蛋白质修饰的GaN纳米线阵列及其制法和用途的制作方法

专利名称：蛋白质修饰的GaN纳米线阵列及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及GaN纳米线阵列，具体地说，是蛋白质修饰的GaN纳米线阵列及其 制法和用途。
背景技术：
氮化镓(GaN)纳米线同氧化锌(ZnO)、硅纳米线(Si)、碳纳米管(CNT) —样， 是一种重要的一维半导体材料。在氮化镓晶体中，镓元素与氮元素之间形成强共价键， 使其表现出可以与碳纳米管相媲美的的机械性能。GaN纳米线具有相对稳定的物理化学 性质，它可以承受酸、碱、有机溶剂的侵蚀，有高度的热稳定性，可以承受900°C的高 温。现有的技术已经可以熟练制备直径5 500nm，毫米级长度的纳米线。GaN纳米线具有高度的生物兼容性能，可以在生物体内使用。作为一种一维纳 米材料，它具有高的面积/体积比。未经处理的GaN纳米线表面没有官能团，不能用 来嫁接有机单分子膜。GaN纳米线表面可以通过化学氧化例如硫酸/双氧水处理产生活 性-OH官能团，但该技术所产生的-OH数量相对有限，因此寻找生成大量-OH的制备 方法十分有意义。原子层沉积技术(ALD)属于真空化学气相沉积技术(CVD)，该项技 术在产生致密氧化层的同时，能在其表面产生大量的-OH官能团，这部分的-OH就可以 用来修饰有机单分子膜，进而嫁接生物分子。生物分子表面含有众多的官能团，可以与有机分子上的活性官能团发生欧联反 应，从而将生物分子嫁接在GaN纳米线表面上。直径处于100 500nm之间、间距处于 200nm 20 μ m之间的直立GaN纳米线阵列对于生物分子的进出十分有利，从而提高嫁 接或分离效率。聚乙二醇(PEG)具有高度的非特异性排斥生物分子能力，在PEG的末 端固定生物分子，可避免生物分子的物理性吸附，从而大大提高生物分子的选择性。同 时，相对于多孔的硅、铝等基生物传感器来说，由于GaN纳米线阵列直立，溶液在其表 面的流动性更高，便于嫁接、分离生物分子。GaN纳米线可以允许红外光谱穿过，其表面的官能团及有机修饰物包括生物分 子可以吸收红外光，故利用红外光谱可监控GaN纳米线表面的化学反应。ALD沉积层 的厚度通常在2 10纳米，微米级波长的红外光可以穿过ALD沉积层，故ALD沉积的 GaN纳米线也可以用红外表征。生物体内的某些痕量存在蛋白对生理功能起着极其重要的作用，提纯、识别、 克隆它们具有重要的意义。由于GaN纳米线具有高比表面积，可作为嫁接高密度的生物 分子的载体。当生物分子嫁接之后，就可以与与之相应的生物分子(例如抗体-抗原、 受体-给体、酶-底物等)发生相互识别，然后通过一些检测手段，把这些生物分子的信 息采集出来。由于生物分子的识别属可逆、可控的，该阵列可重复多次使用。通过生物 分子的识别，可以将溶液中少量存在的生物分子捕获出来，实现浓缩分离目标生物分子 的目的，避免了生化分离的高代价投入。通常GaN纳米线阵列是一种垂直直立的纳米线，激光在其表面很容易发生干涉。当生物分子识别前后，其干涉条纹就会发生明显变化，采集其干涉数据，计算其光 学厚度，可定量得到嫁接在其表面生物分子的嫁接密度。另外，若采用荧光标记的生物 分子嫁接在纳米线的表面，其荧光强度就可以通过荧光扫描获得。利用荧光分析法，可 定量得到荧光分子的数量，即可推导出生物分子的嫁接密度。目前，有关GaN纳米线的专利主要集中在发光二极管和激光器方面。美国多 项专利如6818061、7335262涉及GaN纳米线的制备。美国专利7421274，7420147， 6949773，欧洲专利EP1145282A2，中国台湾专利TW569474涉及GaN纳米线在发光二极 管方面的应用。中国专利200510048111涉及GaN纳米线的制备。中国专利200780016946 涉及GaN纳米线的制备和在发光二极管和激光器方面的应用。

