专利名称：发菜苗种的人工培养方法
技术领域：
本发明涉及一种发菜苗种的人工培养方法。
由于上述原因，所以发菜的需求量和贸易量很大，人们的采集工作也日益加剧，造成发菜资源渐趋枯竭，生态环境严重破坏。因此，国家现已禁止采集发菜，并将其列为国家一级保护植物。但由于发菜的市场需求量依然很大，因而急需开展发菜的人工培养。在发菜的人工培养方面，由于天然原植体扩增速度缓慢和易水解，故急需解决的一个问题是苗种的问题，国内不少单位开展了研究，但都没有取得理想的进展。有人通过对发菜原植体节段培养，生长速度较慢，在半年的成活期中，一般增长率为10％左右，在培养前期接种后20天内生长较快，以后生长速度减慢。有人将发菜的原植体直接在液体培养基中培养也不可行。在发菜的生长中，湿度显得十分重要，水分又不可过多，否则胶鞘会水解，藻体容易坏死；而且水分过多，细菌大量繁殖，也会导致藻体分解死亡；发菜原植体浸泡在水中时，光合作用会受到影响，净光合作用在3天内逐步降低。原植体浸泡在水中时，没有净光合碳积累，相反由于呼吸作用增强，呼吸作用超过光合生产，从而可能消耗藻体原有的部分干物质，致使藻体不能生长。
本发明的目的是这样实现的一种发菜苗种的人工培养方法，按以下步骤进行a.发菜原植体的表面处理挑选出的活性强的发菜原植体，用蒸馏水清洗，在超净工作台上用50-90％的乙醇水溶液浸润10-120秒，再用无菌水反复冲洗3-20次，待用；b.发菜原植体的光合作用活性恢复将经a步骤处理的发菜原植体在10-35℃，20-140μmolm-2s-1光照强度条件下，进行光合作用恢复，恢复时间为7-20小时，所用的培养基为液体培养其1；c.发菜原植体破碎获得游离单细胞和藻丝将上述表面消毒和光合作用活性恢复后的发菜原植体，在超净工作台上用两块灭过菌的玻璃片压碎，即可获得游离单细胞和藻丝体；
d.液体中藻丝体的培养将从c步骤中获得的单细胞及藻丝体转移到液体培养基2中，在10-150μmolm-2s-1光照，12-38℃的条件下，培养10-28天后，形成鞘增厚的藻丝体；e.藻丝体的转移在超净工作台上用镊子从液体环境中取出藻丝体，并转移到琼脂培养板表面；f.藻丝体的培养将载玻片放在培养箱中，在20-200μmolm-2s-1光照，12-38℃的条件下培养，用喷水壶，每天定时、定量、均匀地向培养基表面浇水，浇水次数为2-8次，每次浇水量为0.12-0.18mlcm-2，即每天从6时第一次至18时最后一次，将浇水时间跨度2-8等分定时浇水；液体培养基1，由以下成份按比例组成硝酸钠80～120mg3H2O磷酸氢二钾 4.24～6.36mg7H2O硫酸镁 6.24～9.36mg氯化钙2.24～3.36mg9H2O硅酸钠 4.8～7.2mg柠檬酸0.48～0.72mg柠檬酸铁铵0.48～0.72mg己二胺四乙酸 0.08～0.12mg碳酸钠1.6～2.4mg微量金属溶液 0.08～0.12ml蒸馏水99.92～99.88ml液体培养基1中的微量金属溶液由以下成份按比例组成硼酸 228.8～343.2mg4H2O氯化锰 146.4～219.6mg1H2O硫酸锰 122.4～183.6mg7H2O硫酸锌 18～27mg5H2O硫酸铜6.08～9.12mg钼酸钠 2～3mg蒸馏水 100ml液体培养基2，由以下成份按比例组成硝酸钠 39.68～59.52mg磷酸氢二钾 3.2～4.8mg7H2O硫酸镁6.16～9.24mg2H2O氯化钙3.04～4.56mgH2O硅酸钠 4.8～7.2mg碳酸钠 1.6～2.4mg微量元素溶液 0.32～0.48ml土壤浸提液 0.4～0.6ml蒸馏水 99.28～98.92ml用稀盐酸或氢氧化钠溶液调节PH值为8.0-8.7液体培养基2中的微量元素溶液由以下成份按比例组成6H2O三氯化铁 7.36～11.04mg4H2O氯化锰3.44～5.16mg氯化锌 0.48～0.72mg6H2O氯化钴0.2～0.3mg2H2O钼酸钠0.336～0.504mg己二胺四乙酸钠 