专利名称：：甜菊甜味剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新蛇菊苷A的含有比例比蛇菊苷高的属于甜菊品种的植物体、由该植物体和/或其干燥叶中提取的甜味剂的制备方法。本发明进一步涉及由该甜味剂制备高纯度新蛇菊苷A的方法。
背景技术：
：甜菊是原产地为南美巴拉圭的菊科多年生植物，学名甜菊(&evwrekw^2m5ertow)。甜菊含有具砂糖的300倍以上的甜味的甜味成甜菊的甜味成分已知有蛇菊苷(C38H6Q018)、新蛇菊苷A(C44H70O23)、新蛇菊苷C、D、E、杜尔可苷A(dulcosideA)等。通常栽培的甜菊品种中，上迷甜味成分中的蛇菊苷(ST)为主要成分，新蛇菊普A(RA)的含量为蛇菊香的10分之34左右，新蛇菊苷C的含量比这还少，但根据品种的不同，也有以新蛇菊苷C为主要成分的各种品种。在涩味、辣味等用舌头感知的味道中，甜味的性质非常微妙。蛇菊苷具有砂糖300倍的甜度，因此在食品工业界中作为天然甜味剂使用。其甜味与砂糖较类似，但是后味残留有苦味等令人不快的味道。因此，作为甜味剂，并不优选大量含有蛇菊苷。与此相对，新蛇菊苷A具有良好的甜味性质以及甜度为蛇菊苷的1.3倍1.5倍。需要进一步开发降低新蛇菊苦A的生产成本、保持稳定的干燥叶的收获量、高含量含有甜味性质优异的新蛇菊普A作为甜味剂原料的甜菊品种，同时保持它们的延续，以其为基础制造优异的甜味剂。本发明人等对由以往的品种反复杂交筛选，进行品种改良，得到了与蛇菊苷(ST)相比，新蛇菊苷A(RA)显示高含有比例的甜菊品种，从这些植物中提取甜味成分，制备了新蛇菊苦A的含有比例比蛇菊普高的优异的甜味剂(参照后述专利文献l-l至l-3)，但是，人们希望更进一步开发新蛇菊苷A更为稳定的含有比例更高的优异的品种。另一方面，在甜菊植物的品种改良中，确定甜菊植物的方法也有问题。作为改良的甜菊植物的识别方法，可以根据植抹高度、叶片形状等进行识别，但是甜菊有自交不亲合性，容易形成杂种，不可能只通过植林高度、叶片形状等进行识别。另外，也可通过甜菊对特有的病原菌的抗病性来比较确定，但是在甜菊中特有地表现的叶枯病、黑斑病起因于壳针孢、链格孢，这些菌是在土壤中生活的菌，如果仅凭这些症状来确定品种，由于不仅是日本，而是世界性发生，因此只凭这些特性确定品种是不够的。对于甜味成分的含量高、新蛇菊普A的含有比例比蛇菊苷高的改良品种也可以采用通过其含有比例进行确定的方法，但是由于生长期间的气象条件、收获时期等的原因，甜味成分的比例不可避免地发生变化，因此该方法也缺乏现实性。最近，还有人开发了使用引物混合物(primermbc)的RAPD法、通过DNA鉴定进行识别的方法(参照后述专利文献2),但是是否可适用于本发明的植物体的鉴定尚未明确。专利文献l:日本特开昭59-045848号公报专利文献2:日本特开昭60-16O823号公报专利文献3:日本特开昭61-202667号公报专利文献4:日本特开2003-9878号公净艮
发明内容发明所要解决的课题本发明的目的在于培育甜味成分含量和甜味成分含有比优异的品种，并为了保持其特征而通过RAPD法进行基因识别、使其与其它系统、其它品种的甜菊植物区别，由此提供甜味性质优异的甜味剂及其制备方法。解决课题的方法本发明的第一方面是相对于1重量份蛇菊苷含有4重量份以上新蛇菊普A的甜菊品种。如后所述，重复进行杂交筛选，培育了相对于1重量份蛇菊普至少含有4重量^分以上新蛇菊苷A的属于甜菊品种的新型植物体。本发明的第二方面是相对于1重量份蛇菊苦含有4重量份以上新蛇菊普A的甜味剂的制备方法，其特征在于将上述植物体或其干燥叶用水或含水溶剂进行提取。