专利名称：基于o,p－亚乙基(双)羟基苯基甘氨酸的植物营养素的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)-甘氨酸、其金属络合物、含其作为活性成分的农药组合物的混合物，其在农业领域中作为植物营养素或植物用肥料的组分以及治疗植物萎黄病的应用。
式I的N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸(EDDHA)是已知的。
芳族羟基在两个分离的苯环上的不同芳族碳原子上的位置使得可形成不同的异构体。羟基-取代基的主要位置是在其各自的苯环上的邻位和对位。
异构体之一是N，N’-亚乙基-双(4-羟基苯基)甘氨酸，其中两个苯环都被羟基对位取代(p，p-EDDHA)。此化合物是本领域已知的，通常认为不适用于农业中络合金属。另一异构体是N，N’-亚乙基-双(2-羟基苯基)甘氨酸，其中两个苯环都被羟基邻位取代(o，o-EDDHA)。此化合物是本领域已知的，通常被描述为最适合络合金属的化合物，并且最适合用作植物营养素或肥料，因为其对铁的络合亲和力特别强。
o，o-EDDHA的铁螯合物显示的配位数是6，广泛用于农业作为植物营养素或植物肥料，和用于治疗作物的黄萎病。在例如US-A-2921847中展示了o，o-EDDHA的铁螯合物的示例图片。
另一种异构体是式II的N，N’-亚乙基-(2-羟基苯基)-甘氨酸基-(4-羟基苯基)甘氨酸，其中一个苯环被羟基邻位取代，而另一个苯环被羟基对位取代(o，p-EDDHA)。
因为o，p-EDDHA的铁螯合物显示的配位数是5，其对铁的络合亲和力弱于o，o-EDDHA，此化合物通常被视为在o，o-EDDHA的制造过程中产生的不希望的副产物。
然而，少量的o，p-EDDHA通常作为o，o-EDDHA产品的不希望但不可避免的杂质而被接受，其在制造过程中作为副产物产生。事实上，在大多数市售EDDHA产品中都发现了作为o，o-EDDHA的杂质存在的少量的o，p-EDDHA。
为了提供纯产物和达到产品的均质性，大多数预期的工业化生产方法目的在于避免作为副产物的o，p-EDDHA，例如在CH-A-633257中公开的方法。
为了治疗植物黄萎病，适用于铁的螯合剂应a)对铁有充分稳定的亲和力，以避免与其他阳离子的络合作用相竞争，b)应与常见的土壤物质不起反应，c)对铁(II)的亲和力应低，d)在双子叶植物中，应不阻止铁的还原和e)在单子叶植物中，应不与天然的螯合剂植物含铁细胞竞争(与植物含铁细胞竞争是o，o-EDDHA的缺点之一)。此外，f)该螯合剂应能非常快速地从土壤固相中释放铁。
基于o，o-EDDHA的市售螯合剂用于治疗植物黄萎病的性能在这方面是不完全令人满意的。同样地，从上述产品中获得铁在某种程度上被延迟，即使是在预期的向植物给药旨在迅速地提供植物营养素铁的情况下。
本发明的一个目的是提供一种改进的EDDHA螯合剂，该螯合剂不仅比已知的市售螯合剂更快速地释放铁，而且不改变现有技术描述的螯合剂的有利性能谱。
已意外地发现在铁螯合剂EDDHA产品中使用较高量的前述不希望的副产物o，p-EDDHA事实上改善了所述产品的植物营养素和肥料性能。
根据本发明，提出通过在含有N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的o，o-和o，p-异构体的混合物中使用有效量的o，p-EDDHA改善金属螯合剂EDDHA的植物营养素和黄萎病治疗性能，其特征在于N，N’-亚乙基-(2-羟基苯基)-甘氨酸基-(4-羟基苯基)甘氨酸(o，p-EDDHA)与N，N’-亚乙基-双(2-羟基苯基)甘氨酸(o，o-EDDHA)的摩尔比大于0.8∶1，特别是0.9∶1至100∶1。优选，o，p-EDDHA与o，o-EDDHA的比是1∶1至50∶1，或2∶1至10∶1，或0.9∶1至2∶1。
本发明还涉及包含N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的异构体混合物的金属络合物，其中N，N’-亚乙基-(2-羟基苯基)-甘氨酸基-(4-羟基苯基)甘氨酸(o，p-EDDHA)与N，N’-亚乙基-双(2-羟基苯基)甘氨酸(o，o-EDDHA)的摩尔比大于0.8∶1，特别是0.9∶1至100∶1。优选，o，p-EDDHA与o，o-EDDHA的比是1∶1至50∶1，或2∶1至10∶1，或0.9∶1至2∶1。