发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白质修饰的GaN纳米线阵列及其制法，以及将之用 于蛋白质分子的分离、识别或检测。本发明的技术方案如下一种蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，它是以直立的GaN纳米线阵列作为基片， 纳米线表面经化学氧化或等离子氧化产生Ga-OH官能团；或者经原子层沉积法在纳米 线表面沉积Si02、TiO2或Al2O3膜，其表面经水解具有-OH官能团，GaN纳米线表面 的-OH官能团与SiCl4反应形成-O-Si-Cl键，最后通过聚乙二醇分子与蛋白质分子连接 形成蛋白质修饰的GaN纳米线阵列。上述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，所述的蛋白质分子可以是任何蛋白质分 子，例如亲和素、小鼠单克隆抗体或脑利尿钠肽的单克隆抗体。上述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，所述的聚乙二醇是数均分子量为 600-3000的聚乙二醇。一种制备上述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，它包括下列步骤步骤1.将直立的GaN纳米线阵列用化学氧化法氧化或等离子辐射氧化，使纳米 线表面产生-OH官能团；步骤2.将步骤1得到的表面具有-OH官能团的GaN纳米线阵列在室温浸泡在纯 SiCl4液体中0.5-2小时，使纳米线表面的-OH基转化为-O-SiCl3 ；步骤3.将步骤2得到的表面具有-O-SiCl3的GaN纳米线阵列置于O.lmol/L的 一端带有NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)的聚乙二醇的氯仿溶液中，在黑暗中放置0.5小时， 取出GaN纳米线阵列，清洗，干燥，得到NHS活化的GaN纳米线；步骤4.将步骤3得到的NHS活化的GaN纳米线置于蛋白质的水或PBS(磷酸 缓冲溶液，pH = 7 10)溶液(10-50nmol/L)中放置0.5 1小时，取出GaN纳米线阵 列，清洗，干燥，得到蛋白质修饰的GaN纳米线。上述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，步骤1所述的化学氧化法是 将GaN纳米线阵列置于硫酸和双氧水混合溶液(硫酸双氧水=3 lv/v)或硫酸与硝酸 混合溶液(硫酸硝酸=1 lv/V)中，在80°C下加热4 10小时，取出清洗，吹干。上述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，所述的步骤1可以用如下方 法替代
步骤1’将直立的GaN纳米线阵列用原子层沉积法在纳米线表面沉积Si02、TiO2 或Al2O3膜，其表面经水解产生-OH官能团。上述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，所述的步骤3、4可以用如下 两个步骤替代步骤3’将步骤2得到的表面具有-O-SiCl3的GaN纳米线阵列置于O.lmol/L的 一端带有生物素的聚乙二醇DMF(二甲基甲酰胺)溶液中，加入少许三乙胺，放置0.5 1小时，清洗，干燥，得到生物素修饰的GaN纳米线。步骤4’将步骤3’得到的生物素修饰的GaN纳米线置于浓度为10-50nmol/mL 的亲和素水或PBS溶液中，放置0.5小时，清洗，干燥，得到亲和素修饰的GaN纳米线。上述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，所述的蛋白质是任何蛋白质 分子，它们可以是亲和素、小鼠单克隆抗体或脑利尿钠肽的单克隆抗体。本发明中用来嫁接有机分子膜的有机分子含有双官能团，一端可以与GaN表 面-OH反应的官能团(如Si-Cl)，另外一端与含有-NH2官能团发生交联的官能团(如 NHS酯)。这里先将GaN阵列室温置于纯的SiCl4溶液0.5 2小时，GaN纳米线表面 的-OH就与SiCl4反应，产物是-O-Si-Cl3,多余的Si-Cl可以与PEG—端的-OH反应， 从而将PEG嫁接在GaN纳米线上，在PEG的另外一段通过酰胺键(-CONH-)与生物素 或亲和素分子相连接，从而将它们固定在GaN的表面。这里，依据生物素和亲和素的官 能团不同分别采用两种修饰路线。一种先固定生物素，然后识别亲和素；另一种先固定 亲和素，然后识别生物素。本发明可以首先合成PEG-Biotin，利用生物素分子一端的羧基活化成NHS酯， 然后与PEG-NH2上的-NH2反应，从而合成PEG-Biotin