60.4～90.6mg蒸馏水 100ml液体培养基2中的土壤浸提液提取方法取未施过肥的花园土1kg置于带盖铝锅中，加入蒸馏水1200ml，在电炉上加热沸腾2～3小时，冷却数小时，用砂布和滤纸依次过滤，获得的滤液加蒸馏水至总体积1L，高压灭菌，然后存放于2-4℃备用；固体培养基是在液体培养基2的基础上，将琼脂按0.7-2.0g/100ml比例加入，高压灭菌，待用；上述气生条件下琼脂培养基板的制作在超净工作台上将灭过菌的固体培养基加热后，冷却到38--44℃，按所设定的琼脂厚度，用移液枪吸取一定体积，转移到载玻片上，加入细沙，冷却，琼脂的厚度为0.5-3mm，培养基面上的细沙数目5-10个/cm2，即得合适的培养基板。
本发明较佳的培养方法为，上述d步骤中光照的强度为40-100μmolm-2s-1；f步骤中藻丝体的培养光照条件为60-80μmolm-2s-1。
本发明最佳的培养方法为，上述d步骤中光照的强度为60μmolm-2s-1；f步骤中藻丝体的培养光照条件为60μmolm-2s-1，浇水频率为每天5次，浇水量为0.16mlcm-2。
本发明的有益效果本发明在液体条件下，获得了大量可扩增的带鞘藻丝体，从根本上解决了发菜人工培养中单离细胞转化成的问题，在进一步的气生培养中，在本发明给定的温度、光照度及浇水频率下，藻丝体鞘的颜色从绿色变成棕黄色，再变成棕色，最后变成棕黑色，这一颜色与发菜天然原植体的颜色接近。初步找到了藻丝体转变成原植体的光温组合、培养基面、浇水频率等条件，第一次实现了真正意义上的发菜人工培养，为进行发菜的大规模工厂化生产提供了和技术上的支持。
先按以下配方配制好液体培养基1、2，固体培养基和固体培养基板液体培养基1由以下成份按比例组成硝酸钠 100mg3H2O磷酸氢二钾 5.3mg7H2O硫酸镁 7.8mg氯化钙 2.8mg9H2O硅酸钠 6mg柠檬酸 0.6mg柠檬酸铁铵 0.6mg己二胺四乙酸0.1mg碳酸钠 2mg微量金属溶液0.1ml蒸馏水 99.9ml液体培养基1中的微量金属溶液由以下成份按比例组成硼酸286mg4H2O氯化锰 183mg1H2O硫酸锰 153mg7H2O硫酸锌 22.5mg5H2O硫酸铜 7.6mg钼酸钠 2.5mg蒸馏水 100ml液体培养基2，由以下成份按比例组成硝酸钠 49.6mg磷酸氢二钾4mg7H2O硫酸镁 7.7mg2H2O氯化钙 3.8mgH2O硅酸钠6mg碳酸钠2mg微量元素溶液 0.4ml土壤浸提液0.5ml蒸馏水99.1ml用稀盐酸或氢氧化钠溶液调节PH值为8.0-8.7液体培养基2中的微量元素溶液由以下成份按比例组成6H2O三氯化铁 9.2mg4H2O氯化锰 4.3mg氯化锌0.6mg6H2O氯化钴 0.25mg2H2O钼酸钠 0.42mg己二胺四乙酸钠75.5mg蒸馏水100ml液体培养基2中的土壤浸提液提取方法取未施过肥的花园土1kg置于带盖铝锅中，加入蒸馏水1200ml，在电炉上加热沸腾2.5小时，冷却数小时，用砂布和滤纸依次过滤，获得的滤液加蒸馏水至总体积1L，高压灭菌，然后存放于4℃备用；固体培养基是在液体培养基2的基础上，将琼脂按1.2g/100ml比例加入，高压灭菌，待用；
上述气生条件下琼脂培养基板的制作在超净工作台上将灭过菌的固体培养基加热后，冷却到44℃，按所设定的琼脂厚度，用移液枪吸取一定体积，转移到载玻片上，加入细沙，冷却，琼脂的厚度为2.0mm左右，培养基面上的细沙数目8个/cm2，可以得出合适的培养基板，琼脂培养基板制作中，琼脂培养基厚度及细沙数目数值可上下变化10％内也能取得较好效果。
上述培养基各组份的配比是取最佳的数值，它能最好实现发明的目的。但是，本技术领域的人员可以知道，作为培养基，其各组份的比例在最佳数值上下变化10％的范围内，培养基仍可以较好实现发明的目的，其在组份的比例在最佳数值上下变化3％的范围内，就能更好实现发明的目的。
