cs-py-gly-mal探针，即为从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针；

91、7-4)fsp-nh-cs-py-gly-nhnh2的合成：

92、

93、取300mg fsp-nh-cs-py-gly-nh2磁珠，称取142mg fmoc-肼，加入255mg hatu，0.293ml dipea，溶于dmso中，室温反应30min，得到fsp-nh-cs-py-gly-nhnh2探针，即为从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针。

94、本发明还提供了其他磁珠制备从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针的方案，其为以下方法的任意一种：

95、制备fsp-nh-cs-gly-nh2：

96、

97、取2.4g磁珠，加入fmoc-gly(1.0g，3.36mmol，1.0eq)，hatu(1.53g,4.03mmol,1.2eq)，充分溶解后加入dipea(1.30g，1.76ml，10.08mmol，3.0eq)。后洗涤，加入dbu，脱fmoc得到fsp-nh-cs-gly-nh2探针。

98、制备fsp-nh-cs-gly-cooh：

99、

100、取300mg磁珠，称取丁二酸酐1.0g，加入100mg dmap，反应1h。

101、制备fsp-nh-cs-gly-ncs：

102、

103、取300mg磁珠.称取ncs(100mg,0.56mmol，1.0eq)，加入hatu(255mg，0.67mmol，1.2eq)，dipea(0.293ml,1.68mmol,3.0eq)，溶于dmso中，室温反应30min，得到fsp-nh-cs-gly-cooh探针。

104、制备fsp-nh-cs-gly-mal：

105、

106、取300mg磁珠，称取2-马来酰亚胺基乙酸(86.8mg,0.56mmol，1.0eq)，加入hatu(255mg，0.67mmol，1.2eq)，dipea(0.293ml,1.68mmol,3.0eq),溶于dmso中，室温反应30min，得到fsp-nh-cs-gly-mal探针。

107、制备fsp-nh-cs-gly-nhnh2：

108、

109、取300mg磁珠，称取fmoc-肼(142mg,0.56mmol，1.0eq)，加入hatu(255mg，0.67mmol，1.2eq)，dipea(0.293ml,1.68mmol,3.0eq)，溶于dmso中，室温反应30min，得到fsp-nh-cs-gly-nhnh2探针。

110、本发明还提供了上述从复杂样本中特异捕获代谢物的磁性分子探针的应用方法，包括以下步骤：

111、1)取0.1-10mg所述材料，加入0.2-1ml二甲亚砜、0.3ml血清、0.001-0.1ml三乙胺，0-50℃振荡0.1-5h，反应完成后，磁分离除去溶剂，依次用磷酸盐缓冲液洗涤、水洗、乙腈和水的混合溶液洗涤，更换离心管，备用；

112、2)捕获得到的化合物断键：

113、将步骤1)制备的磁性材料混悬于0.1-1ml乙腈或甲醇的水溶液中，加入0.01ml二硫代苏糖醇振荡断键1-24h，断键完成后，磁分离，吸取溶液，稀释5倍，离心，用于后续的质谱检测分析。

114、本发明还提供了上述从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料的定性方法，包括以下步骤：

115、将15n、14n、13c标记的生物样本等比混合，通过三者的精准分子量和强度的比值可以确定目标分子峰，排除杂峰干扰。

116、本发明还提供了上述从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料的绝对定量方法，包括以下步骤：

117、通过将15n标记的恒定浓度的氨基标准品做内标，与14n标记的梯度氨基标准品混合，质谱检测，建立浓度(c14n,x)与强度比值(i15n/i14n,y)的标准曲线，可以实现目标分子的绝对定量。

118、本发明还提供了上述从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料的全目标分子相对定量方法，包括以下步骤：

119、通过15n标记的未知浓度生物样本做内标，与梯度的14n标记的生物样本混合，质谱检测，建立浓度比值(c15n/c14n,x)与强度比值(i15n/i14n,y)的标准曲线，可以实现生物样本目标分子的相对定量。

120、采用上述进一步方案的有益效果在于：不仅在操作上更加简便，不受大型仪器(如高速离心机)的限制，且实现了材料与溶液的彻底分离，更有利于后续实验的进行。

121、本发明的有益效果在于：本发明提供了一种全新的分子探针、制备方法，以及该探针在复杂样本中选择性捕获代谢化合物的应用方法。该磁性分子探针将氨基、羧基、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、酰肼基团及其类似物固定在磁性材料上，形成磁性分子探针，用于选择性偶联羧基、磷酸、氨基、羟基、巯基、醛酮化合物，其他杂质可以通过简单的磁分离和洗涤的方法除去。此外，连接链中含有二硫键，在氨基捕捉和洗涤过程中稳定，可以在二硫代苏糖醇等还原剂的存在下选择性断裂，将捕获的目标化合物从磁性材料上断裂下来。断键溶液经过简单的磁分离后便可以直接用于后续实验分析。

122、与传统的分析方法相比，本发明提供的方法中富集条件温和、材料廉价易得，容易制备，捕获的特异性高，效果显著。采用本发明提供的方法可以除去大量的磷脂、各种盐类等基质干扰，有利于后续的质谱分析，通过甘氨酸同位素标记的代谢物作为内标，能够实现复杂生物样本中目标分子的确认、绝对定量和相对定量。这对于新的代谢化合物发现，生物标志物筛查研究及重大疾病的预警、疾病发展、预后评估等均具有重要的意义。