本发明的EDDHA-混合物的金属络合物可有利地用作农业上可接受的组合物中的有效成分，或作为植物营养素作为单一的活性成分，或作为植物营养素组合的一部分，或农业中的植物肥料中的组分。优选用于这些目的的EDDHA异构体混合物包含按照本发明说明书所述比例的o，p-EDDHA和o，o-EDDHA的铁螯合物。铁螯合物特别可用作农业作物的营养素和治疗所述植物的黄萎病的药剂，在农业实践中以农业上可接受的组合物形式与适宜的惰性载体材料一起使用，或者作为肥料的活性组分用于农业栽培的作物。
优选，所述金属螯合物是三价铁EDDHA螯合物。所述三价铁螯合物不限于只包含铁作为金属的螯合物，其也可含有其他金属，优选碱金属或碱土金属，如钠、钾、钙或镁，特别是钠。优选，三价铁螯合物是NaFe(EDDHA)、KFe(EDDHA)型的螯合物或其混合物。
三价铁螯合物的铁含量通常是0.5-10wt％，优选1-8wt％，特别是1.5-7％，特别是2-6wt％或2-5.5wt％，尤其是2.4-5.5wt％。
与以前的分析技术大不相同，利用特别研发的并且适合此目的的分析方法，即恒(isocratic)离子对高效液相色谱，现在可用定量和定性参数准确地确定o，p-EDDHA和o，o-EDDHA的含量，使含o，p-EDDHA的混合物的有益效果与所含o，p-EDDHA和o，o-EDDHA的摩尔比相互关联。
该分析方法基本上是已知的，已公开出版于Journal ofChromatography A，1996，727，253-264和Journal ofChromatography A，1997，789，453-460。为本发明目的，其中所述方法特别调整适合测定EDDHA异构体。
此调整方法描述了一种过程，用于色谱测定含o，o-EDDHA和o，p-EDDHA作为螯合剂的样本中螯合铁总量和其三价铁螯合物的量，在下面的实施例中详细说明。
已通过新研发的分析方法对迄今为止市场上可买到的产品中o，p-EDDHA和o，o-EDDHA的比率在标准实验室条件下进行了测定，显示在已知产品中所有o，p-EDDHA与o，o-EDDHA的比率均低于0.7∶1。
本发明的EDDHA混合物和含有这些混合物的农药组合物通常以由农药领域常见的标准制剂获得的稀释的含水悬浮液形式施用，可通过常规施用方法如喷雾或喷粉施用于打算处理的植物，或植物正在生长的区域。当为了使工序合理化，打算同时给药其他农业上使用的活性成分时，施药可以任何希望的连续顺序进行，或者甚至以由市售制剂制得的桶混物形式施药。或者，在经选择的情况下，本发明的EDDHA混合物可以固体制剂即作为粉剂或颗粒剂的形式施用，颗粒剂可能需要用机械混入土壤内。
其他农业上可用的活性成分可以是另外的肥料、微量营养物供体或影响植物生长和发育的其他制剂。同样，需要时还可以同时施用植物保护产品如选择性除草剂或杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂，或若干所述制剂的混合物。
本发明的EDDHA的异构体混合物的组合物和制剂还可含有农业上可接受的载体、表面活性剂或制剂技术中常用的其他施用促进助剂。适宜的载体和表面活性剂可以是固体或液体，对应于制剂技术中常用的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、增稠剂、粘合剂或肥料。所述载体和添加剂描述于例如WO95/30651。
本发明的EDDHA混合物以未更改的形式即在制造过程中获得的工业纯的粗产物形式使用，或优选与制剂技术中常用的助剂一起使用，并且为此目的以已知的方式有利地配制成例如乳油、可涂覆糊剂、可直接喷雾或可稀释的溶液、稀乳液、可湿性粉剂、可溶性粉剂、粉剂、颗粒剂和通过包囊在例如聚合物中。
如同组合物的性质一样，施用方法如喷雾、雾化、喷粉、撒布、涂覆、土壤浸润或浇注是根据预期的目的和主要的环境进行选择的。
制剂，即含有本发明混合物的组合物或制剂，还可含有固体或液体助剂如载体或溶剂，并且是以本身已知的方式制备的，例如通过均匀地混合和/或研磨活性成分与填充剂，例如溶剂、固体载体，和适当时的表面活性化合物(表面活性剂)。
优选用于包含本发明的EDDHA-混合物的组合物中的上述类型的其他助剂成分是木质素磺酸钠、糊精、异辛基酚聚乙二醇醚、聚羧酸钠2，5-呋喃二酮聚合物与2，4，4-三甲基戊烯，和十二烷基苯磺酸钠盐。制剂技术中常规使用的其他表面活性剂是本领域技术人员已知的，或者可在相关技术文献中找到。
虽然市售产品优选配制成浓缩物，但最终使用者一般会使用市售制剂的稀释分散体形式的螯合剂混合物。