发菜苗种的人工培养方法步骤如下a.挑选丝体比较粗，色泽比较亮丽的发菜原植体0.5克，除去杂草，再用清水洗去里面的杂物，待下一步单离细胞所用；将筛选出的原植体表面在超净工作台上先用蒸馏水润洗，然后在83％的乙醇里浸润15秒，再用无菌水反复冲洗15次，待用；b.将洗干净的发菜原植体在30℃，60μmolm-2s-1光照条件下，模拟自然光进行光合作用恢复，恢复时间为10小时，所用培养基为液体培养基1；c.将上述表面消毒和光合作用活性恢复后的发菜原植体，在超净工作台上用两块灭过菌的玻璃片轻轻压碎，即可获得游离单细胞和藻丝体；此时用无菌水洗入灭过菌的培养基2中，沉淀片刻，镜检，发现上清液中基本上是单细胞和藻丝体；
d.将从c中获得的单细胞及藻丝体在液体培养基2中，在100μmolm-2s-1光照，30℃的条件下，培养14天后，形成鞘增厚的藻丝体；e.在超净工作台上用镊子轻轻从液体环境中取出藻丝体，并转移到琼脂培养板表面；f.将载玻片放在培养箱中，模拟自然光，在160μmolm-2s-1光照，38℃的条件下培养，用喷水壶，每天定时、定量、均匀地向培养基表面浇水，每天浇水频率为6次，每次浇水量为0.18ml cm-2，即每天从6时至18时，模拟自然条件下日出、日落规律来设定浇水时间，将第一次浇水与最后一次浇水时间的跨度6等分，第一次为6时，最后一次为18时；该浇水条件和培养基面上，藻丝体鞘的颜色从绿色变成棕黄色，再变成棕色，最后变成棕黑色，这一颜色与发菜天然原植体的颜色接近，形态一致，两个月内增长1.7mm左右。
实施例2液体培养基1、液体培养基2、固体培养基及固体培养基板的配制方法与实施例1相同。
发菜苗种的人工培养方法的步骤如下a.挑选丝体比较粗，色泽比较亮丽的发菜原植体0.5克，除去杂草，再用清水洗去里面的杂物，待下一步单离细胞所用；将筛选出的原植体表面在超净工作台上先用蒸馏水润洗几遍，然后60％的乙醇里浸润58秒，再用无菌水反复冲洗7次，待用；
b.将洗干净的发菜原植体在10℃，30μmolm-2s-1光照，模拟自然光条件下进行光合作用恢复，恢复时间为12小时，所用培养基为液体培养基1；c.将上述表面消毒和光合作用活性恢复后的发菜原植体，在超净工作台上用两块灭过菌的玻璃片轻轻压碎，即可获得游离单细胞和藻丝体；此时用无菌水洗入灭过菌的固体培养基中，沉淀片刻，镜检，发现上清液中基本上是单细胞和藻丝体；d.将从c中获得的单细胞及藻丝体在液体培养基2中，模拟自然光，在20μmolm-2s-1光照，15℃的条件下，培养24天后，形成鞘增厚的藻丝体；e.在超净工作台上用镊子轻轻从液体环境中取出藻丝体，并转移到琼脂培养板表面；f.将载玻片放在培养箱中，模拟自然光，在30μmolm-2s-1光照，20℃的条件下培养，用喷水壶，每天定时、定量、均匀地向培养基表面浇水，每天浇水频率为3次，每次浇水量为0.14ml cm-2，即每天从6时至18时，模拟自然条件下日出、日落规律来设定浇水时间，将第一次浇水与最后一次浇水时间的跨度3等分，第一次为6时，最后一次为18时；该浇水条件和培养基面上，藻丝体鞘的颜色从绿色变成棕黄色，再变成棕色，最后变成棕黑色，这一颜色与发菜天然原植体的颜色接近，形态一致，两个月内增长1mm左右。
较佳实施例3液体培养基1、液体培养基2、固体培养基及固体培养基板的配制方法与实施例1相同。
发菜苗种的人工培养方法的步骤如下a.挑选丝体比较粗，色泽比较亮丽的发菜原植体0.5克，除去杂草，再用清水洗去里面的杂物，待下一步单离细胞所用；将筛选出的原植体表面在超净工作台上先用蒸馏水润洗几遍，然后88％的乙醇里浸润12秒，再用无菌水反复冲洗10次，待用；b.将洗干净的发菜原植体在22℃，30μmolm-2s-1光照条件下，模拟自然光进行光合作用恢复，恢复时间为8小时，所用培养基为液体培养基1；c.将上述表面消毒和光合作用活性恢复后的发菜原植体，在超净工作台上用两块灭过菌的玻璃片轻轻压碎，即可获得游离单细胞和藻丝体；此时用无菌水洗入灭过菌的固体培养基中，沉淀片刻，镜检，发现上清液中基本上是单细胞和藻丝体；d.