专利名称：:发酵方法发明领域本发明涉及从含淀粉材料制备发酵产物如乙醇的发酵方法。发明背景发酵方法可用于制备多种商品，包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、甲叉丁二酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素，以及难以合成制备的其他化合物。发酵方法也常用于食用酒精(consumablealchohol)(例如，啤酒和葡萄酒)工业、乳业(例如，在酸奶(yogurt)和乳酪的制备中)、皮革业和烟草业。因此，有必要进一步改良发酵方法并提供包括发酵步骤的改良方法。发明概述本发明提供了从含淀粉的起始原料制备发酵产物如乙醇的改良发酵方法。本发明的发酵方法比传统发酵方法更有效地利用了含淀粉的材料和/或加快了发酵速度。本发明的第一方面涉及发酵含淀粉材料的方法，该方法包括i)通过用发酵微生物处理所述含淀粉材料来发酵所述材料，ii)减小步骤i)所得的含淀粉材料的粒径(particlesize)和/或液化步骤i)所得的含淀粉材料，和iii)发酵。在一个实施方案中，用产碳水化合物源的酶(carbohydratesourcegeneratingenzyme)在发酵步骤i)之前和/或同时处理含淀粉材料。所述含淀粉材料优选为醪(mash)，尤其是玉米醪或未糊化(un-gelatinized)淀粉。本发明的第二方面涉及从含淀粉材料制备发酵产物的方法，其包括(a)减小含淀粉材料的粒径；(b)液化步骤(a)所得的材料；(c)用本发明的发酵方法处理步骤(b)中所得的液化材料。本发明的第三方面涉及从含淀粉材料制备发酵产物的方法，其包括(a)减小含淀粉材料的粒径；(b)用本发明的发酵方法在酸性α-淀粉酶存在时处理步骤(a)中的材料。可选回收、优选通过蒸馏来回收发酵产物。在优选实施方案中，发酵产物是乙醇。附图简述图1显示了适于实现本发明的完整发酵-液化系统。图2显示在最初SSF后在2800微米网筛(meshsieve)中收集的含残余淀粉的材料，经过进一步粉碎(milling)和/或液化，之后作进一步SSF处理的转化百分比。
发明内容本发明提供了适于从含淀粉的原料制备发酵产物，具体为乙醇的改良发酵方法。在发酵方法的初期，发酵性糖(fermentablesugar)即DP1-3糖的释放比被所述发酵微生物代谢成所述发酵产物快。换言之，发酵微生物摄入发酵性糖的速度比糖的酶促施放速度(enzymaticsugarreleaserate)要慢。在发酵开始后的一段时间，发酵微生物的浓度增加，并且糖的摄入速度渐渐超过了糖的酶促施放速度。因为剩余底物的级分(fraction)(即残余淀粉级分)愈发难于被酶水解，发酵性糖的释放下降，这使得发酵速度下降。本发明避免或至少降低了总体发酵性能的下降。这是通过作为发酵过程的组成部分，在一段时间后或在发酵后粉碎和/或液化发酵培养基来实现。本发明的发明人已发现，通过确保玉米醪中发现的淀粉是酶降解可及的，可以实现玉米醪中存在的淀粉的转化率提高。在发酵末期计量的残余淀粉似乎是酶攻击不可及的(inaccessible)。已经发现，由于粉碎/液化不充分，玉米醪含有酶攻击不可及的大颗粒。实施例1显示玉米醪中不可及的大淀粉颗粒(SFF后)可通过进一步尺寸减小和/或液化而变得可及。因此，本发明的第一方面涉及发酵方法，其包括i)通过用发酵微生物处理所述含淀粉材料来发酵所述材料，ii)减小步骤i)所得的含淀粉材料的粒径和/或液化步骤i)所得的含淀粉材料，和iii)发酵。在本发明的优选实施方案中，在发酵步骤i)之前、或与发酵步骤i)同时、或在发酵步骤i)之前和同时，用产碳水化合物源的酶处理所述含淀粉材料。本发明的发酵方法可以是在发酵槽(fermentationtank)或其他中进行的分批发酵方法。根据本发明优选实施方案，在最初发酵后一段时间，将部分的或特别是全部的发酵培养基体积液化。可以理解的是，要在步骤ii)中减小尺寸和/或被液化的发酵培养基体积中的含淀粉颗粒，可以是步骤i)中最初发酵的含淀粉材料的全部或分级的(fractionated)部分，例如含酶的液体级分和/或含有剩余的含淀粉材料的级分。优选在发酵微生物已经明显消耗了所有可容易得到的发酵性糖时开始附加步骤。本发明一个实施方案中，在发酵培养基中DP1-3糖，优选葡萄糖和/或麦芽糖的浓度达到15g/L发酵培养基以下，优选10g/L以下，甚更优选5g/L以下时开始进一步的液化步骤。在另一个实施方案中，在发酵产物的生成速度已降到最大速度的85％以下，优选75％以下，甚更优选65％时开始附加步骤。可以通过在升高的温度对最初发酵材料的支流(side-stream)进行粒径减小和/或液化处理一段时间，然后糖化/或发酵所述材料，优选以SSF步骤，来进行附加步骤(即步骤ii))。在一个实施方案中，通过(缓慢地)将发酵培养基转移到和/或通过液化贮槽(holdingtank)来进行进一步的液化，在液化贮槽进行进一步的粒径减小和/或在通常40-80℃，优选在50-70℃进行液化1-60分钟，优选20-40分钟，如大约30分钟。在一个实施方案中加入有效量的α-淀粉酶。所述α-淀粉酶可以是如下在“α-淀粉酶类”部分提到的任何α-淀粉酶。在优选的实施方案中，α-淀粉酶源自细菌，优选是芽孢杆菌属(Bacillus)α-淀粉酶，或是真菌α-淀粉酶，优选是酸性曲霉属(Aspergillus)α-淀粉酶。在步骤ii)后，将材料再循环或引入同一个或另一个发酵槽。因为发酵微生物可能在一或多个附加步骤中被灭活(杀死)(例如由于升高的温度)，处理整个发酵体积的时间段应当至少与所述发酵微生物的倍增时间等长。当所述发酵微生物是酵母时，这通常意味着整个发酵体积可以在12小时或更长时间后进一步地液化。确切的时间段取决于所述的发酵微生物和原料。本领域技术人员可基于发酵微生物的倍增时间(doublingtime)及原料容易地确定适于进一步地液化整个发酵体积的时间段。图1说明了完整的发酵-液化系统的例子。应理解图1仅说明了一个适于实现本发明方法的例子。