本发明的制剂通常含有以本发明混合比存在的N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的三价铁螯合物，其含量为1-95wt％，或30-88wt％，或35-73wt％，或35-79wt％。
如果制剂设计含有另外的植物营养素或植物肥料，那么这些物质优选选自包括硫酸钙、硝酸钙Ca(NO3)2*4H2O、碳酸钙、硝酸钾、硫酸镁、磷酸氢钾KH2PO4、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、氯化镍、硫酸钴、氢氧化钾、氯化钠、硼酸及其金属盐、Na2MoO4的组。优选的另外的营养素的各自的含量为5-50wt％，优选10-25wt％，或15-20wt％。
优选的另外的营养素是尿素、蜜胺、氧化钾和无机硝酸盐。最优选的另外的植物营养素是氧化钾。
当优选的另外的营养素是尿素时，其含量是1-20wt％，优选2-10wt％，或3-7wt％。
本发明优选的独立制剂是含有下列成分的组合物1-99wt％N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的三价铁螯合物，其中o，p-EDDHA与o，o-EDDHA的比率高于0.8∶1；0-20wt％尿素，0-50wt％氧化钾；或30-88wt％N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的三价铁螯合物，其中o，p-EDDHA与o，o-EDDHA的比率是1∶1至50∶1；2-10wt％尿素，10-25wt％氧化钾；或35-73wt％N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的三价铁螯合物，其中o，p-EDDHA与o，o-EDDHA的比率是2∶1至10∶1或0.9∶1至2∶1；3-7wt％尿素，15-20wt％氧化钾。
本发明的混合物可含有植物保护杀真菌剂组合的混合物，有时可产生无法预期的协同活性。所述混合物不限于两种活性成分(式I的一种和植物保护杀真菌剂列表中的一种)，相反，许多混合物包含多于一种杀真菌剂。特别适用于此目的的混合成分包括，例如唑类，如氧唑环、联苯三唑醇、糠菌素、环丙唑醇、苯嘧甲环唑、烯唑醇、氟环唑、腈苯唑、氟喹唑、氟硅唑、粉唑醇、己唑醇、抑霉唑、S-抑霉唑、亚胺唑、种菌唑、叶菌唑、腈菌唑、恶咪唑、稻瘟酯、戊菌唑、啶斑肟、咪鲜胺、丙环唑、丙硫菌唑、硅氟唑、戊唑醇、四氟醚唑、三唑酮、三唑醇、氟菌唑和灭菌唑；嘧啶甲醇类，如环丙嘧啶醇、氯苯嘧啶醇和氟苯嘧啶醇；2-氨基-嘧啶类，如硫嘧菌灵、二甲嘧酚和乙嘧酚；吗啉类，如十二环吗啉、丁苯吗啉、螺恶茂胺和十三吗啉；苯胺吡啶类，如嘧菌环胺、嘧菌胺和嘧霉胺；吡咯类，如拌种咯和咯菌腈；苯基酰胺类，如苯霜灵、呋霜灵、甲霜灵、mefenoxam(M-甲霜灵)、呋酰胺和恶霜灵；苯并咪唑类，如苯菌灵、多菌灵、咪菌威、麦穗宁和噻菌灵；二甲酰亚胺类，如乙菌利、菌核利、异菌脲、甲菌利、腐霉利和乙烯菌核利；羧酰胺类，如萎锈灵、甲呋酰胺、氟酰胺、呋吡唑灵、灭锈胺、氧化萎锈灵和噻氟菌胺；胍类，如双胍盐、多果定和双胍辛；甲氧基丙烯酸酯类，如嘧菌酯、醚菌胺(SSF-129)、氟嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌胺、肟醚菌胺、啶氧菌酯、唑菌胺酯和肟菌酯；二硫代氨基甲酸酯类，如福美铁、代森锰锌、代森锰、代森联、丙森锌、福美双、代森锌和福美锌；N-卤代甲硫基四氢邻苯二甲酰亚胺类，如敌菌丹、克菌丹、苯氟磺胺、氟氯菌核利、灭菌丹和甲苯氟磺胺；铜化合物，如波尔多液、氢氧化铜、氯氧化铜、硫酸铜、氧化亚铜、代森锰铜和喹啉铜；硝基酚衍生物，如二硝酯和异丙消；有机磷衍生物，如克瘟散、异稻瘟净、稻瘟灵、氯瘟磷、吡菌磷和甲基立枯磷；其他种类，如活化酯、敌菌灵、苯噻菌胺、灭瘟素、啶酰菌胺、灭螨猛、地茂散、百菌清、IKF-916(建议名氰霜唑)、环氟菌胺、霜脲氰、二氯萘醌、哒菌酮、氯硝胺、乙霉威、烯酰吗啉、噻唑菌胺、氰菌胺、SYP-LI90(建议名氟吗啉)、二氰萘醌、土菌灵、恶唑菌酮、咪唑菌酮、三苯锡、嘧菌腙、氟啶胺、磺菌胺、环酰菌胺、藻菌磷、恶霉灵、异丙菌胺、春雷霉素、磺菌威、metrafenone、戊菌隆、四氯苯酞、picobenzamid、多氧霉素、噻菌灵、霜霉威、咯喹酮、proquinazid、苯氧喹啉、五氯硝基苯、硅噻菌胺、硫磺、咪唑嗪、triadinil、三环唑、嗪氨灵、有效霉素或苯酰菌胺。