本发明的第三方面是高纯度甜味剂的制备方法，所述高纯度甜味剂是相对于1重量份蛇菊苷含有40重量份以上新蛇菊苷A,所述制备方法是将上述所得的甜味剂进行重结晶，制备相对于1重量份蛇菊香含有40重量份以上新蛇菊苷A、且它们的含量为92%以上的甜味剂。通过杂交和筛选进行品种改良中，确定所筛选的品种的方法具有重要的意义。本发明人等通过RAPD法、对通过DNA鉴定的确定方法进行了研究。发明效果本发明提供甜味性质优异的甜味剂及其制备方法。附图简述图l是守田品种、SS和SN的DNA核普序列的电泳图。箭头部分可见特征性的核苷序列。图2是守田品种和SN的DNA核苷序列的电泳图。箭头部分可见特征性的核苷序列。符号说明图1中的符号ah分别如下所述。a:HindIII标志b、e:SN品种c、f:守田品种d、g:SS品种h:lkbpDNA序列梯标志图2中的符号如下。守守田品种SN:SN品种M:DNA标志(100bp序列梯)实施发明的最佳方式本发明的识别中所使用的RAPD法(随机扩增多态性DNA法)是DNA的分析方法之一，是使用多种引物进行PCR(聚合酶链反应)，通过电泳对该扩增的DNA的图谱进行分析的方法。另外，鯨蜡基三甲基溴化铵(CTAB)是具有长链烷基的季铵碱，与核酸等聚阴离子形成不溶性的复合物，因此可用于核酸的分离。根据DNA的不同来识别品种的方法是从植物体中分离基因组DNA，除去核糖核酸(RNA)，然后使用引物混合物，通过PCR法得到PCR扩增产物，将其进行琼脂糖凝胶电泳，根据所得的DNA指紋图谱的不同进行区别。本发明的片直物体中，如后所述，可以确认在2000bp下方显示特征性的核苷序列。实际上，对于原料植物体，以选择性沉淀的基因组DNA为模板，使用例如A06(核苷序列；ACTTGGCCGAGGG)和A48(核普序列；CCGCAGGGACCA)组以及rTaq(TAKARA)作为引物，以94。C(30秒)、55。C(30秒)、72。C(120秒)进行35个循环反应，然后在72。C下扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳法确认，可通过特定的DNA条带确认植物体。甜味剂的制备中，是用水或含水有机溶剂从该植物体和/或其干燥叶中提取，接着将提取液直接浓缩，或者根据需要，用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、活性碳除去离子性杂质，使甜味成分吸附于吸附树脂上，用亲水性溶剂洗脱，将洗脱液浓缩、干燥，可得到甜味剂。甜味剂的制备方法可适当实施其它脱色等常用的纯化方法，获得高纯度新蛇菊苷A的方法可适当实施膜分离、醇提、结晶等常用方法。另外，结晶的方法是在乙醇、曱醇等有机溶剂中根据需要加入水作为结晶溶剂，适当使用。所得甜味剂可以加入其它天然、人工甜味剂，稀释剂等。以较高浓度含有新蛇菊苷A的品种的育种过程育种是通过将含有较高新蛇菊苷A的品种的杂交筛选进行，首先，将高浓度含有新蛇菊苷A的SF5-1、SF5-2(记载于日本特开平IO-271928号)进行人工杂交，由所得种子中选择TD-1(记载于日本特开2003-9878号)，再将它们进行人工杂交，由所得种子中选择对壳针孢、链格孢具有抗性的品种，分析其甜味成分，筛选相对于蛇菊苷含有4重量份以上新蛇菊苷A、甜味含量高、抗病性较为优异的植林。进一步重复确认甜味成分含量、甜味成分比例、生长发育状况，以此作为守田品种，检索其基因。申请人对于本发明的守田品种已经完成了国际保藏(保藏编号FERMBP-10353)。因此，可容易地从该保藏的守田品种的种子获得本发明的植物体。甜菊是自交不亲和性，不一定由该种子总是获得目标植物体，但是，根据本发明所记载的DNA鉴定，可以容易地进行目标物的选择。