S Χ0"将GaN纳米线表面的Si-Cl与PEG-Biotin另外一端的OH反应，从而将生物素通
过酰胺键嫁接在GaN表面。在水相中，亲和素分子很容易与生物素分子发生识别，从而 将亲和素固定在GaN纳米线表面。生物素与亲和素分子间的作用力为氢键、范德华力、 静电力。其反应过程如图1所示。本发明也可以首先合成GaN-PEG-NHS酯，将PEG-NH2上的-NH2与双琥珀酰 亚胺(SC，bis (N-succinimidyl) carbonate)反应，生成活性的 PEG-NHS 酯
—O S V1O Ov
咖叫 + Q-o-o-o-yi_^ 舰[Ι- -Ο-Ν^]
PEG-NH2O
PEG-NHS该NHS酯可与亲和素分子上的另一-NH2S生交联反应。水相下，嫁接亲和素 的GaN可以与生物素发生识别，从而将生物素转移在GaN纳米线表面。其反应过程如图
6
人入入
HN NH DCONHS HN NH PEG-NH2HN NH
O 广\ H2
Biotin Bioiiit-NHSBiotin-PEG2所示。鉴于蛋白质(如小鼠单克隆抗体、脑利尿钠肽的单克隆抗体等)的表面均含有 大量的活性-NH2,故均可以用上述方法嫁接这些蛋白质分子。当这些抗体分子嫁接后， 纳米线就可以对应的抗原分子(如山羊鼠抗免疫蛋白(IgG)、脑利尿钠肽(BNP))发生识 别，从而将抗原分子从液相转移到GaN纳米线表面。反之，先固定抗原，然后与它们的 抗体发生识别，从而将抗体分子转移到GaN纳米线表面。显然，这种方法也可以嫁接未 知的蛋白质分子，所嫁接的生物分子与有机分子之间通过共价的酰胺键相连。本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，可以应用于4个方面的生物分子检 测。包括蛋白质的分子识别、及识别前后的激光干涉光谱、蛋白质分子的荧光检测、蛋 白质分子的基质辅助激光解离飞行时间质谱检测。本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，可用于蛋白质的亲和分离。将生物 素固定的GaN纳米线阵列置于含有亲和素的混合溶液中，依靠生物素和亲和素的特殊识 别，溶液中的亲和素与生物素发生作用而被固定在GaN纳米线上，将该芯片取出，置于 去离子水中，微微加热(50°C)半小时，亲和素从芯片上生物素的束缚中脱离，进入溶液 中。将溶液低温干燥，就可得到高纯度的活性亲和素。反之，PEG-NHS酯活化的样品 也可以先固定亲和素，从而提纯生物素。同理，将NHS酯活化的GaN芯片分别置于抗 体(如脑利尿钠肽(BNP)的抗体、小鼠单克隆抗体)的PBS缓冲溶液中孵育一小时，取 出后用PBS缓冲和去离子水清洗，干燥，这两种抗体上的-NH2与NHS作用，从而将它 们固定到GaN芯片上。将芯片置于含有对应抗原(如脑利尿钠肽(BNP)、山羊鼠抗免疫 蛋白(IgG))的PBS缓冲溶液中，依靠抗体-抗原相互作用，BNP和IgG抗原分子就被固 定在GaN芯片上，置于一定pH值的PBS溶液中，洗脱所固定的抗原BNP和IgG分子。 冷冻、干燥即可得到高纯度的抗原BNP和IgG。反之，先固定抗原，后识别抗体分子， 就可以分离抗体分子。本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，可用于激光干涉传感器。本发明使用 的均勻分布的规则的直立六方棱柱型GaN纳米线(纳米线形貌见图3)，入射激光在纳米 线的表面发生反射，多束反射激光发生干涉，利用检测器把干涉条纹采集，利用利用公 Snd=(AkA1X2)7^U1-X2), η是GaN的平均折射率，d是膜的厚度，