可以理解，用本领域技术人员公知的其他装置，也可对最初发酵后含剩余淀粉的材料进行分离、减小颗粒粒径和/或进行液化。在步骤i)的最初发酵中，发酵微生物消耗可容易得到的发酵性糖并将其转化为所需发酵产物。这确保了基本上没有发酵性糖由于附加步骤ii)中的加热/升高的温度而损失或浪费。该附加步骤ii)可使发酵速度加快、发酵时间缩短、淀粉/乙醇产量提高，即转化百分比提高，和/或残余淀粉减少。发酵“发酵”指含发酵步骤的任何发酵方法。本发明发酵方法包括但不限于用于制备醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、甲叉丁二酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素的发酵方法或过程。发酵方法也包括用于食用酒精工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳业(例如，发酵的乳制品)、皮革业和烟草业的发酵方法。本发明的发酵方法可与糖化方法联合使用，例如SSF，其中附加的酶活性，例如酯酶，如脂肪酶和/或角质酶、植酸酶、漆酶、纤维素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、蛋白酶、纤维二糖酶、或其混合物，可用于加工底物，例如淀粉底物。在另一个优选实施方案中，本发明的发酵方法用于制备乙醇。发酵培养基“发酵培养基”指进行发酵的环境，该环境还包括发酵底物，即被发酵微生物代谢的碳水化合物源。本发明的发酵方法中所使用的发酵培养基包括发酵底物和其它原料可以被加工，例如通过在发酵之前进行粉碎和/或液化或其他所需的过程。因此，发酵培养基可以指加入发酵微生物之前或之后的培养基，例如，处于或得自液化步骤的培养基，以及含有发酵微生物的培养基，例如，在同时的糖化和发酵方法(simultaneoussaccharificationandfermentationprocess，SSF)中使用的培养基。发酵微生物“发酵微生物”指在所需的发酵方法中适于使用的任何生物，包括细菌和真菌生物。本发明特别适合的发酵微生物能够直接或间接地将糖，如DP1-3糖，特别是葡萄糖或麦芽糖，发酵成即转化成所需的发酵产物。发酵生物的例子包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属(Sacchromyces)菌株，具体是酿酒酵母(Sacchromycescerevisiae)。可商购的酵母包括，例如REDSTAR/LesaffreEthanolRed(购自美国RedStar/Lesaffre)、SUPERSTART(购自Alltech)、GERTSTRAND(购自瑞典GertStrandAB)、FALI酵母(购自美国Fleischmann’sYeast)和FERMIOL(购自DSMSpecialties)。在乙醇制备中，发酵生物优选是施加于醪的酵母。优选酵母来源于酵母属，更优选来自酿酒酵母。将酵母施加于起始原料，进行发酵24-96个小时，如通常为35-60个小时。温度通常在26-34℃之间，具体是大约32℃，pH通常为pH3-6，优选为大约pH4-5。酵母细胞的使用量优选为每ml发酵培养基活酵母计数105到1012、优选为107到1010、特别是5×107。在乙醇制备过程中，酵母细胞计数优选在107到1010的范围内，特别是大约2×108。对于使用酵母来作发酵的进一步指导可见，例如“ThealcoholTextbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，NottinghamUniversityPress，UnitedKingdom1999)，其引入本文作为参考。其它发酵生物包括大肠杆菌和运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)。发酵底物任何适当的底物或原料均可根据本发明使用。本领域公知，通常基于所需的发酵产物和所采用的方法来选择底物。适用于本发明方法的底物的例子包括含淀粉植物材料，例如块茎、根、整谷粒(wholegrains)、玉米、玉米穗轴(cobs)、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁(milo)或谷类(cereals)；含糖原料，例如糖蜜(molasses)、水果材料、糖、甘蔗或甜菜、马铃薯，和含纤维素材料，例如木材或植物残余物(residue)。术语“液化醪”(liquefiedmash)包括任何上述原料，所述原料已经用本领域已知的任何方法液化处理。优选是酶促作用过的醪(enzymaticallymash)，具体是液化的玉米醪，和未糊化淀粉(即未煮制过(uncooked)的淀粉)。产碳水化合物源的酶术语“产碳水化合物源的酶”包括葡糖淀粉酶(作为产葡萄糖物质(glucosegenerator))、及β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)(作为产麦芽糖物质(maltosegenerator))。本发明也考虑产生适合于所述发酵微生物的其他碳水化合物的其他酶。产碳水化合物源的酶能为本发明方法所用的发酵微生物提供能量和/或直接或间接转化为所需的发酵产物，如乙醇。产碳水化合物源的酶可以是在定义范围内的酶的混合物。特别考虑的混合物是至少为葡糖淀粉酶和α-淀粉酶、特别是酸性淀粉酶、甚至更优选真菌酸性α-淀粉酶的混合物。在本发明一个实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)比葡糖淀粉酶活性(AGU)(AFAU比AGU)的比率可以是至少0.1、具体是至少0.16，如在0.12到0.50的范围内、或甚至更高如在0.5到1.0之间。所考虑的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶及β-淀粉酶的例子将在如下部分描述。可以理解，本发明所用的酶应该以有效量加入。该有效量可以由本领域技术人员容易地确定。