在上述含有杀真菌剂混合物的组合物中，活性成分的混合比的选择应使其达到任选防治宿主植物上的植物致病性微生物的效果，这反过来又使植物能充分利用从EDDHA-螯合物混合物中得到补充量的金属的益处。相对于第二种杀真菌剂的混合比通常是100∶1至1∶100，更优选10∶1至1∶10。该混合物不仅包含所列可组合的杀真菌活性成分之一，而且可包含多于一种的另外的选自特定组的活性成分，从而形成例如三元或甚至是四元混合物。
本发明的制剂还可含有除草剂，特别是如例如EP-A-837632中所述的磺酰脲类。
为了制造本发明的混合物，可采用几种方法。这些方法通常适用于制造纯的o，o-EDDHA和o，p-EDDHA。之后可将纯产物混合，产生希望比率的混合物。优选方法是直接生产本发明的混合物。例如，可采用DE-1032748中的方法，该方法示于方案1。
方案1 在此方法中，第一步，两当量的o-羟基苯甲醛或p-羟基苯甲醛或优选其混合物，与一当量的1，2-二氨基乙烷缩合，除去水，产生醛亚胺。此反应可在已知的标准反应条件下进行。反应过程中作为产物产生的水优选被除去或捕集。通常这可通过标准实验室方法如添加干燥剂如硫酸镁或硫酸钠实现，或通过共沸蒸馏和用Dean-Stark分离器除去水。在后面的情况下，优选使用无水苯或甲苯作为溶剂。在第二步中，第一步的产物与氢氰酸反应。此步骤可通过在少量无机酸如盐酸的存在下，在大约20-25℃温度下，用氢氰酸的水溶液处理第一步的醛亚胺产物来进行。作为选择，可使用碱金属氰化物如氰化钠的酸性水溶液作为氰化物源。
对于制造纯的o，p-EDDHA，只需要改变第一步反应的细节。在此情况下，使用与1，2-二氨基乙烷等摩尔的o-羟基苯甲醛或p-羟基苯甲醛，足以缩合两个氨基之一，待这些化合物的反应完成后，分别加入第二当量的另一种羟基苯甲醛异构体，反应混合物进一步反应直至完成。
还可以将羟基苯甲醛与氢氰酸反应，产生相应的氰醇，在第二步中，该氰醇与1，2-乙二胺反应。
在第三步中，所得乙二胺-N，N’-双(羟基苯基)乙腈可通过已知方法水解，例如通过用浓盐酸在80-100℃温度下反应水解。然后向反应混合物中加入碱，直至pH值为2-4，优选3-3.5。收集沉淀物，然后在浓盐酸中加热，产生所得N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的二盐酸盐。通过将二盐酸盐溶解于过量的氢氧化钠溶液中并调节pH值至4，最终可获得游离的酸本身。
另一种方法描述于J.Agric.Food Chem.2002，50，6395-6399。用此方法可获得纯的o，o-EDDHA和纯的o，p-EDDHA。这些纯的异构体可以希望的比率混合，以获得本发明的混合物。
另一种在单容器反应(single-vessel reaction)中获得o，o-EDDHA的方法描述于US4130582。这种制备EDDHA的方法旨在通过抑制p，p-EDDHA的形成产生高纯度的o，o-EDDHA，否则主要形成的是p，p-EDDHA。其包括在碱的存在下，过量的苯酚与乙二胺、乙醛酸反应。当反应器中水的含量保持较低时，所得o，o-EDDHA的纯度超过95％，但当容许较高的水含量时，其纯度降低。
意外的是，现已发现，本发明的混合物可在单容器反应中合成，适合按比例扩展到简单工业规模的反应器尺寸，该方法包括使用2-至5-倍过量的苯酚起始物，和当苯酚与乙二胺和乙醛酸在碱的存在下反应时，调节反应混合物中水的含量在反应混合物重量的15-30％范围内。
在使用特别少量的苯酚的情况下，就不能在熔化的苯酚中进行反应，或者不能适当地操纵反应器的控制设备，可能必须添加一定量的惰性有机溶剂，使反应温度调节至40-80℃。
在本发明的螯合剂中o，o-EDDHA和o，p-EDDHA的混合比可根据本发明希望的实施方案，通过变化所述的反应条件进行调节。
特别是，这种用于制备本发明的EDDHA混合物的方法包括在大约45-80℃温度下，将苯酚与乙二胺、乙醛酸和碱反应。苯酚、乙二胺、乙醛酸和碱优选以4-10∶0.5-0.55∶0.95-1.10∶0.75-1.25的摩尔比存在、优选的碱是碱金属氢氧化物，特别是氢氧化钠。
另一适用于制备本发明混合物的方法是通过在高温下改变pH值将o，o-EDDHA转化成o，p-EDDHA。此种转化的pH值是pH 1-14，或从大于7，特别是8，至14，或9-13，温度是50-120℃，或70-100℃，或80-90℃，时间为大约5-15小时，或6-12小时，或7-10小时。