别是相邻的两个波峰或波谷的波长值，而对于相邻的两个波峰或波谷来说，式中Ak = 1.0，可得干涉层的相对厚度。当生物分子嫁接或识别之后，由于生物分子自身的尺寸 (蛋白质的约IOnm)，干涉层厚度发生变化，其变化量来自于固定的生物分子。分别采集 嫁接前后的干涉光谱，将数据代入公式，分别计算了光学厚度的变化量，依此衡量所嫁 接蛋白质分子的嫁接密度，也即得到目标生物分子的浓度。本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列可用于荧光检测。将生物分子进行荧光 标记，利用荧光扫描可获得荧光图片。依据现有的荧光分析技术，一定浓度下荧光强度 与荧光分子数呈线性对应关系，而荧光分子数与生物分子数具有固定的比例，这样借助 荧光测量，可以定性、定量获得GaN纳米线所固定的生物分子数量。本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列可用于基质辅助激光解离飞行时间 (MALDI-ToF-MS)质谱检测。在NHS酯活化的GaN芯片上，首先固定亲和素、脑利尿 钠肽(BNP)或小鼠单克隆抗体，然后亲和浓缩固定生物素、脑利尿钠肽(BNP)、山羊鼠抗免疫蛋白(IGg)。将干燥的样品置于MALDI-T0F-MS检测，就可以得到生物素、脑利 尿钠肽、山羊鼠抗免疫蛋白的质谱图片。相对于普通的不锈钢衬底，蛋白质修饰的GaN 纳米线陈列具有高得多的比表面积，PEG聚合物链可以排斥非目标蛋白质分子在纳米线 表面的非特异性吸附，通过抗体-抗原相互作用可筛选高度浓缩的目标生物分子，从而 获得更好的检测限。本发明的NHS酯活化的GaN芯片还可以检测未知的蛋白质分子。将NHS酯 活化的GaN芯片置于牛血清蛋白或肽(Fmoc-EAALKLAR)的溶液中，牛血清蛋白或肽 (Fmoc-EAALKLAR)就被固定在GaN的表面，测试MALDI-ToF_MS，牛血清蛋白或肽 (Fmoc-EAALKLAR)的质谱就会被采集。利用国际上已经建立了的蛋白质序列数据库比 较，利用软件，可以分析出蛋白质的序列。同样，由于未知蛋白分子表面也含有-NH2, 它们也可以被固定在GaN纳米线上，通过MALDI-ToF-MS检测得到其序列，从而揭示未 知蛋白。


图1、生物素/亲和素分子固定路线。图2、亲和素/生物素分子固定路线。图3、垂直生长GaN纳米线的平面和剖面SEM图片，a为平面图；b为剖面图。图4、PEG-Biotin合成红外5、硫酸/双氧水处理的，和气相沉积后Si02、Al2O3> TiO2覆盖的GaN纳米 线的Hl光谱，a为硫酸/双氧水处理；b为覆盖的TiO2 ； c为Al2O3覆盖的；d为SiO2覆盖的。图6、图5中四样品的OH含量对比图。图7、在SiO2覆盖GaN纳米线表面嫁接PEG-Biotin和Streptavidin的红外光谱。图8、图5中四样品的TEM图片。图9、图5中四样品表面嫁接亲和素后的TEM图片。图10、图9样品嫁接亲和素前后的激光干涉曲线。A为亲和素修饰前的GaN纳 米线阵列的激光干涉曲线；B为亲和素修饰后的GaN纳米线阵列的激光干涉曲线。图11、图5中四样品表面嫁接荧光标记亲和素的荧光扫描图。图12、纳米线阵列表面分离的荧光标记亲和素的荧光图像。图13、牛血清蛋白BSA的MALDI-Tof-MS测试。图 14、Fmoc-EAALKLAR 的 MALDI-Tof-MS 测试。图15、脑利尿钠肽的的MALDI-Tof-MS测试对比。
具体实施例方式实施例1.在GaN纳米线表面产生Ga_OH官能团图3显示GaN纳米线阵列(USA，NIST)的平面和剖面SEM图片。从图中可 见单根GaN纳米线的直径处于50 500nm之间、高度处于9 10 μ m之间，纳米线 阵列的间距处于200nm 20μιη之间，所有GaN纳米线均显示了平整的表面，处于与支
持片基直立的位置。
将GaN纳米线阵列置于80°C的硫酸双氧水(3 1)的溶液中(5mL)，处理4 小时，利用超声将GaN纳米线从生长片基上剥离，将剥离的GaN纳米线分散在CCl2H2 溶液中，用移液器将溶液分散在干燥的KBr晶体片上，将样品置于80°C烤箱中干燥4小 时，样品做红外光谱分析。红外光谱如图5a，在3400、1600cm1区域出现了-OH的红 外吸收。其中3168cm 1吸收峰对应OH，该OH可以用来嫁接有机分子膜。