葡糖淀粉酶根据本发明所用的葡糖淀粉酶可来源于任何合适来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶源自真菌或细菌，选自由曲霉属葡糖淀粉酶组成的组，具体为黑曲霉(A.niger)G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBOJ.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如WO92/00381、WO00/04136和WO01/04273所公开(来自丹麦Novozymes)；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(A.oryzae)(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括热稳定性增强的变体G137A和G139A(Chen等，(1996)，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等，(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等，(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；以及在A435和S436位点引入Pro残基(Li等，(1997)，ProteinEngng.10，1199-1204。其他葡糖淀粉酶包括罗尔伏革菌(Corticiumrolfsii)葡糖淀粉酶(美国专利4,727,046)也称作Altheliarolfsii葡糖淀粉酶，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，具体来自Talaromycesemersonii(WO99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利Re.32,153)、Talaromycesduponti、Talaromycesthermophilus(美国专利US4,587,215)。所考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，具体为C.thermoamylolyuticum(EP135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG200L；AMG300L；SANTMSUPER，SANTMEXTRAL，SPIRIZYMETMPLUS，SPIRIZYMETMFUEL，SPIRIZYMETMB4U和AMGTME(购自NovozymesA/S)；OPTIDEXTM300(购自GenencorInt.)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(购自DSM)；G-ZYMETMG900，G-ZYMETM和G990ZR(购自GenencorInt.)。在一个实施方案中，可加入量为0.02-20AGU/gDS，优选0.1-10AGU/gDS，例如0.4-4AGU/gDS，例如约2AGU/gDS的葡糖淀粉酶。α-淀粉酶根据本发明优选的α-淀粉酶源自真菌或细菌。更优选，所述α-淀粉酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶，例如源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株。其它α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属菌株(Bacillussp.)NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的菌株的α-淀粉酶，它们都在WO95/26397中进行了详细描述，以及Tsukamoto等，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31中描述的α-淀粉酶。芽孢杆菌属α-淀粉酶也可以是变体和/或杂合体(hybrid)，具体如WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO02/10355中任一个所述(所有文件在此引入作为参考)。具体考虑的α-淀粉酶变体公开在美国专利6,093,562、6,297,038、美国专利6,187,576和6,867,031中(在此引入作为参考)，其包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，所述变体与WO99/19467公开的SEQIDNO3所述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，在位点R179到G182缺失了一到四个氨基酸，优选如WO1996/023873所公开的双重缺失(doubledeletion)-见例如第20页第1-10行(在此引入作为参考)，优选对应于Δ(181-182)，或缺失了用WO99/19467(该参考文件在此引入作为参考)中的SEQIDNO3编号的位点R179和G180。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，该酶与WO99/19467公开的SEQIDNO3所述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，具有对应于Δ(181-182)的双重缺失还包含N193F取代(也命名为I181*+G182*+N193F)。具体考虑的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基(如WO99/19467中SEQIDNO4所示)，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基(如WO99/19467中SEQIDNO3所示)，其具有一个或多个、特别是所有的如下取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(用地衣芽孢杆菌编号)。