在这些条件下，为了获得本发明的混合物，反应必须在选定的条件下进行，然后当获得需要的混合物时停止。通常，通过在水中骤冷反应混合物以停止反应。作为选择，含有希望比率的o，o-EDDHA和o，p-EDDHA的溶液可用于进一步的反应步骤中以产生金属络合物，如通过添加氯化铁(III)产生铁螯合物。此处理步骤可按照已知的方法进行。
根据选择的确切的反应步骤，技术人员在各种常规试验的基础上确定需要多少反应时间以获得希望比率的o，o-EDDHA和o，p-EDDHA。反应混合物可通过Journal of Agriculture & Food Chemistry，(2001)49(8)3527-32)中所述的方法进行分析。
通过将o，o-EDDHA置于这些条件下，将转化成o，p-EDDHA，从而能够方便的制备具有本发明比率的o，o-EDDHA和o，p-EDDHA的混合物。还可以使用两种EDDHA异构体的混合物并通过此方法提高o，p-异构体的含量。EDDHA的金属盐如铁盐也适合作为此方法的离析物并且可以同样地使用。
尽管已知于例如US4130582和其中的参考文献的方法是技术人员熟知的并且需要同样的起始物，但其中没有向技术人员教导在所公开的工艺过程中可获得o，p-EDDHA。
在本发明范围内，农业实践中需要铁螯合物作为另外的植物营养素的目标植物和患有植物黄萎病的农业作物包括，例如下列属的植物谷物(小麦、大麦、黑麦、燕麦、稻、玉米、高梁、小米和相关品种)；甜菜(糖用甜菜和饲料甜菜)；梨果、核果和小果(苹果、梨、李子、桃、杏、樱桃、草莓、覆盆子和黑莓)；豆科植物(菜豆、扁豆、豌豆、大豆)；油料植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生)；葫芦科(葫芦、黄瓜、甜瓜)；纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)；柑橘类水果(桔、柠檬、葡萄柚、橘)；蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、西红柿、马铃薯、胡椒)；月桂科(鳄梨、肉桂、樟脑)；和植物如烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、胡椒、藤本植物、啤酒花、香蕉和天然橡胶植物以及观赏植物。
本发明混合物或含所述混合物的农药组合物的优选施用方法是将水悬浮液施用于土壤(土壤施用如在顶部上方喷雾或施用到种畦内)或作为土壤浇灌，施药的频率和施药量可考虑土壤的性质、气候、种植的作物、黄萎病的影响水平、和被处理植物的成熟阶段选择。本发明的混合物还可施用到叶片(叶片施用)，施药的频率和用量也根据作物、黄萎病水平、所述情况下的作物发育阶段选择，或者通过用活性成分的液体制剂浸渍种子颗粒或用固体制剂将其包衣而施用于种子颗粒(包衣)。
有利的施药量通常是1kg-50kg o，o-和o，p-EDDHA的异构体混合物的三价铁螯合物/ha，优选2.5kg-20kg有效成分/ha，特别是5kg-10kg有效成分/ha。
当用作拌种时，有利的用量是每千克种子0.001kg-1.0kg o，o-和o，p-EDDHA的异构体混合物，特别是o，o-和o，p-EDDHA三价铁螯合物的混合物。
本文引用的参考文献为了有用的目的参考引用。
下列实施例仅仅是为了说明上述发明，而不是以任何方式限制其范围。所给温度是以摄氏度为单位。
实施例分析方法通过线性梯度离子对高效液相色谱测定铁螯合物。当将铁螯合物(阴离子)加入含有大阳离子(离子对试剂)的极性流体(洗脱液)中时，形成了离子对。此离子对保留在非极性固相(固定相)中。保留强度取决于分子大小及其酸度。然后，每种铁螯合物表现出由螯合剂决定的特征性的保留时间和特征性谱，将其与样本中存在的其他物质分离。分离在反相硅胶柱上进行，TBA+(氢氧化四丁基铵)的水溶液和乙腈作为洗脱液。
检测是基于在480nm的光度测定法或二极管陈列检测器。对于Fe3+/EDDHA，可使用梯度方法或恒定浓度方法。Fe3+/EDDHA标准溶液(Fe)浓度＝100mg/L。
说明将0.1613g×100/R N，N，-亚乙基-(2-羟基苯基)-甘氨酸基-(4-羟基-苯基)甘氨酸(o，p-EDDHA)溶解于150ml水和2.7ml NaOH(浓度＝0.1mol/l)中，其中R是用Fe(III)标在恒pH系统中通过光度滴定法获得的，以百分比为单位的标准的酸形式o，p-EDDHA的配位滴定纯度。完全溶解后，加入0.1271g氯化铁六水合物(FeCl3·6H2O)，搅拌大约5分钟。用氢氧化钠溶液(4.3)将溶液调节至pH7.0。将溶液于黑暗中静置过夜，令过量铁作为氧化物沉淀，通过纤维素滤器定量过滤，用水补足体积(250ml)。
