专利名称：利用离体植株组织生产紫杉醇的方法
技术领域：
本发明属于生产药物的生物方法，具体涉及利用红豆杉科植株枝叶生产紫杉醇的方法。
背景技术：
目前，紫杉醇由于其独特的抑瘤机理和显著的抗癌活性，雄踞抗癌药物市场份额的首位，占世界尚主要抗癌药物市场份额的22％。2000年，BMS公司报道，年紫杉醇针剂(TaxolTM)销售额为159.2亿美元，平均每天销售额大于430万美元。天然紫杉醇主要来源于红豆杉属(Taxus)植株，为常绿乔木或灌木，全世界约有11种，我国是红豆杉原生地之一，有其中的4种和1个变种，即西藏红豆杉(T.wallichiana)、东北红豆杉(T.cuspidata)、云南红豆杉(T.yunnanensis)、中国红豆杉(T.chinensis)和南方红豆杉(T.chinensis var mairei)。天然紫杉醇的含量很低，大约只有红豆杉树皮干重的0.01％，每治疗一个癌症患者需要3-6棵60-100年生的红豆杉主干树皮，而且由于红豆杉植株生长缓慢，定量砍伐已经造成了红豆杉资源的极度缺乏，见刘本叶，叶和春利用生物技术生产紫杉醇的研究进展.生物学通报，1999，345～8。化学全合成生产紫杉醇虽然已经完成，但需要的步骤复杂，耗费巨大，不具备大规范商业化生产的价值，见Nicolaou K.C.，Yang Z.，Liu J.J.，Ueno H.，Nantermet P.G.，GuyK.K.，Guy R.K.，Claiborne C.F.，Renaud J.，Couladouros E.A.Paulvannan K.，Sorensen E.J.Total synthesis of taxol.Nature，1994，367630～634。生物方法生产紫杉醇被认为是解决紫杉醇来源问题最具前景的途径，目前许多公司采用半合成的办法来生产紫杉醇，即从红豆杉枝叶中提取紫杉醇的前体物，然后通过化学修饰，合成紫杉醇及其类似物，见周忠强，梅兴国，常俊丽，陈菁，柯铁，紫杉醇化学半合成进展，广州化学，2000，26(3)52～60。采摘回来的红豆杉枝叶一般通过杀青处理，然后粉碎，烘干，进一步采用化学药剂浸提，获得浸膏，然后通过分离纯化，得到紫杉醇和各种紫杉烷的纯品，见阎家麟，范金城，王九一，紫杉醇提取纯化工艺，中国医药工业杂志，1996，27(12)531～534。以上生产工艺中，植物材料没有经过合理的采后加工处理，不仅枝叶中的紫杉醇含量低，而且在上述生产过程中，紫杉醇及其前体物降解严重，带来目标化合物得率低和产量不稳定等问题。
发明内容
本发明提供一种利用离体植株组织生产紫杉醇的方法，建立了合理的采摘工艺和采后加工技术，解决目前红豆杉枝叶采摘后直接提取的缺点，目的是提高采摘红豆杉枝叶中紫杉醇含量。
本发明的一种利用离体植株组织生产紫杉醇的方法，依序包括下述步骤(1)选择春秋季节，采摘当年生红豆杉新鲜枝叶；(2)预处理清洗去除新鲜枝叶中杂质，晾干，裁剪其长度至20-40cm；(3)将裁剪后的红豆杉枝叶扦插于无菌固体改良MS培养基上、或者将剪碎后的红豆杉枝叶培养于无菌液体改良MS培养基中，外加营养，保持外植体活性，培养基中添加药剂抑制杂菌污染，培养环境条件黑暗、荫凉、干净；(4)上述步骤(3)培养过程的同时诱导处理分别采用真菌诱导子，稀土元素或化学诱导剂对外植体诱导，扦插培养3-6天，剪碎培养1-3天；(5)上述步骤(3)培养过程的同时在培养基中添加紫杉醇生物合成的前体物质；(6)对经过前述培养、诱导、前体添加的红豆杉枝叶采用常规方法低温粉碎、有机溶剂浸提，得到紫杉醇浸提物。
上述的生产紫杉醇的方法，其特征是所述步骤(3)中，培养条件为黑暗，温度15-30℃，紫外灭菌保持环境干净，培养基中添加50mg/L重铬酸钾或50mg/L卡那霉素以防止防止杂菌污染。
上述生产紫杉醇的方法，所述步骤(4)中，真菌诱导子为红豆杉树皮中分离得到内生的黑曲霉、青霉菌、链霉菌、酵母或赤霉菌的细胞壁多糖提取物，浓度为50mg/L；稀土元素包括硝酸镧、硫酸铈铵、硝酸亚铈，浓度为2mg/L；化学诱导剂包括茉莉酸甲酯、浓度为100μmol/L，茉莉酸、浓度为100μmol/L，水杨酸、浓度为80mg/L，矮壮素、浓度为10mg/L，乙烯利、浓度为1-5mg/L。
上述生产紫杉醇的方法，在所述步骤(5)中，添加的前体物质分别为苯丙氨酸、浓度为2mmol/L，苯甲酸钠、浓度为0.5mmol/L，醋酸钠、浓度为2mmol/L，甘氨酸、浓度为0.1mmol/L。
本发明方法的反应原理是有选择的采摘生理活性高的红豆杉枝叶，利用植物体内固有的紫杉醇合成酶系，选择合的诱导和反应条件，添加诱导子促进红豆杉枝叶中固有的酶系活性，将其中高含量的前体物质转化为附加值高的紫杉醇，紫杉醇含量提高了67％左右，并添加前体物质，使红豆杉枝叶中的紫杉醇代谢前体物质朝合成紫杉醇的方向转化，提高枝叶中紫杉醇的得率。
本发明的优点在于1.利用红豆杉植株的可再生的当年生枝叶，代替传统紫杉醇提取工艺中采用的红豆杉主干树皮，不仅不会对红豆杉资源造成破坏，而且可以进行有效的开发利用。
2.对采集的红豆杉枝叶进行有效的诱导和调控，使枝叶中的次生代谢前体物质转化为紫杉醇，代替传统工业中采用的直接提取前体，然后进行体外半合成的方法，有效的利用了枝叶中丰富的酶系，催化前体物质合成具有药用价值的紫杉醇，工艺更简单。
3.传统工艺中，红豆杉枝叶在存放过程中常会发生紫杉醇和前体物质降解，导致提取得率低下和不稳定；本发明中，采用合适的采后条件，包括温度、光照、营养、外加前体物质和诱导等，充分保持红豆杉枝叶的生理活性，并促使枝叶中的前体物质向紫杉醇合成的方向转化。