还优选具有一或多个如下突变(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变)的变体H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或在位点176和179之间缺失两个残基，优选缺失E178和G179(用WO99/19467中SEQIDNO5的编号)。其它α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉和黑曲霉的α-淀粉酶。在优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。在更优选的实施方案中，所述酸性α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。更优选酸性α-淀粉酶是源自曲霉属的酸性真菌α-淀粉酶。可商购的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(购自丹麦NovozymesA/S)或可选择地含有结合淀粉区域的替代SP288。在一个实施方案中，α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”是指以有效量加入，在3.0到7.0、优选3.5到6.0、或更优选4.0到5.0的pH范围内具有活性的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。一种优选的酸性真菌α-淀粉酶为芬加密尔(Fungamyl)样的α-淀粉酶。在本发明中所用的术语“芬加密尔样α-淀粉酶”是指与WO96/23874中SEQIDNO.10所示的氨基酸序列显示出高同源性，即超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％或甚至超过90％的同源性(同一性)的α-淀粉酶。α-淀粉酶优选是酸性α-淀粉酶，优选来源于曲霉属，优选黑曲霉种。在优选的实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶，它在Swiss-prot/TeEMBL数据库中以主登录号(primaryaccessionnumber)P56271公开为“AMYAASPNG”。也考虑与所述酸性真菌淀粉酶具有至少70％同一性，如至少80％或甚至至少90％同一性，如至少95％同一性的的变体。用于本发明的优选酸性α-淀粉酶可以来源于地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。含α-淀粉酶的优选的可商购组合物包括DSM的MYCOLASE(GistBrochades)，BANTM，TERMAMYLTMSC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETMX和SANTMSUPER，SANTMEXTRAL(NovozymesA/S)以及CLARASETML-40,000，DEX-LOTM，SPEYMEFRED，SPEZYMETMAA和SPEZYMETMDELTAAA(GenencorInt.)，和用商品名SP288销售的酸性真菌α-淀粉酶(购自丹麦NovozymesA/S)。所述α-淀粉酶可以用本领域公知的量来加入。细菌α-淀粉酶可以用本领域公知的量来加入。以KNU单位计量时，α-淀粉酶活性优选以0.5-5,000NU/gDS的量，1-500KNU/kgDS的量，或更优选5-1,000KNU/kgDS的量，如10-100KNU/kgDS的量存在。以AAU单位计量时，酸性α-淀粉酶活性优选以5-50,0000AAU/kgDS的量，500-50,000AAU/kgDS的量，或100-10,000AAU/kgDS的量，如500-1,000AAU/kgDS的量存在。真菌酸性α-淀粉酶优选以10-10,000AFAU/kgDS的量，500-2,500AFAU/kgDS的量，或更优选100-1,000AFAU/kgDS的量，如大约500AFAU/kgDS的量加入。产麦芽糖淀粉酶淀粉酶也可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。来源于嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖α-淀粉酶可从NovozymesA/S公司以商品名NOVAMYLTM购买到。产麦芽糖α-淀粉酶在下列文献中作了描述欧洲专利120,693，美国专利号US4,598,048，4,604,355和6,162,628，在此引入作为参考。优选将产麦芽糖α-淀粉酶用于粗淀粉水解方法，例如如WO95/10627所述，在此引入作为参考。当真菌α-淀粉酶用作产麦芽糖酶时，其加入量可以为0.001-1.0AFAU/gDS，优选0.002-0.5AFAU/gDS，优选0.02-0.1AFAU/gDS。β-淀粉酶至少根据本发明，β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)是外切(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的传统命名，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中1，4-α-糖苷键的水解。该酶逐步依次从非还原链端连续除去麦芽糖单元，直至该分子被降解，或对于支链淀粉而言直至到达分支点。因所释放的麦芽糖具有β异头(anomeric)构型，所以该酶被命名为β-淀粉酶。