测定用洗脱液两种溶液用于制备线性梯度洗脱液溶液A向3.33ml TBAOH(40wt％氢氧化四丁基铵的水溶液)中加入500ml水。用HCl调节pH至6.0。加入350ml乙腈(HPLC级)，在1L容量的烧瓶中用水补足体积，并通过0.2μm薄膜滤器过滤。
溶液B向3.33ml TBAOH(40wt％氢氧化四丁基铵的水溶液)中加入150ml水。用HCl调节pH至6.0，加入750ml乙腈(HPLC级)，在1L容量的烧瓶中用水将溶液补足体积，并通过0.2μm薄膜滤器过滤。也可使用TBACl或TBABr，只要用NaOH调节pH至6.0。对于Fe3+/o，p-EDDHA测定，还可采用只使用溶液A作为洗脱液的恒浓度(isocratic)方法。
色谱仪配备了以1.5ml/min流速输送洗脱液的梯度泵。表1给出了梯度表。
表1梯度表
对于Fe3+/o，p-EDDHA测定，还可使用100％A进行7分钟的恒浓度洗脱。色谱仪配备了具有20μl注射环(loop)的注射阀。所用柱是C-18柱；3.9×150mm ID；dp＝5μm(例如SYMMETRYC18，来自WATERS)和具有480nm滤器或二极管阵列和积分器的UV/VIS-检测器。
样本按照Directive 77/535/EEC，OJ №L213，22.8.1977的方法1制备。
样本溶液的制备称重125mg，误差(within)0.1mg，加入100ml烧杯内(对于具有超过4％螯合铁的样本，使用80mg，对于具有低于2％螯合铁的样本，使用250mg)。加入80ml水并搅拌30分钟。待搅匀后，用水将溶液稀释至刻度。
校准液的制备用移液管将V1ml量(见表2)的螯合物标准溶液移入4个100ml容量的烧瓶内，并用水补足体积，均化。
表2校准曲线的制备
色谱分析在进样前，即时将所有溶液通过0.45μm薄膜滤器过滤。将标准溶液(表2)注入色谱系统。确定所有溶液的保留时间和测定螯合物(Fe3+/o，p-EDDHA)色谱峰的面积。
用标准溶液的峰面积值相对相应的螯合剂浓度(mg Fe/L或mmol/l)绘出校准曲线图。
注入样本溶液，通过所得峰的保留时间鉴定螯合剂，如果使用二极管阵列检测器，用UV-可见光谱确认。测量螯合剂的峰面积。使用校准曲线确定螯合的离子的浓度(mg Fe/L)或螯合剂的浓度(mmol/L)。
在铁螯合物的情况下，肥料中作为Fe3+/o，p-EDDHA存在的铁的重量百分比(Fe(％))等于Fe(％)＝C/m*0.01-其中C是用校准曲线确定的被o，p-EDDHA螯合的铁的浓度(mg/L)，m是以克为单位的分析用取样的质量。
制备实施例N，N’-亚乙基-双[(羟基苯基)乙腈]的准备将109.8g o-羟基苯甲醛和134.2g p-羟基苯甲醛在600ml无水甲苯中的混合物冷却至0℃，加入80g乙二胺在300ml无水甲苯中的溶液，以便温度不超过70℃。当加胺完成后，用连接回流冷凝器的Dean-Stark分离器回流该混合物直至不再有水分离出来。减压蒸馏除去溶剂和过量的胺。产率90％。
在0℃下，向268.1重量份反应产物中加入700体积份液体氢氰酸、180重量份水和1.5体积份盐酸。将反应混合物搅拌超过三个小时。在反应时间内形成反应产物，将其滤出。熔点113-115℃。
N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的制备将100重量份N，N’-亚乙基-双[(羟基苯基)乙腈]在1000体积份浓盐酸中加热至80-100℃3小时。离析物缓慢溶解，大约1/2-1小时后，另一种化合物开始沉淀。将反应混合物冷却，沉淀物滤出，用异丙醇洗涤。用水吸收100重量份沉淀物，并加热至100℃4小时。将一半水蒸出，加入氢氧化钠溶液直至pH值达到3.5。形成沉淀，将其滤出，再溶解于浓盐酸中，并加热至100℃1小时。将沉淀溶解于氢氧化钠水溶液中，并将pH值调节至4.0。反应产物沉淀，过滤和用0℃的异丙醇洗涤，干燥。熔点218-220℃，产率31％。
N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的o，o-和o，p-混合物的制备用US-A-4130582中所述和上述的方法，制备o，o-EDDHA。用相同的方法，通过等摩尔量的o-羟基苯甲醛和乙二胺反应制备o，p-EDDHA。反应完成后，加入等摩尔量的p-羟基苯甲醛，如US-A-4130582所述进一步反应，产生o，p-EDDHA。将10g o，o-EDDHA和10g o，p-EDDHA置于研钵中，充分研磨。