还可根据需要，与其它高品质甜菊品种(例如TD-1)进行杂交，按照后述实施例l进行篩选，可以极容易地获得高浓度含有新蛇菊普A的植物体。这些才直物体均包含在由国际保藏的品种、即守田品种的种子得到的植物体中。实施例以下，对育种过程及其特性等具体描述。本发明并不限于本育种过程、栽培方法。实施例l于1995年，在新见工厂内的大棚内，将由较高浓度含有蛇菊苷A的品种杂交获得的种子中筛选的含有新蛇菊苷A的SF-l、SF5-2品种(记载于日本特开平0-271928号)进行人工杂交，将所得种子于96年3月播种于新见工厂内的大棚内，将发芽的苗移植到育苗盆中，5月上旬，对工厂内苗圃按照每10公亩施月巴各20kg氮、磷、钾肥料成分，两周后将600林苗高8cm左右以上的苗移植入工厂内苗圃。7月上旬进行追肥r每10公亩各追肥10kg氮、磷、钾肥料成分。9月上旬进行调查，分析其甜味成分，筛选相对于蛇菊苷含有3倍以上新蛇菊香A的植林TD-1品种(记载于日本特开2003-9878号)。98年，在新见工厂内的大棚内人工杂交TD-1品种，于99年3月，将所得种子播种于新见工厂内的大棚内，将发芽的苗移植到育苗盆中，5月上旬，对工厂内苗圃按照每1(V^亩施肥各20kg氮、磷、钾肥料成分，两周后将300林苗高7cm左右以上的苗移植入工厂内苗圃。7月上旬进行追肥，每10公亩各追肥10kg氮、磷、钾肥料成分。9月上旬进行调查，分析其甜味成分，筛选相对于蛇菊普含有4重量份以上新蛇菊苷A、比植抹TD-1品种的抗病性更为优异、生长发育良好的植抹。2000年4月中旬，将它们所萌发的芽扦插100抹。5月上旬，同样地种植于工厂苗圃内，于7月末再次调查抗病性、生长发育情况，确认甜味成分比、含量是否优异，并且由2001年起经过三年均确认其抗病性、甜味成分比、甜味成分含量、干燥叶的收量优异，生长发育、成分没有变化，以此作为守田品种。守田品种、TD-1和SN的比较试验1为了对守田品种与其它品种进行比较，于2003年4月中旬，将各40林以新蛇菊苷A为主要成分的TD-1(TD)，以蛇菊苷为主要甜味成分、以新蛇菊苷A为副甜味成分的通常的甜菊品种(SN)同样地进行扦插，同样地栽种于工广苗圃。6月上旬，从上述5月上旬移植到苗圃中的200抹插条增殖的守田品种苗、以及各40林TD品种、SN苗中任意选择10抹各品种，调查是否有发病,然后将守田、TD、SN各品种自地面切取15cm，分离叶部，干燥后作为分析试样。分析结果如下所述。[表l〗<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>于7月中旬进行追肥，于9月上旬选择每种品种选择1个区域20抹，调查壳针孢、链格孢的发病状况，然后将各品种由地上部切取，分离叶部，干燥后作为分析试样。分析结果如下。[表2〗<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>守田品种的下部叶黑斑发病比例较低，甜味成分含量、干燥叶收量也比其它品种优异。TD品种与守田品种相比，壳针孢导致的下部叶黑斑较多，叶片由于壳针孢而已经开始黄变，由于壳针孢，SN品种下部叶至第3节的部分均可见壳针孢导致的黄变，地上第一节的叶片成为干枯叶。04年3月，将由守田品种发芽的穗尖扦插200林，在4月下旬移植到苗圃中，于5月末、6月末、7月末、8月末、9月末、开花后的10月末割取地上部，只分离叶片，然后干燥，测定甜味成分含量。甜味成分的测定通过高效液相色谱仪进行。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>守田品种根据生长发育期间的长短，其甜味成分含量、甜味成分比不同，随着生长发育期间的延长，甜味成分含量增加，而蛇菊苷含量可见减少倾向。