将GaN纳米线阵列等离子处理2分钟(Harrick等离子体清洗机(PDC-002)，30W 功率，Iosccm空气)，利用超声将GaN纳米线从生长片基上剥离，将剥离的GaN纳米线 分散在CCl2H2溶液中，用移液器将溶液分散在干燥的K&·晶体片上，将样品置于80°C烤 箱中干燥4小时，样品做红外光谱分析。在3400、1600cm1区域出现了 -OH的红外吸 收。其中3168cm1吸收峰对应OH，该OH可以用来嫁接有机分子膜。将GaN纳米线阵列表面分别各沉积TiO2, Al2O3，SiO2沉积ALD膜。高度真空 下，先通入前体Al (OR)3和高纯水蒸汽，在GaN纳米线表面形成一层Al2O3膜，其表面 具有OH，然后分别通入TiCl4, SiCl4和高纯水蒸汽，分别形成TiO2, SiO2膜，其表面具 有OH。这样，氧化层就生长在GaN纳米线的表面，氧化层的厚度与通入气体的循环次 数有关。利用超声将GaN纳米线从生长片基上剥离，将剥离的GaN纳米线分散在CCl2H2 溶液中，用移液器将溶液分散在干燥的KBr晶体片上，将样品置于80°C烤箱中干燥4小 时，样品做红外光谱分析。三种ALD沉积GaN纳米线的红外光谱分别对应图5b_5d，在 3400、1600cm 1区域出现了 -OH的红外吸收。其中3168cm 1吸收峰对应OH，该OH可 以用来嫁接有机分子膜。将图5a-d的红外光谱曲线进行拟合，得OH相对含量(O-H面积/Ga-N面积) 分别为6.70%，47.32%, 69.86%,和90.32%。其结果列于图6，相比，ALD沉积层 使-OH 含量增加了 6.06，9.43，12.48 倍。将上述4种产生-OH的GaN纳米线从片基上剥离，分散在甲醇中，然后滴在 TEM铜网上，做高分辨TEM图片，见图8，a为硫酸/双氧水处理的，b、C、d分别为 SiO2> A1203、TiO2覆盖GaN纳米线。从图上可得，三种ALD涂层覆盖厚度分别为4 5nm, 5 6nm, 10 12nm。实施例2.合成Biotin-NHS酉旨取0.5g生物素溶解于50mL干燥的DMF(二甲基甲酰胺)溶液，放入0.51g DCC (N，N-二环己基碳二亚胺)和0.26gNHS，50°C下搅拌16小时，将不溶解沉淀过滤 除去，加入过量的干燥乙醚，使之产生白色沉淀，抽滤、得白色的Biotin-NHS产品。药 品做红外光谱，见图 4b，出现了 3228，3108，3063，2939，2915，2875，2846，1818， 1787，1745，1729，1696cm"1 的吸收峰。实施例3.合成 PEG-Biotin取0.225g biotin-NHS 加入 50mL 干燥的氯仿溶液中，加入 l.Og PEG-NH2 (Μ = 3000) (Sigma-Adrich购得)和少量的三乙胺，搅拌6小时，过滤不溶物，加入过量的干 燥乙醚，使之产生白色沉淀。药品做红外光谱，见图4d，出现了 3340，2978，2945， 2883，2857，2806，2739，1702，1698，1667cm1 的吸收峰。表明合成了 PEG-Biotin。取0.225g biotin-NHS 加入 50mL 干燥的氯仿溶液中，加入 0.2g PEG-NH2 (Μ = 600) (Sigma-Adrich购得)和少量的三乙胺，搅拌1小时，过滤不溶物，加入过量的干燥乙醚，使之产生白色沉淀。药品做红外光谱，出现了 3340，2978，2945，2883，2857， 2806，2739，1702，1698，1667cm"1 的吸收峰。表明合成了 PEG-Biotin。取0.225g biotin-NHS 加入 50mL 干燥的氯仿溶液中，加入 0.33g PEG-NH2 (Μ = 1000) (Sigma-Adrich购得)和少量的三乙胺，搅拌2小时，过滤不溶物，加入过量的干燥 乙醚，使之产生白色沉淀。药品做红外光谱，出现了 3340，2978，2945，2883，2857， 2806，2739，1702，1698，1667cm"1 的吸收峰。表明合成了 PEG-Biotin。实施例4.生物素修饰的GaN纳米线阵列的制备将SiO2功能化的GaN纳米线阵列(样品对应图5d)置于纯SiCl4溶液中放置1小 时，样品洗涤干燥后置于O.lMol/L的PEG (Μ = 3000) -Biotin (生物素)的DMF溶液，于 黑暗处放置0.5小时，取出GaN纳米线阵列，清洗，干燥，从阵列片基上剥离，做红外光 谱分析，红外光谱图见图 7h。