在单容器反应中制备N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的o，o-和o，p-混合物向配备了冷凝器、滴液漏斗和机械搅拌装置的反应容器内加入17摩尔熔化的苯酚，保持温度在40-45℃。然后加入1摩尔乙二胺和含有1.6摩尔氢氧化钠和10摩尔水(10mol)的50％氢氧化钠水溶液。再次将反应混合物冷却至40-45℃后，加入含有2摩尔乙醛酸的50％含水乙醛酸，将反应混合物加热至70℃3小时。然后将反应混合物倒入过量水中，用二氯甲烷提取过量的苯酚。水相通过1H-NMR检测，发现含有大约1∶1的o，o-EDDHA和o，p-EDDHA。
三价铁螯合物的制备向N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸中加入氢氧化钠溶液直至获得清澈溶液。以过量27％的用量缓慢加入40％工业级氯化铁(III)溶液，同时通过另外加入氢氧化钠溶液保持pH值在7-8。蒸发溶液，产生铁含量5.3％的EDDHANaFe型三价铁螯合物。
1.o，o-EDDHA转化成o，p-EDDHA将按照US4130582制备的2g o，o-EDDHA溶解于水中，产生10ml20％水溶液。用50％氢氧化钠水溶液将o，o-EDDHA溶液调节至pH13。将反应混合物加热至80-90℃，并在此温度下搅拌7小时。将反应混合物的样本在重水中骤冷，用98％硫酸将pH调节至0-1。按照Journal ofAgriculture & Food Chemistry，(2001)49(8)3527-32，通过质子-NMR分析样本。发现混合物含有1∶1的o，o-EDDHA和o，p-EDDHA。
生物实施例在生物试验中使用大豆(栽培品种Oshumi)植物。植物得自于在标准种子生长程序下，在封闭的无菌浅盘中发芽的大豆种子。将种子放在浅盘内浸透了50ml蒸馏水的纤维素纸上，用另一张纸覆盖其上。加入30ml蒸馏水和20ml 1mM的CaSO4。将浅盘放在恒温炉内，无光，在28℃放置3天。之后，将发育相似的幼苗放在漂浮于充满稀释的营养素溶液和EDTA的容器上的有孔平板上，7天。营养素溶液(无铁)是下列成分的混合物常量营养素1mM Ca(NO3)2·4H2O，0.9mM KNO3，0.3mMMgSO4，0.1mM KH2PO4；阳离子微量营养素2.5μM MnSO4，1μM CuSO4，10μM ZnSO4，1μM NiCl2，1μM CoSO4，115.5μM EDTANa2(超过缓冲微量营养素活性100μM)，231μM KOH；阴离子微量营养素35μM NaCl，10μM H3BO3，0.05μM Na2MoO4。每罐用0.1mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)、0.05mM KOH和2g CaCO3将pH缓冲至7.5。之后，对植物进行应激步骤，即将其放在5只桶内，每只桶含有10L无铁螯合物的营养素溶液。叶片失色表示铁黄萎病。6天后，两株植物的茎用泡沫材料缠绕到一起，放置于2L聚乙烯容器(每个盖子3个孔，每罐2株植物)内。将罐子用黑色塑料完全覆盖以避光。容器含有2L持续充气的含铁处理的营养素溶液。营养素溶液由如前所述的常量营养素和阴离子微量营养素以及阳离子微量营养素MnSO4(1μM)、CuSO4(0.5μM)、ZnSO4(0.5μM)、NiCl2(0.1μM)和CoSO4(0.1μM)组成。每隔两天加水，每周更新溶液。14天后对植物取样。分离根和叶片，先用0.1M HCl中的Tween80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)洗30秒，然后用大量的蒸馏水洗，之后称重和干燥。干消化步骤和原子吸收法后确定叶片和根中的微量营养素。在试验中，经常性地对所有叶片使用Minolta SPAD 502叶绿素含量测定仪读取SPAD读数。
使用7种不同的处理比较实施例1未添加铁。
比较实施例2Fe-o，o-EDDHA 5μM。
比较实施例3Fe-o，o-EDDHA 5μM+Fe-o，p-EDDHA 1μM。
比较实施例4Fe-o，o-EDDHA 5μM+Fe-o，p-EDDHA 2.5μM。
比较实施例5Fe-o，o-EDDHA 10μM。
实施例1Fe-o，p-EDDHA 5μM。
实施例2Fe-o，o-EDDHA 5μM+Fe-o，p-EDDHA 5μM。
每种处理四次重复。