开花期的10月末则可见甜味成分含量减少。基因核普序列的确定r之一)从甜味成分含量、甜味成分比、收量看，守田品种最为优异，因此通过PCR法识别守田品种。在干热灭菌的乳^^中加入约0.2g守田品种的叶片，加入液氮，用乳棒捣碎，用药匙(spatula)将约0.05g分别装入微量离心管中。加入3002%CTAB溶液(2。/。CTAB溶液(50ml):组成为IOOmMTris-HC1(pH8.0)、20mMEDTA(pH8.0)、2%CTAB、1.4MNaCl)，颠倒混合，然后将离心管转移至加热至65。C的热台上，加温30分钟。加入等量(300pl)的氯仿/异戊醇(24:l)，适度搅拌5分钟。以14000rpm离心15分钟，然后将分成两层的内容物的上层的水层转移至新的离心管中。再重复一次上述氯仿/异戊醇以后的操作，将水层转移到新的离心管中。加入400^1%CTAB溶液(10/。CTAB溶液(50ml):组成为2.5ml1MTris-HCl、1.0ml0.5MEDTA、0.5gl%CTAB)，颠倒混合15分钟，然后在室温下静置l小时，以14000rpm离心15分钟。舍去上清，加入400pl1MCsCl，吹吸液体，使沉淀完全溶解。加入900^tl100%乙醇，颠倒混合，然后在-20。C下静置20分钟，以14000pm离心15分钟。舍去上清，向沉淀中加入400^70%乙醇，以14000rpm离心15分钟，将该操作重复进行，然后舍去上清，用真空干燥机干燥沉淀，溶解于30pl的超纯水中。将溶液进行琼脂糖凝胶电泳，确认分离了DNA。为除去RNA,用500plRNase溶液(组成100]til上述DNA分离溶液、5plRNase(5g/ml))在37。C反应l小时，向反应液中等量加入PCI溶液(组成苯酚/氯仿/异戊醇、以25:24:1适度混合，然后以13000rpm离心5分钟，分离水层所得的溶液)。盖上盖，适度混合，然后以13000rpm离心5分钟。将水层(上层)转移到新的微量离心管中，等量加入在室温下保存的CIA溶液(组成氯仿/异戊醇，容量比24:1),适度混合，然后以15000rpm离心3分钟，将水层转移至新的微量离心管中，再一次进行CIA处理，加入所得上清的1/10倍量的3M乙酸钠和2.5倍量的100o/。乙醇，充分混合，然后在-20。C下冷却20分钟以上，以15000rpm离心15分钟，将DNA制成片状沉淀(pellet),舍去上清，向片状沉淀中加入lml冷却的70%乙醇，然后用15000rpm离心15分钟，舍去上清，再加入lml冷却的70%乙醇，然后以15000rpm离心15分钟，舍去上清，用减压干燥器干燥5分钟。将所得基因组DNA作为模板，按照PCR用组合物(表4)，以94。C30秒、55。C30秒、72。C120秒进行35个循环的反应，然后在72。C反应10分钟。反应后保持在4'C,得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物通过1。/。琼脂糖凝胶电泳，确认DNA条带，如图l的守田所示，大约在2000bp下方可确认特征性的DNA片断。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>同样，将以蛇菊普为主要成分、以新蛇菊苷A为副成分的SN品种(SN)和SS品种(SS)与上述同样处理，所得DNA条带如图l所示。守田品种在大约2000bp下方具有特征性的核普序列，将DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，可以容易地与其它品种进行区别。