已经从多种植物和微生物中分离出β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，ProgressinIndustrialMicrobiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度和4.5到7的最适pH值。可商购的来自大麦的β-淀粉酶是购自美国GenencorInt.，的SPEZYMETMBBA1500。生长刺激剂在本发明方法的一个优选方案中，加入一或多种生长刺激剂(growthstimulators)来进一步改善发酵，具体改善发酵生物的性能，例如，速度加快和产物产率。优选的生长刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的例子包括多种维生素(multivitamins)、生物素、泛酸(pantothenate)、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。例如参见Alfenore等，“ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiabyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess”，Springer-Verlag(2002)，其在此引入作为参考。矿物质的例子包括能提供含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。酶的制备如本文所述，酶可来源于或得自任何来源，包括细菌、真菌、酵母或哺乳动物源。术语“来源于”(derived)在本文中的意思是所述酶可以从其天然存在的生物中分离，即该酶的氨基酸序列本身(identity)与天然酶一致。术语“来源于”也指酶可以在宿主生物中重组制备，所述重组制备的酶或者本身与天然酶一致，或者具有经过修饰的氨基酸序列，例如缺失、插入和/或取代了一个或多个氨基酸，即所述重组制备的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或是通过本领域已知的核酸改组方法制备的酶。在天然酶意义内包括天然的变体。此外，术语“来源于”包括合成制备，例如通过肽合成制备的酶。术语“来源于”还包括不论是在体内还是在体外经过修饰，如通过糖基化、磷酸化或其它的化学修饰的酶。术语“得自”在本文中的意思是指具有与天然酶一致的氨基酸序列的酶。该术语包括已从天然存在该酶的生物中分离的酶，或从已重组表达该酶的同种或不同种类的生物中分离的酶，或合成例如通过肽合成制备的酶。就重组制备的酶而言，术语“得自”和“来源于”是指酶本身，而不是重组制备所述酶的宿主生物本身。酶也可以被纯化。这里所使用的术语“纯化的”包括不含酶所来自的生物中的其它组分的酶。术语“纯化的”也包括来自天然生物而不含有该天然生物中的组分的酶。酶可以纯化至仅有少量的其它蛋白质存在。用语“其它蛋白质”具体涉及其它的酶。这里所使用的术语“纯化的”也指除去了其它组分，具体为其它蛋白质，更具体为存在于本发明的酶所来源的细胞中的其它酶。酶可以是“基本上”纯的，即不含产生它的生物的其它组分，所述生物举例为重组制备酶的宿主生物。在优选的实施方案中，酶至少为75％(w/w)纯，更优选至少为80％、至少为85％、至少为90％、至少为95％、至少为96％、至少为97％、至少为98％或至少为99％纯。在另一个优选的实施方案中，酶为100％纯。用于本发明的酶可以是适用于本文所述方法的任何形式，例如，如干粉或颗粒、无尘(non-dusting)颗粒、液体、稳定化液体(stabilizedliquid)或受保护酶的形式。例如，可如美国专利4,106,991和4,661,452的公开来制备颗粒，并且可任选采用本领域已知的方法来包被所述颗粒。可根据既定方法，例如通过加入稳定剂如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有机酸来稳定液体酶制剂。受保护的酶可根据EP238,216中公开的方法来制备。发酵产物的制备方法本发明的发酵方法可用于制备发酵产物的任何方法。本文所述的本发明的发酵方法优选应用于乙醇制备方法(例如用作燃料或燃料添加剂)。因此，本发明第二方面涉及从含淀粉材料制备发酵产物的方法，其包括(a)减小含淀粉材料的粒径；(b)液化步骤(a)的产物；(c)用本发明的发酵方法处理步骤(b)中所得的液化材料。含淀粉材料的尺寸减小根据本发明，在基于淀粉的发酵产物，特别是乙醇的制备中，减小原料如整谷粒、优选玉米的粒径，例如通过粉碎来打开(openup)结构以便于进一步加工。本发明优选两种方法湿磨(wetmilling)和干磨(drymilling)。对于诸如乙醇的制备，最常使用的是干磨，其中将整个籽粒(kernel)粉碎，然后用于方法的后续部分。也可使用湿磨，其较好地分离了胚芽(germ)和粗粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白质)，除少数情况外，其可有利地用于存在并行生产(parallelproduction)诸如糖浆处。湿磨和干磨方法是本领域公知的。也可使用其他减小粒径的技术，如乳化技术、旋转脉动(rotarypulsation)。液化例如，乙醇制备方法通常涉及液化、糖化、发酵，并可选回收，例如通过蒸馏来回收的步骤。在液化步骤(b)中，例如粉碎过的(完整的)谷类原料被分解(水解)成麦芽糖糊精(糊精)。水解可以通过酸处理，或通过α-淀粉酶处理，具体为在“α-淀粉酶”部分上述的芽孢杆菌属α-淀粉酶通过酶促方法进行。在本发明方法的一个优选实施方案中原料是粉碎过的整谷粒。然而，也可以使用淀粉加工的支流。在方法的初始，原料可以是大约25到大约45wt-％的粉碎的整谷粒和水的浆液(slurry)。在本发明的实施方案中，酶促液化以三步热浆液方法进行。加热浆液到60-95℃、优选80-85℃，并加入酶以引发液化(稀化(thinning))。优选至少加入α-淀粉酶。然后在一个实施方案中，可在95-140℃、优选在105-125℃蒸汽加压蒸煮(jet-cooked)浆液以使浆液完全糊化。