表3.新鲜植物、新鲜和干燥叶片和新鲜和干燥根的重量。(数字是4次重复的平均值)
表4.植物各部分中的铁含量。(数字是四次重复的平均值)
表5.试验过程中由植物得到的Spad指数(第二叶的值)。四次重复的平均值。
生物实施例显示，用o，p-EDDHA的三价铁螯合物处理植物导致植物重量的显著增加，见表3中的实施例1与比较实施例1-3的对比。含1∶1的o，p-EDDHA和o，o-EDDHA的三价铁螯合物的混合物也显示植物重量增加，见表3中实施例2与比较实施例4和5的对比。试验条件下植物各部分中铁含量的增加可见表4，比较实施例1与比较实施例1-3的值，和实施例2与比较实施例4和5的值。
还有作为叶片叶绿素含量的量度的SPAD值在实施例1中比在比较实施例1-3中，或在实施例2中比在比较实施例4和5分别更急剧地显著升高。11天后实施例中的SPAD值也高于比较实施例。这些结果显示在o，p-EDDHA的三价铁螯合物的存在下，植物对铁的响应更快。
权利要求
1.一种混合物，包含异构的N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸，其中N，N’-亚乙基-(2-羟基苯基)-甘氨酸基-(4-羟基苯基)甘氨酸(o，p-EDDHA)与N，N’-亚乙基-双(2-羟基苯基)甘氨酸(o，o-EDDHA)的摩尔比大于0.8∶1。
2.含有异构的N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的混合物的金属络合物，其中N，N’-亚乙基-(2-羟基苯基)-甘氨酸基-(4-羟基苯基)甘氨酸(o，p-EDDHA)与N，N’-亚乙基-双(2-羟基苯基)甘氨酸(o，o-EDDHA)的摩尔比大于0.8∶1。
3.根据权利要求2的金属络合物，所述金属络合物是EDDHA的三价铁螯合物。
4.根据权利要求1的混合物，其中异构的o，o-与o，p-EDDHA的比率是0.9∶1至100∶1。
5.权利要求1所述混合物的制备方法，包括在三元反应中，使苯酚同时与乙二胺和乙醛酸反应，同时选择反应条件以使产生的EDDHA的异构体比率高于0.8∶1。
6.权利要求1所述混合物的制备方法，包括在第一步中使羟基苯甲醛与二氨基乙烷反应，所得醛亚胺与氢氰酸反应和水解所得中间体产生终产物的步骤。
7.权利要求1所述混合物的制备方法，包括通过在高温下改变pH值使o，o-EDDHA转化成o，p-EDDHA。
8.一种农药组合物，含有根据权利要求1-7中任一项所述的o，p-EDDHA和o，o-EDDHA混合物或其金属络合物作为活性成分。
9.根据权利要求8所述的组合物，还含有其他另外的植物营养素或植物肥料、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或其混合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，含有尿素、氧化钾、无机硝酸盐、磺酰脲或其混合物作为另外的活性成分。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的组合物，含有1-99wt％N，N’-亚乙基-双(羟基苯基)甘氨酸的三价铁螯合物，其中o，p-EDDHA与o，o-EDDHA的比率大于0.8∶1；1-20wt％尿素和0-50wt％氧化钾。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的混合物用作植物营养素或肥料的用途，或用于治疗植物黄萎病的用途。
13.治疗栽培植物中的植物黄萎病的方法，包括向植物或其种植区域施用有效量的权利要求1-11任一项所述的混合物。
全文摘要
本发明涉及新的N，N’－亚乙基－双(羟基苯基)甘氨酸的混合物，包含o，p－和o，o－异构体的混合物，其中o，p－对o，o－异构体的比率大于0.8∶1。该新混合物改善了提供作物作为植物营养素必需的基本金属螯合物的特性。就仅含N，N’－亚乙基－双(羟基苯基)甘氨酸的o，o－异构体的已知螯合剂而论，使用该新混合物，特别是改善了金属螯合物的短期供给，同时保持了长期供给。本发明还涉及异构体混合物的金属络合物，其在农业中作为植物营养素或植物肥料的组分和治疗作物中的黄萎病的用途。
文档编号C05D9/02GK1942417SQ200580011735
公开日2007年4月4日 申请日期2005年4月1日 优先权日2004年4月2日
发明者D·麦肯齐, J-J·卢塞纳, D·A·杰克逊 申请人:辛根塔参与股份公司