基因核苷序列的确定〖之二)使用与上述不同的引物，对守田品种和SN品种进行比较。〈DNA提取〉DNA提取按照CTAB法进行。将各约0.5g守田品种、SN品种的叶片在乳钵中用液氮冷冻，用乳棒粉碎。粉碎的样品在50mlFalcon管(塑料尖底培养管)中与20ml2%CTAB溶液(IOOmMTris-HClpH8.0、20mMEDTApH8.0、2%CTAB、1.4MNaCl、P/oPVP)混合，在65。C下温育30分钟。加入等量的氯仿/异戊醇(24:l)，搅拌10分钟，然后以3500rpm离心15分钟，将水层转移到另外的50mlFalcon管中。再加入等量的100。/。异丙醇，以3500rpm离心15分钟，用钩(hook)收集沉淀，转移至1.5ml微量离心管中。将沉淀用75%乙醇冲洗，然后使其干燥，用600inlTE缓沖液溶解。加入lplRNase溶液(lmg/ml)，在37。C下温育1小时，然后加入等量的TE饱和苯酚，混合，然后以15000rpm离心30分钟。将水层转移至另外的微量离心管中，加入1/10量的3M乙酸钠和等量的异丙醇，混合，以15000rpm离心30分钟。将所得沉淀用75%乙醇沖洗两次，然后干燥，溶解于50plTE緩冲液中，制成DNA样品。〈PCR分析〉以所得DNA样品为模板，按照以下的反应液组成进行PCR。PCR循环是在96。C反应30秒后，以96。C10秒、42。C2分钟、72。C2分钟进行35个循环，再在72匸反应4分钟。反应后，PCR产物通过1.8。/。琼脂糖凝胶电泳进行分离，EtBr染色后，在UV照射下进行拍摄。结果，在引物UBC-66中，在约2000bp附近可以确认守田品种的特异性条带。在引物UBC-72中、在约600bp附近，在UBC-106中、在约700bp附近可见SN品种的特异性条带。该结果表明，守田品种和SN品种是遗传性不同的系统，通过RAPD分析可以容易地检测出其差异。反应液组成(50pl中)10xPCR緩冲液5|iildNTP(2.0mM)5^1RAPD引物※(10mer)5pl(5|uM)BlendTaq(商标)(TOYOBO)0.5|al(2.5U/pi)甜菊DNA1fil(30ng/^il)灭菌水33.5|ilMl物使用下述UBC-66、UBC-72或UBC-106。UBC-66:GAGGGCGTGAUBC-72:GAGCACGGGAUBC-106:CGTCTGCCCG实施例2甜味剂的制备将20g于9月末得到的守W品种的干燥叶用20倍量的水提取数次，直至感觉不到甜味，将提取液过填充了20ml阳离子交换树脂(AmberliteIR-120B)的柱和填充了20ml阴离子交换树脂(DuoliteA-4)、5ml颗粒状活性碳的柱，将过柱的液体再过填充了IOOml吸附树脂(DmionHP-20)的柱，吸附甜味成分，充分水洗，然后用300ml乙醇洗脱。将洗脱液在减压下浓缩、干燥，得到淡黄白色的粉末。为了进行比较，由TD、SN进行同样处理，得到甜味成分，将其进行分析。分析方法高效液相色谱法<吏用；f主HibarLicrosorbNH25ji4mm(直径)x250mm流速1.5ml/分钟展开溶剂乙腈:水=82:18测定波长210nm表5表示提取纯化物的分析结果。表中的ST为蛇菊苷、RA为新蛇菊普A。[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>感官试验l制备由实施例2得到的守田、SN淡黄色粉末的各0.1。/。溶液，由IO名精通甜菊甜味剂甜味性质的评价人员比较其苦味、涩味、甜味性质。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>各试样中，守田品种的苦味、涩味比其它试样得到改善，甜味性质优异。