4.传统工业中，红豆杉枝叶中紫杉醇含量低，代谢前体成分复杂，含量各异，因此提取和纯化需要大量的步骤和费用；本发明中，通过体外培养，将红豆杉枝叶中大量的前体物质转化为紫杉醇，提高了外植体中有用成分的含量，使提取成分单一，效率更高。
5.整个反应，无需外加酶系，生产成本低。
6.产品易于回收，生产工艺简单，无污染物排放。
具体实施例方式
实施例1春季采集红豆杉当年生枝叶，裁剪至20cm左右，无菌条件下取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，100μmol.L-1茉莉酸甲酯(MJ)诱导紫杉醇及其前体物质的产生。培养环境紫外灭菌，25±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高67％。
实施例2秋天采集红豆杉当年生枝叶，裁剪至40cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于200mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，50mg/L真菌诱导子黑曲霉细胞壁多糖诱导紫杉醇及其前体物质的产生。25±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高60％。
实施例3春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1卡那霉素，抑制污染，2mg/L硝酸亚铈诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第3天取样分析，紫杉醇含量提高37％。
实施例4春季采样，无菌条件下分别剪碎约5g针叶+5g树皮组织(2×4mm左右大小)，接种于100mL液体改良MS培养基中，同上添加50mg.L-1重铬酸钾和100uM茉莉酸甲酯。25±1℃，120r/mL暗培养，于接种后第1d取样分析，紫杉醇含量提高40％。
实施例5秋季采样，流水冲洗干净，无菌条件下分别剪碎约5g针叶+5g树皮组织(2×4mm左右大小)，接种于100mL液体改良MS培养基中，同上添加50mg.L-1卡那霉素和50mg/L真菌诱导子黑曲霉多糖。25±1℃，120r/mL暗培养，于接种后第3d取样分析，紫杉醇含量提高41％。
实施例6秋季采样，无菌条件下分别剪碎约5g针叶+5g树皮组织(2×4mm左右大小)，接种于100mL液体改良MS培养基中，同上添加50mg.L-1重铬酸钾和2mg/L硝酸亚铈。培养环境紫外灭菌，30±1℃，120r/mL暗培养，于接种后第1d取样分析，紫杉醇含量提高43％。
实施例7春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制霉污染，100uM茉莉酸诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第3天取样分析，紫杉醇含量提高43％。
实施例8春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，80mg/L水杨酸诱导紫杉醇及其前体物质的产生。15℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高30％。
实施例9春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，10mg/L矮壮素诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高38％。
实施例10春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，50mg/L青霉菌细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高18％。
实施例11春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，50mg/L链霉菌细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高27％。
实施例12
春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，50mg/L根霉细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高27％。
实施例13春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，50mg/L酵母细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高41％。
实施例14春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，50mg/L赤霉菌细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高43％实施例15春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，2mg/L硝酸镧诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高14％。
实施例16春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，2mg/L硫酸铈铵诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高17％。