出现了 PEG(2887，2860cm O 和 Biotin(1665，1652cm1) 的特征吸收峰。表明PEG-Biotin已经被嫁接在GaN纳米线的表面。同样制备PEGM = 1000,和PEG M = 600对应的生物素修饰的GaN纳米线阵列，进行红外光谱分析，均出 现了 PEG-Biotin的特征吸收峰。实施例5.用生物素修饰的GaN纳米线阵列分离亲和素将上述实施例4中所得的样品置于Streptavidin(亲和素)(ΙΟηΜοΙ/mL)的水溶
液中，孵育半小时，取出样品，洗净，吹干，从片基上剥离纳米线，做红外分析(见 图7i)。红外中出现了亲和素的酰胺吸收峰。1652cm1对应来自亲和素的C = O峰， 1543cm1对应自亲和素的N-H峰。表明亲和素已经被固定在纳米线的表面。亲和素与 生物素之间的作用力来源于氢键、范德华力、静电力。同样用PEG M = 1000，和PEG M = 600对应的生物素修饰的GaN纳米线阵列，进行相同的实验，均出现了亲和素的酰 胺吸收峰。实施例6.用生物素修饰的GaN纳米线阵列分离亲和素将硫酸-双氧水处理的GaN纳米线阵列和覆盖Al2O3和TiO2的GaN纳米线阵列分 别进行实施例4和5的实验，样品做红外分析，均出现了 PEG，生物素和亲和素的特征吸 收峰，它们的红外光谱中分别出现了 PEG(2887，2860cm1)，Biotin(1665, 1652cm1)， 亲和素(1543，1652cm O的特征吸收峰。实施例7.合成PEG-NHS取3g PEG-NH2 (Μ = 1500)置于干燥的乙腈中，加入0.52g SC (双琥珀酰亚胺) 和少许的三乙胺，室温下搅拌0.5小时，减压蒸干，乙腈重结晶所得的PEG-NHS。样 品做红外光谱，出现了 2939，2915，2875，2846，1818，1775，1735，1729cm1 的吸收 峰。表明生成PEG的NHS酯。取2g PEG-NH2(Μ = 2000)置于干燥的乙腈中，加入0.44g SC和少许的三乙 胺，室温下搅拌2小时，减压蒸干，乙腈重结晶所得的PEG-NHS。样品做红外光谱，在 1775，1735cm 1处出现了 NHS的特征吸收峰。表明生成PEG的NHS酯。实施例8.PEG-NHS修饰的GaN纳米线阵列的制备将实施例1中用硫酸-双氧水处理的产生-OH的GaN纳米线阵列置于纯SiCl4溶 液中放置1小时，取出样品，洗净，吹干，得Si-Cl功能化样品。将该样品放入O.lMol/ L的PEG-NHS (Μ = 2000)的氯仿溶液中，加入少许三乙胺，反应半小时，取出样品，洗
10涤干燥的PEG-NHS修饰的GaN纳米线。利用超声将GaN纳米线从生长片基上剥离， 将剥离的GaN纳米线分散在CCl2H2溶液中，用移液器将溶液分散在干燥的KBr晶体片 上，将样品置于80°C烤箱中干燥4小时，样品做红外光谱分析。红外光谱中出现2939， 2915，2875，2846，1818，1775，1735，1729，534cm-1 的吸收峰。表明 PEG-NHS 被固 定在GaN纳米线上。实施例9.蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的制备取实施例8制备的PEG-NHS修饰的GaN纳米线阵列分别置于亲和素(IOnMol/ mL)、牛血清蛋白(20nMol/mL)、肽(Fmoc-EAALKLAR) (50nMol/mL)、脑利尿钠肽单 克隆抗体(ΙΟηΜοΙ/mL)、老鼠单克隆抗体(50nMol/mL)的溶液中处理半小时，取出，清 洁，干燥，剥离GaN纳米线做红分析。它们的红外光谱中均出现了酰胺1( 1560cm O 和II( 1650cm1)的红外吸收峰。表明这些生物分子已经被嫁接在纳米线的表面。实施例10.用蛋白质修饰的GaN纳米线阵列分离相对应的蛋白质室温下，将上述实施例9中脑利尿钠肽的单克隆抗体、老鼠单克隆抗体修饰的 GaN纳米线阵列分别置于脑利尿钠肽(lnMol/mL)、山羊鼠抗免疫蛋白(5nMol/mL)的溶 液中，10分钟取出，清洁，干燥，剥离GaN纳米线做红分析。