将从c中获得的单细胞及藻丝体在液体培养基2中，模拟自然光，在80μmolm-2s-1光照，20℃的条件下，培养28天后，形成鞘增厚的藻丝体，e.在超净工作台上用镊子轻轻从液体环境中取出藻丝体，并转移到琼脂培养板表面；f.将载玻片放在培养箱中，在70μmolm-2s-1光照，28℃的条件下培养，用喷水壶，每天定时、定量、均匀地向培养基表面浇水，每天浇水频率为7次，每次浇水量为0.12ml cm-2，即每天从6时至18时，模拟自然条件下日出、日落规律来设定浇水时间，将第一次浇水与最后一次浇水时间的跨度7等分，第一次为6时，最后一次为18时；该浇水条件和培养基面上，藻丝体鞘的颜色从绿色变成棕黄色，再变成棕色，最后变成棕黑色，这一颜色与发菜天然原植体的颜色接近，形态一致，两个月内增长1.4mm左右。最佳实施例4液体培养基1、液体培养基2、固体培养基及固体培养基板的配制方法与实施例1相同。发菜苗种的人工培养方法步骤如下a.挑选丝体比较粗，色泽比较亮丽的发菜原植体0.5克，除去杂草，再用清水洗去里面的杂物，待下一步单离细胞所用；将筛选出的原植体表面在超净工作台上先用蒸馏水润洗几遍，然后75％的乙醇里浸润45秒，再用无菌水反复冲洗15次，待用；b.将洗干净的发菜原植体在25℃，45μmolm-2s-1光照条件下进行光合作用恢复，恢复时间为14小时，所用培养基为液体培养基1；c.将上述表面消毒和光合作用活性恢复后的发菜原植体，在超净工作台上用两块灭过菌的玻璃片轻轻压碎，即可获得游离单细胞和藻丝体；此时用无菌水洗入灭过菌的固体培养基中，沉淀片刻，镜检，发现上清液中基本上是单细胞和藻丝体；d.将从c中获得的单细胞及藻丝体在固体培养基2中，模拟自然光，在60μmolm-2s-1光照，25℃的条件下，培养16天后，形成鞘增厚的藻丝体，e.在超净工作台上用镊子轻轻从液体环境中取出藻丝体，并转移到琼脂培养板表面；f.将载玻片放在培养箱中，模拟自然光，在60μmolm-2s-1光照，25℃的条件下培养，用喷水壶，每天定时、定量、均匀地向培养基表面浇水，每天浇水频率为5次，每次浇水量为0.16ml cm-2，即每天从6时至18时，模拟自然条件下日出、日落规律来设定浇水时间，将第一次浇水与最后一次浇水时间的跨度5等分，第一次为6时，最后一次为18时；该浇水条件和培养基面上，藻丝体鞘的颜色从绿色变成棕黄色，再变成棕色，最后变成棕黑色，这一颜色与发菜天然原植体的颜色接近，形态一致，两个月内增长2.5mm左右。
虽然本文已详细描述了本发明的多个实施例，但是，本领域技术中，普通的技术人员可以认识到只要不脱离所附权利要求的内容，本发明在实施过程各个参数还可以有多种变化。
权利要求
1.一种发菜苗种的人工培养方法，按以下步骤进行a.发菜原植体的表面处理 挑选出的活性强的发菜原植体，用蒸馏水清洗，在超净工作台上用50-90％的乙醇水溶液浸润10-120秒，再用无菌水反复冲洗3-20次，待用；b.发菜原植体的光合作用活性恢复发菜原植体在10-35℃，20-140μmolm-2s-1光照条件下进行光合作用恢复，恢复时间为7-20小时，所用培养基为液体培养基1；c.发菜原植体破碎获得游离单细胞和藻丝将上述表面消毒和光合作用活性恢复后的发菜原植体，在超净工作台上用两块灭过菌的玻璃片压碎，即可获得游离单细胞和藻丝体；d.液体中藻丝体的培养将从c步骤中获得的单细胞及藻丝体转移到液体培养基2中，在10-150μmolm-2s-1光照，12-38℃的条件下，培养10-28天后，形成鞘增厚的藻丝体；e.藻丝体的转移在超净工作台上用镊子从液体环境中取出藻丝体，并转移到琼脂培养板表面；f.