实施例17春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，2mg/L硝酸亚铈诱导紫杉醇及其前体物质的产生，同时添加2mmol/L苯丙氨酸。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高48％。
实施例18春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，100μmol/L茉莉酸甲酯和5mg/L乙烯利诱导紫杉醇及其前体物质的产生，同时添加0.5mmol/L苯甲酸钠前体物质。30±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高61％。
实施例19春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，50mg/L黑曲霉细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生，同时添加2mmol/L醋酸钠前体物质。25±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高57％。
实施例20春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，80mg/L水杨酸诱导和1mg/L乙烯利紫杉醇及其前体物质的产生，同时添加0.1mmol/L甘氨酸。25±1℃暗培养，于接种后第6天取样分析，紫杉醇含量提高48％。
实施例21春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，剪取5000g枝叶扦插于固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1重铬酸钾，抑制污染，50mg/L黑曲霉细胞壁多糖诱导紫杉醇及其前体物质的产生，同时添加0.1mmol/L甘氨酸。25℃暗培养，于接种后第6天，提取红豆杉枝叶，获得紫杉醇及其前体物质地浸膏，经分析，紫杉醇含量提高48％。
实施例22春季采样，枝叶裁剪至30cm左右，剪取5000g枝叶扦插于固体改良MS培养基中，添加50mg.L-1卡那霉素，抑制污染，100μmol/L茉莉酸甲酯和5mg/L乙烯利诱导紫杉醇及其前体物质的产生，同时添加2mmol/L苯丙氨酸。25℃暗培养，于接种后第6天，制备紫杉醇及其前体浸膏，经分析，紫杉醇含量提高56％。
权利要求
1.利用离体植株组织生产紫杉醇的方法，依序包括下述步骤(1)选择春秋季节，采摘当年生红豆杉新鲜枝叶；(2)预处理清洗去除新鲜枝叶中杂质，晾干，裁剪其长度至20-40cm；(3)将裁剪后的红豆杉枝叶扦插于无菌固体改良MS培养基上、或者将剪碎后的红豆杉枝叶培养于无菌液体改良MS培养基中，外加营养，保持外植体活性，培养基中添加药剂抑制杂菌污染，培养环境条件黑暗、荫凉、干净；(4)上述步骤(3)培养过程的同时诱导处理分别采用真菌诱导子，稀土元素或化学诱导剂对外植体诱导，扦插培养3-6天，剪碎培养1-3天；(5)上述步骤(3)培养过程的同时在培养基中添加紫杉醇生物合成的前体物质；(6)对经过前述培养、诱导、前体添加的红豆杉枝叶采用常规方法低温粉碎、有机溶剂浸提，得到紫杉醇浸提物。
2.如权利要求1所述生产紫杉醇的方法，其特征是所述步骤(3)中，培养条件为黑暗，温度15-30℃，紫外灭菌保持环境干净，培养基中添加50mg/L重铬酸钾或50mg/L卡那霉素以防止防止杂菌污染。
3.如权利要求1或2所述生产紫杉醇的方法，其特征是所述步骤(4)中，真菌诱导子为红豆杉树皮中分离得到内生的黑曲霉、青霉菌、链霉菌、酵母或赤霉菌的细胞壁多糖提取物，浓度为50mg/L；稀土元素包括硝酸镧、硫酸铈铵、硝酸亚铈，浓度为2mg/L；化学诱导剂包括茉莉酸甲酯、浓度为100μmol/L，茉莉酸、浓度为100μmol/L，水杨酸、浓度为80mg/L，矮壮素、浓度为10mg/L，乙烯利、浓度为1-5mg/L。
4.如权利要求1或2所述生产紫杉醇的方法，其特征是在所述步骤(5)中，添加的前体物质分别为苯丙氨酸、浓度为2mmol/L，苯甲酸钠、浓度为0.5mmol/L，醋酸钠、浓度为2mmol/L，甘氨酸、浓度为0.1mmol/L。
5.如权利要求3所述生产紫杉醇的方法，其特征是在所述步骤(5)中，添加的前体物质分别为苯丙氨酸、浓度为2mmol/L，苯甲酸钠、浓度为0.5mmol/L，醋酸钠、浓度为2mmol/L，甘氨酸、浓度为0.1mmol/L。
全文摘要
利用离体植株组织生产紫杉醇的方法，属于生产药物的生物方法，具体涉及利用红豆杉科植株枝叶生产紫杉醇的方法，解决目前红豆杉枝叶采摘后直接提取的缺点，目的是提高采摘红豆杉枝叶中紫杉醇含量。本发明依序包括下述步骤(1)选择季节采摘当年生红豆杉新鲜枝叶；(2)清洗、晾干并合理裁剪；(3)在黑暗、荫凉和外加营养条件下通过扦插或枝叶剪碎后组织培养；(4)培养的同时对外植体诱导处理；(5)培养过程的同时在培养基中添加紫杉醇生物合成的前体物质；(6)采用常规方法低温粉碎、有机溶剂浸提，得到紫杉醇浸提物。本发明大大提高紫杉醇的产量，降低前体物的含量，产品易于回收，无污染物排放。
文档编号A01H4/00GK1628506SQ20041006096
公开日2005年6月22日 申请日期2004年10月15日 优先权日2004年10月15日
发明者余龙江, 刘智, 赵春芳, 付春华, 杨英, 杨秦, 李丽琴 申请人:华中科技大学