它们的红外光谱中出现了 加强的酰胺I ( 1560cm1)和II ( 1650cm1)的红外吸收峰。表明这两种抗原已经被嫁 接在纳米线的表面。实施例11.将上述实施例5和实施例6中固定有亲和素的生物素修饰的GaN纳米线阵列用醋 酸双氧铀染色，取出，清洁，干燥，剥离GaN纳米线后，做TEM分析，样品出现了亲和 素分子的形貌(见图9)。图5a_d(硫酸/双氧水处理的，Si02、Al2O3> TiO2覆盖GaN 纳米线)样品对应于固定有亲和素的生物素修饰的GaN纳米线阵列的TEM图为图9i_l。 由于蛋白质分子的覆盖，N元素含量明显增加。实施例12.用荧光标记的亲和素(lnMol/mL)代替没有荧光标记的亲和素，重复上述实施 例5和6中的实验。将得到固定荧光亲和素的GaN纳米线阵列清洁，干燥，剥离出GaN 纳米线，做荧光扫描，得到荧光图片列于图11，上述图5a-d中4个样品(硫酸/双氧水 处理的，Si02、A1203、TiO2覆盖GaN纳米线)的荧光图像分别对应图lli-1。其平均荧 光强度分别为 17.02，133.52，108.75，167.02。实施例13.将上述实施例5和6所得的样品分别作激光干涉光谱，得到图10。利用前面所 述公式计算亲和素分子嫁接前后的光学厚度分别为4800和5500nm，即亲和素分子嫁接之 后，光学厚度增加值(Cnd2-Iid1)/M1* 100% )为14.5%。实施例14将上述实施例9得到的亲和素、肽、和牛血清修饰的的GaN纳米线阵列样品 做激光干涉光谱。利用公式，计算亲和素、肽、和牛血清嫁接后光学厚度分别增加 22.5%, 11.3%,和 14.2%。实施例15将上述实施例9得到的牛血清蛋白和肽(Fmoc-EAALKLAR)修饰的的GaN纳米线阵列做MALDI-ToF-MS测试。谱图如图13-14。谱图中出现了牛血清蛋白和肽分子 质谱峰，表明GaN纳米线表面固定的牛血清蛋白、肽分子可以通过MALDI-ToF-MS检 测。其中，图14b经国际蛋白质库解析，该肽的部分氨基酸序列经解析为EAALKLAR。 同理，未知蛋白也可以固定在GaN纳米线上，其氨基酸序列也可以MALDI-ToF-MS解析 而得。实施例16.将上述实施例9得到的脑利尿钠肽单克隆抗体修饰的样品(1 X Icm2)用去离子水 浸润，取101^脑利尿钠肽抗原溶液(11^01/1!^)滴在其上，封闭孵育lOmin，取出GaN 纳米线阵列样品，清洗，干燥，做MALDI-ToF-MS测试。谱图见图15a，谱图中出现了 强的脑利尿钠肽质谱峰。取10 μ L脑利尿钠肽抗原溶液(lnMol/mL)滴在不锈钢的衬底 上，氮气吹干，做MALDI-ToF-MS测试。谱图列于图15b，对比两条曲线，图15b显示 了高度的噪声干扰，显然在GaN纳米线阵列所得到的谱图具有高度的信噪比。实施例17.将上述实施例12得到的纳米线样品(图Ili和111)分别置于5mL5(TC的去离子 水中，孵育1小时后，分别取 ο μ L两种溶液滴在2个清洁的硅片上，干燥气体吹干，做 荧光扫描，图片见图12。显然，两个表面均呈现了不同荧光强度的荧光图像，表明亲和 素从GaN纳米线阵列分离出来。其中，图111对应的样品含有更多的亲和素分子，这和 图121样品中还有较多荧光标记的亲和素一致。将这两个溶液冷冻干燥，即可得到高纯度 的亲和素。反之，先固定亲和素分子，后识别生物素分子，就可得到高纯度的生物素。 同理，高纯度的抗体(如脑利尿钠肽单克隆抗体、老鼠单克隆抗体)和抗原(如脑利尿钠 肽、山羊鼠抗免疫蛋白)也可以用同种方法提纯。
权利要求
1.一种蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，其特征是它是以直立的GaN纳米线阵列作 为基片，纳米线表面经化学氧化或等离子氧化产生Ga-OH官能团；或者经化学气相沉积 法在纳米线表面沉积Si02、TiO2或Al2O3，经水解在表面产生-OH官能团，GaN纳米线 表面的-OH官能团与SiCl4反应形成-O-Si-Cl键，最后通过聚乙二醇分子与蛋白质分子 相连接形成蛋白质修饰的GaN纳米线阵列。