接着使浆液冷却至60-95℃并加入更多的一或多种酶以完成水解(二级液化)。在大约pH4.5-6.5，具体在pH5-6进行液化方法。粉碎过并液化的整谷粒称为醪。可以在存在任何α-淀粉酶、优选在“α-淀粉酶”部分所述的α-淀粉酶时进行液化步骤(b)。优选的α-淀粉酶源自真菌或细菌。本发明具体考虑芽孢杆菌属α-淀粉酶，其变体及杂合体。所述α-淀粉酶可以本领域公知的有效量加入。细菌α-淀粉酶可以本领域公知的量加入。以KNU单位计量时，α-淀粉酶活性优选以0.5-5,000NU/gDS的量，1-500KNU/kgDS的量，或优选5-1,000KNU/kgDS的量，如10-100KNU/kgDS的量存在。以AAU单位计量时，酸性α-淀粉酶活性优选以0.005-500AAU/gDS的量，0.500-50AAU/gDS的量，或更优选0.1-10AAU/gDS的量，如0.5-1AAU/gDS的量存在。真菌α-淀粉酶可加入的量为0.001-1.0AFAU/gDS，优选为0.002-0.5AFAU/gDS，优选为0.02-0.1AFAU/gDS。芽孢杆菌属α-淀粉酶可以本领域技术人员公知的有效量加入。糖化和发酵为制备低分子量的发酵性糖类，即能够被发酵微生物(如酵母)代谢的碳水化合物源，必须进一步水解来自液化步骤的麦芽糖糊精。通过酶促方法用产碳水化合物源的酶，例如优选葡糖淀粉酶来进行水解。或者可使用，例如α-葡糖苷酶、β-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶或酸性α-淀粉酶等。根据本发明，糖化和发酵同时进行，即作为SSF方法。根据本发明此方面，用本发明上述的发酵方法来进行发酵产物制备方法的步骤(c)。回收在优选实施方案中，用任何本领域已知方法，例如通过蒸馏来回收发酵产物。可将发酵的材料(醪)蒸馏来提取发酵产物，具体为乙醇。根据本发明的乙醇制备方法获得的终产物可用作，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的精制酒精(potableneutralspirit)；或工业乙醇。本发明第三方面涉及从含淀粉材料制备发酵产物的方法，其包括(a)减小含淀粉材料的粒径；(b)进行本发明的发酵方法。根据本发明此方面，含淀粉材料可以是未糊化的淀粉(即未煮制过的淀粉)。在此方法的初始，原料含有大约25到大约45wt-％的含淀粉材料，例如粉碎过的整谷粒和水。如何进行粉碎、液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的更多细节为本领域技术人员公知。本文描述并要求保护的发明不限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案应是本发明各个方面的举例说明。任何等同的实施方案应该在本发明的范围内。事实上，除了本文已公开及描述的之外，根据上述描述本领域技术人员可以显而易见地对本发明作各种改变。这些改变也落入所附的权利要求的范围内。如有不同，以本发明的公开(包括定义)为准。本文引用了多篇参考文献，其公开在此全文引入作为参考。本发明将用如下实施例来作进一步描述，这些实施例不应被视为对本发明范围的限制。材料和方法酶细菌α-淀粉酶A(BAAA)带突变I181*+G182*+N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，公开于美国专利6,187,576中，并可从丹麦NovozymesA/S索取购买。葡糖淀粉酶TN来源于Talaromycesemersonii的葡糖淀粉酶，在WO99/28448中公开为SEQIDNO7，其带有黑曲霉葡糖淀粉酶和黑曲霉酸性α-淀粉酶的副活性(sideactivity)，并可从丹麦NovozymesA/S索取购买。酵母REDSTAR购自美国RedStar/Lesaffre。碘法的贮存液0.1NI2将1.3gI2和2.0gKI溶于100mLDI水。方法α-淀粉酶活性(KNU)可采用马铃薯淀粉作为底物来测定淀粉分解活性。该方法基于酶对变性的(modified)马铃薯淀粉的分解，在此反应后使淀粉/酶溶液样品和碘溶液混和。最初形成黑蓝色，但分解淀粉期间蓝色变淡，并逐渐变成红褐色，将其与有色玻璃标准比较。一个千Novoα-淀粉酶单位(KNU)的定义为在标准条件(即在37℃+/-0.05；0.0003MCa2+；和pH5.6)糊精化5260mg可溶性MerckAmylum淀粉干物质所需的酶的量。这种分析方法在文件夹EB-SM-0009.02/01中作了更详细地描述，该文件夹可从丹麦的NovozymesA/S索取得到，在此将其引入作为参考。测定FAU活性一个真菌α-淀粉酶单位(FAU)的定义为基于如下标准条件每小时分解5.26g淀粉(MerckAmylum的可溶性Erg.B.6，批号9947275)所需的酶的量底物........可溶性淀粉温度.........37℃pH............4.7反应时间.........7-20分钟测定酸性α-淀粉酶活性(AFAU)酸性α-淀粉酶活性以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)计量，其相对于酶标准品来测定。使用的标准品是AMG300L(丹麦NovozymesA/S，野生型黑曲霉G1葡糖淀粉酶，还公开于Boel等，(1984)，EMBOJ.3(5)，p.1097-1102)和WO92/00381中)。此AMG中的中性α-淀粉酶经室温贮存3星期后从大约1FAU/mL降至0.05FAU/mL以下。此AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性根据下列描述来测定。在该方法中，一个AFAU的定义是在标准条件每小时降解5,260mg淀粉干物质所需的酶的量。碘与淀粉而不是与其降解物形成蓝色络合物。因此颜色的强度与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法(reversecolorimetry)如在具体的分析条件下通过淀粉浓度的降低来测定淀粉酶活性。