藻丝体的培养将载玻片放在培养箱中，在20-200μmolm-2s-1光照，12-38℃的条件下培养，用喷水壶，每天定时、定量、均匀地向培养基表面浇水，每天浇水频率为2-8次，每次浇水量为0.12-0.18mlcm-2，即每天从6时第一次至18时最后一次，将浇水时间跨度2-8等分定时浇水；液体培养基1由以下成份按比例组成硝酸钠 80～120mg3 H2O磷酸氢二钾 4.24～6.36mg7 H2O硫酸镁 6.24～9.36mg氯化钙 2.24～3.36mg9H2O硅酸钠 4.8～7.2mg柠檬酸 0.48～0.72mg柠檬酸铁铵 0.48～0.72mg己二胺四乙酸 0.08～0.12mg碳酸钠 1.6～2.4mg微量金属溶液 0.08～0.12ml蒸馏水 99.92～99.88ml液体培养基1中的微量金属溶液由以下成份按比例组成硼酸 228.8～343.2mg4H2O氯化锰 146.4～219.6mg1H2O硫酸锰 122.4～183.6mg7H2O硫酸锌 18～27mg5H2O硫酸铜 6.08～9.12mg钼酸钠 2～3mg蒸馏水 100ml液体培养基2由以下成份按比例组成硝酸钠 39.68～59.52mg磷酸氢二钾 3.2～4.8mg7H2O硫酸镁 6.16～9.24mg2H2O氯化钙 3.04～4.56mgH2O硅酸钠 4.8～7.2mg碳酸钠 1.6～2.4mg微量元素溶液 0.32～0.48ml土壤浸提液 0.4～0.6ml蒸馏水 99.28～98.92ml用稀盐酸氢氧化钠调节PH值为8.0-8.7液体培养基2中的微量元素溶液由以下成份按比例组成6H2O三氯化铁7.36～11.04mg4H2O氯化锰 3.44～5.16mg氯化锌 0.48～0.72mg6H2O氯化钴 0.2～0.3mg2H2O钼酸钠 0.336～0.504mg己二胺四乙酸钠60.4～90.6mg蒸馏水 100ml液体培养基2中的土壤浸提液提取方法取未施过肥的花园土1kg置于带盖铝锅中，加入蒸馏水1200ml，在电炉上加热沸腾2～3小时，冷却数小时，用砂布和滤纸依次过滤，获得的滤液加蒸馏水至总体积1L，高压灭菌，然后存放于2-4℃备用；固体培养基是在液体培养基2的基础上，将琼脂按0.7-2.0g/100ml比例加入，高压灭菌，待用；上述气生条件下琼脂培养基板的制作在超净工作台上将灭过菌的固体培养基加热后，冷却到38--44℃，按所设定的琼脂厚度，用移液枪吸取一定体积，转移到载玻片上，加入细沙，冷却，琼脂的厚度为0.5-3mm左右，培养基面上的细沙数目5-10个/cm2，即得合适的培养基板。
2.根据权利要求1所说的发菜培养方法，其特征在于该培养方法中，其d步骤中光照的强度为40-100 μmolm-2s-1；f步骤中藻丝体的培养光照条件为60-80μmolm-2s-1。
3.根据权利要求2所说的发菜培养方法，其特征在于该培养方法中，其d步骤中光照的强度为60μmolm-2s-1；f步骤中藻丝体的培养光照条件为60μmolm-2s-1，浇水频率为每天5次，浇水量为0.14-0.16mlcm-2。
4.根据权利要求1所说的发菜培养方法，其特征在于该培养方法中，各培养基的各组份取值下项增加5％，上项减小5％。
5.根据权利要求1所说的发菜培养方法，其特征在于该培养方法中，各培养基的各组份取值下项增加7％，上项减小7％。
全文摘要
本发明涉及一种发菜苗种的人工培养方法。该方法主要的步骤是挑选发菜的原植体用蒸馏水清洗，然后用乙醇浸润，再用无菌水反复冲洗；将洗干净的发菜原植体在液体培养基中进行光合作用恢复；将发菜原植体压碎，即可获得游离单细胞和藻丝体；单细胞及藻丝体在液体培养基中，适当的光温组合下，培养形成鞘增厚的藻丝体，从液体环境中取出藻丝体，并转移到琼脂培养板表面；每天定时、定量、均匀地向培养基表面浇水。本发明找到了藻丝体转变成原植体的光温组合、培养基面、浇水频率等条件，为进行发菜的大规模人工培养提供了苗种和技术上的支持。
文档编号A01G1/04GK1460711SQ0312693
公开日2003年12月10日 申请日期2003年6月20日 优先权日2003年6月20日
发明者高坤山, 叶长鹏 申请人:汕头大学