2.根据权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，其特征是所述的蛋白质 分子是任何蛋白质分子。
3.根据权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，其特征是所述的蛋白质 分子是亲和素、小鼠单克隆抗体或脑利尿钠肽的单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，其特征是所述的聚乙二 醇是数均分子量为600-3000的聚乙二醇。
5.一种制备权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，其特征是它包 括下列步骤步骤1.将直立的GaN纳米线阵列用化学氧化法氧化或等离子辐射氧化，使纳米线表 面产生-OH官能团；步骤2.将步骤1得到的表面具有-OH官能团的GaN纳米线阵列在室温下浸泡在纯 SiCl4液体中0.5-2小时，使纳米线表面的-OH基转化为-O-SiCl3 ；步骤3.将步骤2得到的表面具有-O-SiCl3的GaN纳米线阵列置于O.lmol/L的一端 带有NHS(N-OH琥珀酰亚胺)的聚乙二醇的氯仿溶液中，在黑暗中放置0.5小时，取出 GaN纳米线阵列，清洗，干燥，得到NHS活化的GaN纳米线；步骤4.将步骤3得到的NHS活化的GaN纳米线置于蛋白质的水或PBS (磷酸缓冲溶 液，pH = 7 10)溶液(10-50nmol/L)中放置0.5 1小时，取出GaN纳米线阵列，清 洗，干燥，得到蛋白质修饰的GaN纳米线。
6.根据权利要求5所述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，其特征是步 骤1所述的化学氧化法氧化是将GaN纳米线阵列置于硫酸和双氧水混合溶液或硫酸与硝 酸混合溶液中，在80°C下加热4 10小时，取出清洗，吹干。
7.根据权利要求5所述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，其特征是所述 的步骤1用如下方法替代步骤1’将直立的GaN纳米线阵列用化学气相沉积法在纳米线表面沉积Si02、TiO2 或Al2O3，经水解在外表面产生-OH官能团。
8.根据权利要求5所述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，其特征是所述 的步骤3和4可以用如下两个步骤替代步骤3’将步骤2得到的表面具有-O-SiCl3的GaN纳米线阵列置于O.lmol/L的一端 带有生物素的聚乙二醇DMF溶液中，加入少许三乙胺，放置0.5小时，清洗，干燥，得 到生物素修饰的GaN纳米线。步骤4’将步骤3’得到的生物素修饰的GaN纳米线置于浓度为10-50nmol/mL的 亲和素水或PBS溶液中，放置0.5小时，清洗，干燥，得到亲和素修饰的GaN纳米线。
9.根据权利要求5-8所述的任一制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，所述的 蛋白质是任何蛋白质分子。
10.权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列在蛋白质分离提纯、识别或检测 中的应用。
全文摘要
一种蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，它是以直立的GaN纳米线阵列作为基片，纳米线表面经化学氧化或等离子氧化产生Ga-OH官能团；或者经化学气相沉积法在纳米线表面沉积SiO2、TiO2或Al2O3，经水解在在纳米线表面产生-OH官能团，GaN纳米线表面的-OH官能团与SiCl4反应形成-O-Si-Cl键，最后通过聚乙二醇分子与蛋白质分子相连接形成蛋白质修饰的GaN纳米线阵列。它可以应用于蛋白质分离提纯、识别或检测。本发明公开了其制法。
文档编号C30B33/00GK102011193SQ20101029019
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者张昊, 谭华, 郭东杰, 陈亚清 申请人:南京航空航天大学