蓝/紫t＝23秒褪色标准条件/反应条件(每分钟)底物淀粉，大约0.17g/L缓冲剂柠檬酸盐，大约0.03M碘(I2)0.03g/LCaCl21.85mMpH2.50±0.05温育温度40℃反应时间23秒波长λ＝590nm酶浓度0.025AFAU/mL酶工作范围0.01-0.04AFAU/mL如果优选更多细节，可见于向丹麦NovozymesA/S索取得到并引入作为参考的EB-SM-0259.02/01。酸性α-淀粉酶单位(AAU)酸性α-淀粉酶活性可以AAU(酸性α-淀粉酶单位)计量，这是一种绝对的方法。一个酸性淀粉酶单位(AAU)是指在标准条件下，每小时将1g淀粉(100％干物质(drymatter))转化成与强度(strength)已知的碘溶液反应后在620nm的透光率(transmission)与某一颜色参照的透光率相等的产物，所需要的酶的量。标准条件/反应条件底物可溶性淀粉，浓度大约20gDS/L缓冲剂柠檬酸盐，大约0.13M，pH＝4.2碘溶液40.176g碘化钾+0.088g碘/L自来水15°-20°dH(德国硬度等级)pH4.2温育温度30℃反应时间11分钟波长620nm酶浓度0.13-0.19AAU/mL酶工作范围0.13-0.19AAU/mL淀粉应该是Lintner淀粉，其为实验室中用作比色指示剂的轻沸(thin-boiling)淀粉。Lintner淀粉通过用稀盐酸处理天然淀粉来获得，因而其保留了遇碘变蓝色的能力。更多细节可见于EP0140410B2，其公开在此引入作为参考。葡糖淀粉酶活性(AGI)葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡萄糖苷酶)将淀粉转化为葡萄糖。在这里通过葡萄糖氧化酶法测定的匍萄糖的量用作活性测定。该方法见“ApprovedmethodsoftheAmericanAssociationofCerealChemists”.Vol.1-2AACC，fromAmericanAssociationofCerealChemists，(2000)；ISBN1-891127-12-8的76-11部分Starch-GlucoamylaseMethodwithSubsequentMeasurementofGlucosewithGlucoseOxidase的描述。一个葡糖淀粉酶单位(AGI)是指在方法的标准条件每分钟形成1微摩尔葡萄糖所需的酶的量。标准条件/反应条件底物可溶性淀粉，浓度大约16g干物质/L缓冲剂乙酸盐，大约0.04M，pH＝4.3pH4.3温育温度60℃反应时间15分钟反应终止NaOH达大约0.2g/L的浓度(pH～9)酶浓度0.15-0.55AAU/mL淀粉应该是Lintner淀粉，其为实验室中用作比色指示剂的轻沸淀粉。Lintner淀粉通过用稀盐酸处理天然淀粉来获得，因而其保留了遇碘变蓝色的能力。葡糖淀粉酶活性(AGU)Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)的定义为在37℃，pH4.3，底物23.2mM麦芽糖，缓冲剂0.1M乙酸盐，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖所需的酶的量。可以使用自动分析系统。将变旋酶加入葡萄糖脱氢酶试剂从而将任何存在的α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶与β-D-葡萄糖在上述反应中特异性地反应，形成用光度计在340nm可测定的作为原始葡萄糖的浓度计量的NADH。AMG温育底物23.2mM麦芽糖缓冲剂0.1M乙酸盐pH4.30±0.05温育温度37℃±1反应时间5分钟酶工作范围0.5-4.0AGU/mL颜色反应GlucDH430U/L变旋酶9U/LNAD0.21mM缓冲剂0.12M磷酸盐；0.15MNaClpH7.60±0.05温育温度37℃±1反应时间5分钟波长340nm这种分析方法在文件夹EB-SM-0131.02/01中作了更详细地描述，该文件夹可从丹麦的NovozymesA/S索取得到，在此将其引入作为参考。同源性(同一性)的测定在本发明范围内，术语多肽“同源性”可以理解为两个序列之间的“同一性”程度，表明第一个序列是自第二个序列衍生的。可以通过本领域已知的计算机程序来适当地测定同源性，如GCG程序包提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage，Version8，August1994，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，JournalofMolecularBiology，48，443-453。使用氨基酸序列比对的如下设置GAP生成罚分(creationpenalty)3.0，GAP延伸罚分(extensionpenalty)0.1。实施例实施例1此试验的目的是为了研究在初始SSF后玉米醪颗粒所含的残余淀粉的可及程度(accessibility)。通过用DI-水洗涤玉米醪来使其筛过2800微米的筛。如下处理所得的含淀粉的颗粒1)将第一部分研磨(湿磨)为较小尺寸的颗粒。2)将第二部分研磨并用细菌α-淀粉酶A(BAAA)以100NU/gDS的剂量于85℃再次液化90分钟。将与正常通过标准SSF发酵的级分对应的样本作为对照进行实验。将所有样本调节到5％(w/w)的相同总固体(TS)值，并上样到15mL弹簧盖(snap-cap)管中。随后进行标准SSF发酵(32℃，65小时)。将pH调节到pH5后加入葡糖淀粉酶TN(0.5AGU/gDS)，并在管中接种0.04mL/g醪的用玉米醪制备20小时的酵母繁殖物(yeastpropagate)(REDSTAR)。一式三份进行实验，而且发酵中包括对照。用糖类和发酵产物的HPLC分析来监控发酵。试验的结果显示于图2中，其显示出很大比例的已经用SSF处理的玉米醪是不可及的，除非对所述颗粒作进一步的粉碎和/或再次液化处理。