感官试验2制备由实施例2得到的守田、TD淡黄色粉末的各0.1o/。溶液，由10名精通甜菊甜味剂甜味性质的评价人员比较其苦味、涩味、甜味性质。[表7]<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>各试样中，守田品种的苦味、涩味比其它试样得到改善，甜味性质优异。实施例3高纯度新蛇菊苷A甜^^木剂的制备将2g实施例2得到的提取纯化物(守田品种)在10倍量的95。/。甲醇中加热溶解，然后在4。C冷却;故置6天，分离所得晶体，用冷曱醇洗涤，然后减压干燥，得到1.2g白色晶体。为了进行比较，TD、SN同样处理，分别得到0.9g和0.6g白色晶体，对其进行分析。分析方法高效液相色i普法使用柱HibarLicrosorbNH25^4mm(直径)x250mm流速1.5ml/分钟展开溶剂乙腈:水=82:]8测定波长210nm表8表示提取纯化物的分析结果。表中的ST为蛇菊苷、RA为新蛇菊普A。[表8〗<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>感官试验3制备由实施例3得到的SN白色粉末的各0.1%溶液，由10名精通甜菊甜味剂甜味性质的评价人员比较其苦味、涩味、甜味性质。[表9]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>各试样中，守田品种的苦味、涩味比其它试样得到改善，甜味性质优异，高纯度产品的回收率也优异。感官试验4制备由实施例3得到的TD的白色粉末的各0.1%溶液，由10名精通甜菊甜味剂甜味性质的评价人员比较其苦味、涩味、甜味性质。[表IO]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>各试样中，守田品种的苦味、涩味比其它试样得到改善，甜味性质优异，高纯度产品的回收率也优异。实施例4高纯度新蛇菊苷A甜p未剂的制备将2g实施例2得到的提取纯化物(守田品种)在5倍量的75。/。甲醇中加热溶解，然后在4。C冷却放置7天，分离所得晶体，用冷曱醇洗涤,然后减压干燥，得到0.9g白色晶体，对其进行分析。[表ll]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>权利要求1.植物体，该植物体是相对于1重量份蛇菊苦至少含有4重量份以上新蛇菊苷A的甜菊(S&WareZaw力'a"a5eWom)品种，在通过RAPD法进行的DNA分析中，在2000bp下方显示特征性的核普序列。2.权利要求l的植物体，该植物体由国际保藏(保藏号FERMBP-10353)的种子获得。3.甜味剂的制备方法，其特征在于将权利要求l的植物体或其干燥叶用水或含水溶剂提取。4.甜味剂的制备方法，其特征在于将权利要求2的植物体或其干燥叶用水或含水溶剂提取。5.由按照权利要求3的方法得到的甜味剂中获得相对于1重量份蛇菊香至少含有40重量份以上新蛇菊苷A、且纯度为92%以上的高纯度新蛇菊苷A的方法。6.由按照权利要求4的方法得到的甜味剂中获得相对于1重量份蛇菊苷至少含有40重量份以上新蛇菊苷A、且纯度为92%以上的高纯度新蛇菊苷A的方法。全文摘要本发明提供相对于1重量份蛇菊苷含有4重量份以上新蛇菊苷A的甜菊品种的新型植物体，可以容易地由该植物体或其干燥叶制备质量优良的甜味剂。文档编号A01H5/00GK101146440SQ20068000713公开日2008年3月19日申请日期2006年3月2日优先权日2005年3月4日发明者守田丰重,守田幸司,驹井功一郎申请人:守田化学工业株式会社