假定玉米醪的理论水平为70％w/w来作计算。用斯氏t检验(Student’sttest)作出图2中的环。不重叠的环表示显著(α＝0.05)不同的值。权利要求1.发酵含淀粉材料的方法，该方法包括i)通过用发酵微生物处理所述含淀粉材料来发酵该材料，ii)减小步骤i)所得的含淀粉材料的粒径和/或液化步骤i)所得的含淀粉材料，和iii)发酵。2.权利要求1的方法，其中所述含淀粉材料已用产碳水化合物源的酶在发酵步骤i)之前和/或同时处理。3.权利要求1或2的方法，其中所述含淀粉材料是醪或未糊化的淀粉。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述发酵按照分批发酵方法，具体是在发酵槽中进行。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中通过将步骤i)中材料的支流液化一段时间之后发酵所述材料来进行步骤ii)中的液化。6.权利要求5的方法，其中将来自步骤i)的液化材料再循环到发酵步骤i)。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中在步骤ii)中用于进一步液化步骤i)中的全部体积的含淀粉材料的时间比所述发酵微生物，优选酵母的倍增时间长。8.权利要求7的方法，其中液化全部体积的含淀粉材料的时间为12小时或更长。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中对步骤i)中的含淀粉材料进行粒径减小的处理，优选通过粉碎来处理。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤ii)中的液化在40到80℃，优选50到75℃，优选大约70℃进行。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤ii)中的进一步液化进行1到60分钟，优选20到40分钟，如大约30分钟。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中在步骤ii)中添加α-淀粉酶。13.权利要求12的方法，其中所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选芽孢杆菌属α-淀粉酶，或真菌α-淀粉酶，优选酸性曲霉属α-淀粉酶。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中在绝大部分可容易得到的DP1-3糖，优选葡萄糖和/或麦芽糖已经被所述发酵微生物发酵时，开始进一步液化。15.权利要求1-14中任一项的方法，其中在发酵培养基中的DP1-3糖浓度，优选葡萄糖浓度达到15g/L以下，优选10g/L以下，甚至更优选5g/L以下时，开始步骤ii)中的进一步液化。16.权利要求1-15中任一项的方法，其中在产物如乙醇的产生速度降到最大速度的85％以下，优选75％以下，甚至更优选65％时，开始步骤ii)中的进一步液化。17.权利要求1-16中任一项的方法，其中产碳水化合物源的酶选自葡糖淀粉酶，β-淀粉酶，产麦芽糖α-淀粉酶，酸性α-淀粉酶，或其混合物，其中所述混合物优选为由酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)和葡糖淀粉酶活性(AGU)以(AFAU比AGU)至少0.1，具体为至少0.16，如在0.12到0.50的范围内或以上的比率组成的混合物。18.权利要求1的方法，其中所述发酵步骤i)是同时的糖化和发酵方法的一部分。19.权利要求1的方法，其中所述第二个发酵步骤iii)按照同时的糖化和发酵方法来进行。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述发酵微生物是酵母。21.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述发酵在大约25℃到大约40℃，优选在大约30℃到35℃的温度进行。22.从含淀粉材料制备发酵产物的方法，其包括(a)减小含淀粉材料的粒径；(b)液化步骤(a)的产物；(c)用权利要求1-21中任一项限定的发酵方法处理步骤(b)中所得的液化材料。23.从含淀粉材料制备发酵产物的方法，其包括(a)减小含淀粉材料的粒径；(b)用权利要求1-21中任一项限定的发酵方法在酸性α-淀粉酶存在时处理步骤(a)中的材料。24.权利要求23的方法，其中所述含淀粉材料是同时糖化和发酵的未糊化淀粉。25.权利要求22-24中任一项的方法，其中通过粉碎来减小所述含淀粉材料的粒径。26.权利要求22-25中任一项的方法，其包括开始糖化和发酵浆液，所述浆液包含大约25到大约45wt-％DS的含淀粉材料和水。27.权利要求22-26中任一项的方法，其中所述含淀粉材料是整谷粒，具体为粉碎的整谷粒。28.权利要求22-27中任一项的方法，其包括在大约25℃到大约40℃，优选在大约30℃到35℃的温度糖化和发酵。29.权利要求22-28中任一项的方法，其包括在发酵后进一步回收所述发酵产物。30.权利要求29的方法，其中所述发酵产物通过蒸馏来回收。31.权利要求22到30中任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇。专利摘要本发明提供了发酵含淀粉材料的方法，其包括i)通过用产碳水化合物源的酶和发酵微生物处理所述含淀粉材料来发酵所述材料，ii)减小步骤i)所得的含淀粉材料的粒径和/或液化步骤i)所得的含淀粉材料，和iii)发酵步骤ii)的液化材料。本发明也涉及包括本发明的发酵方法在内的制备发酵产物的方法。文档编号C13K1/06GK1993471SQ20058002554公开日2007年7月4日申请日期2005年5月24日发明者马茨·P·T·史密斯,格雷戈里·A·克拉布申请人:诺维信北美公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan