缺血性视网膜组织的血管再生和为此目的的筛选方法

专利名称：缺血性视网膜组织的血管再生和为此目的的筛选方法
技术领域：
本发明涉及治疗—见网膜新血管疾病。更具体地，本发明涉及通过向 患者给予抑制血管生成蛋白的片段来促进视网膜血管再生的方法，还涉 及鉴别治疗— 见网膜血管疾病的治疗剂的筛选方法。
背景技术：
包括糖尿病性视网膜病、渗出型年龄相关性黄斑变性(ARMD)、早 产儿视网膜病(ROP)和血管闭塞在内的视网膜血管疾病为视力损害和失 明的主要病因。这类疾病是大量研究的焦点，这些研究旨在鉴别新的帮 助预防或改变病理性眼新血管形成的治疗方式。例如，ARMD影响到 1200万-1500万年龄超过65岁的美国人，并且由于直接影响脉络膜(视 网膜下的)新血管形成导致他们中10-15%的人视力丧失。对于年龄在65 岁以下的美国人来说，视力丧失的首要病因在于糖尿病；在美国有1600 万人为糖尿病患者，并且每年有4万人患有该疾病的眼并发症，这通常 是视网膜新血管形成的结果。尽管激光凝固法可使一小群高危险糖尿病 患者免于严重的视力丧失，但是整个10年期间视网膜病总的发病率基 本没有改变。对于由于ARMD或炎性眼病如眼组织胞浆菌病而患有脉 络膜新血管形成的患者来说，除了极个別之外，光凝固法不能有效防止 视力丧失。尽管最近开发的无创伤光动力学疗法有希望在患有之前不能 治疗的脉络膜新血管生成患者中暂时减少个体损失，但与安慰剂治疗组 45.9%相比，每3-4月治疗的患者仅61.4%具有改善的或稳定的视力。 年龄相关黄斑变性和糖尿病性视网膜病是发达国家中视力丧失的 主要病因，原因是异常的视网膜新血管形成。由于视网膜由层次分明的 神经、神经胶质和血管元件组成，相当小的干扰，如在血管增生或水胂 中所看到的那些千扰就可导致视力功能的显著丧失。遗传性视网膜变性 如色素性视网膜炎(RP)也与血管异常如小动脉狭窄和血管萎缩相关。尽 管在鉴别促进和抑制血管发生的因子方面有很大进展，但目前没有专门 治疗眼血管疾病的疗法。
遗传性视网膜变性影响到多至1/3500的个体，其特征在于进行性夜 盲、视野丧失、视神经萎缩、小动脉变细、血管渗透性改变和—见力中枢 损失，通常进展到完全失明(Heckenlively, J. R., editor, 1988; Ae//m/"' 尸《me^ava, Philadelphia: JB Lippmcott Co.)。 2于这些疾病的分子遗4专分对斤 已鉴别出110多个不同基因发生突变，而它们在已知的受影响个体中仅 占相当小的比例(Humphries " 1992, Sczewce 256:804-808; Farrar ef a/. 2002, EMBO ,/. 21:857-864.)。这些突变中很多与光转导机构中的酶和结 构性组分相关，这些组件包括视紫红质、cGMP磷酸二酯酶、ra^v外周蛋 白和RPE65。尽管有这些观察结果，但仍然没有有效的治疗来减缓或逆 转这些视网膜变性疾病的进展。基因治疗的最新进展发现，当将野生型 转基因递送到具有特定突变的动物中的光感受器或视网膜色素上皮细 胞(RPE)时，引起小鼠中rA (All d 2000, Ato. 25:306-3 IO)和W
(Takahashi e, 1999,./. K,ra/. 73:7812-7816)表型以及狗中RPE65表型 (Acland w a/. 2001, A^"f. Ge W. 28:92-95)的逆寿争。
血管发生是新血管得以形成的过程。针对特定化学信号，毛细血管 从现有的血管出芽，最终生长为生物体所需的大小。起初，衬在血管内 的内皮细胞以垂直于现有血管的方向分裂，形成实体芽。接着临近的内 皮细胞形成大空泡，并且细胞重排，以至于空泡自身尾对尾定向，最终 合并形成新毛细血管的内腔(管形成)。
血管发生受多种条件刺激，例如针对受伤发生，并且实际上伴随着 脊推动物如哺乳动物中所有组织的生长。血管发生也在诸如糖尿病性视 网膜病和某些癌症的某些疾病状态中起作用。例如，肺瘤的生长需要血 管生长以向生长的肺瘤组织提供氧和营养。
可以通过干扰刺激血管发生过程的化学信号来阻止或抑制血管生 成。例如，血管发生内皮细胞产生蛋白酶消化围绕血管的基底层，由此为新的毛细血管开出了通道。抑制这些蛋白酶或它们的形成可阻止形成 新血管。而且，内皮细胞应答化学信号而增殖。尤其重要的增殖信号包
括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族。已 证实VEGF参与某些肺瘤的血管形成。对这些增殖信号转导过程的干扰 也可抑制血管发生。
血管发生涉及几种因子。酸性和碱性成纤维细胞生长因子分子为内 皮细胞和其它细胞类型的丝裂原。血管内皮细胞的高选^奪性丝裂原为血 管内皮生长因子(VEGF)。
在正常成体中，血管发生是被严格调节的，仅限于伤口愈合、怀孕 和子宫周期。血管发生由特定的血管发生分子启动，这些分子例如为碱 性和酸性成纤维细胞生长因子(FGF)、 VEGF、血管生成因子、转化生长 因子(TGF)、胂瘤坏死因子-a(TNF-a)和血小板衍生生长因子(PDGF)。血 管发生可以被诸如干扰素-a、血小板反应素-1、制管张素和内皮抑素等 抑制性分子所遏制。正是这些天然产生的刺激剂和抑制剂的平衡控制着 正常的静态毛细血管系统。当这种平衡被打破时，如某些疾病状态中的 情况，毛细血管内皮细胞被诱导增殖、迁移并最终分化。
血管发生在包括癌症和眼新血管形成在内的多种疾病中起重要作 用。多种肿瘤的持续生长和转移也已被证实依赖于新的宿主血管应答肺 瘤衍生的血管发生因子而生长进肿瘤中。针对多种刺激剂所出现的新血 管增生为大多数眼部疾病和失明的主要后果，所述眼部疾病包括增生性 糖尿病性视网膜病、ARMD、虹膜红变性青光眼、间质性角膜炎以及早 产儿视网膜病。在这些疾病中，组织损伤可刺激释放导致毛细血管增生 的血管发生因子。VEGF在虹膜新血管形成和新生血管性视网膜病中起 支配作用。尽管报道已清楚显示了眼内VEGF水平和缺血性视网膜眼新 血管形成的相关性，但是FGF很可能起了作用。已知碱性和酸性FGF 存在于正常成人视网膜中，尽管可检测的水平并非与新血管形成始终相 关。这在很大程度上是由于FGF很牢固地结合到细胞外基质的带电组 分，可能不容易以自由可扩散的形式得到，而这种形式才可被标准的眼 内液测定法4企测到。
血管发生应答中最终的共同途径涉及增殖的血管内皮细胞和细胞 外基质之间整合素介导的信息交换。这类称为整合素的粘附受体在所有 细胞上都表达为具有a和p亚基的异二聚体。这类整合素中的一种，
avJ33，是这个家族中的最杂乱的成员，它使得内皮细胞能与各种各样的 细胞外基质组分相互作用。这种整合素的肽和抗体拮抗剂通过选择性诱 导增殖的血管内皮细胞的凋亡而抑制血管发生。存在两种细胞因子依赖
的血管发生途径，可由它们依赖的不同的血管细胞整合素avp3和av(35 来定义。具体地，碱性FGF和VEGF诱导的血管发生分別依赖于av|33 和av(35，这是由于每种整合素的抗体拮抗剂在兔角膜和鸡绒毛膜尿嚢膜 (CAM)模型中选择性阻断这些血管发生途径中的一种。阻断所有av整合 素的肽拮抗剂抑制FGF和VEGF刺激的血管发生。尽管正常人的眼血管 不显示整合素avp3或av(35,但整合素选择性地显示在患有活动性新生血 管性眼部疾病的患者组织中的血管上。尽管只有(Xv(33在患有ARMD的 患者组织中始终被观察到，但av|33和avP5二者都存在于患有增生性糖尿 病性视网膜病的患者组织中。在视网膜血管形成的小鼠模型中，全身性 给予整合素的肽拮抗剂阻断了新血管的形成。
包括猫、比格尔犬、大鼠和小鼠在内的几种动物的氧诱导视网膜病 (OIR)模型的开发大大促进了视网膜新生血管性疾病的潜在疗法试验。在 这些模型的每种中，将新生动物暴露于高氧(或交替高氧和低氧)促进视 网膜血管发生的减退或延迟，在它们返回到正常的氧水平时则有异常的 血管发生。这些模型反映了早产儿视网膜病(ROP)(—种可影响早产儿的 病理性新血管形成的病症)中发生的事件。
在过去的十年，小鼠OIR模型成为研究与氧诱导的视网膜病相关的 异常血管发生的最常用模型。这中模型中血管异常的模式与在ROP中 观察到的稍有不同；在小鼠中，在暴露于高氧后，中部、后部视网膜变 得无血管，然而在人类嬰儿中，外周视网膜无血管。尽管如此，这仍是 研究高氧诱导的^见网膜病的疾病机制和潜在疗法的被广泛接受的才莫 型，并且血管变化很一致的、可重现的和可定量的。最近几年，这种模 型的用途已被扩展到缺血性血管病变和有关的抗血管发生介入的一般 性研究，现在被广泛用在基础和应用研究领域中。
历史上，定量小鼠OIR模型中增生性新生血管性应答的通用方法是 基于对与新血管有关的细胞数进行计数，这些新血管从视网膜延伸进玻 璃体("前内界膜(ILM)核")。这是在矢状横切面中，通常在接近(但不 包括)视神经盘中进行的。这种方法非常费力、耗时，并且伴随着一些困 难，包括需要将异常血管的细胞与玻璃体中的玻璃体血管的细胞区分
开。因为， 一般而言，每30连续切片中只有一个被评价，所以大部分 的组织没有被定量，有可能导致大的取样误差。此外，由于整个眼被立 即切片，这妨碍了对该模型中的另一重要参数(即，与异常新血管丛的形
成同时发生的血管闭塞的程度和网膜新血管形成的速率)的同眼评
估。该参数最好在视网膜的整装制片中评估。
因此，现在正需要治疗视网膜新生血管性疾病以及在整个一见网膜中 评价这类治疗的疗效的方法。本发明的方法满足了这些需要。

发明内容
本发明提供了促进缺血性视网膜组织生理性血管再生的治疗方 法。该方法包括向患有视网膜缺血的哺乳动物给予治疗有效量的色氨酰
-tRNA合成酶(TrpRS)的血管生成抑制性片段，由此在促进视网膜损伤区 域的有益的生理性血管再生的同时抑制视网膜的病理性新血管生成。在 优选的实施方案中，TrpRS的血管生成抑制性片段为T2片段。优选地， 所述哺乳动物为患有视网膜缺血的人类患者。
本发明的治疗方法可用于治疗*夹血性眼病和新血管眼病，包括缺血 性视网膜病，如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病等等。
本发明的另 一方面涉及鉴别和评^N台疗浮见网膜新血管疾病的潜在 治疗剂的疗效的筛选方法。该方法包括将新生小鼠、优选约7日龄小鼠 暴露于高氧达足以诱导视网膜血管系统发生可测量退化的一段时间，优 选约5天，随后使该小鼠回到常氧。在回到常氧后，接着以潜在的治疗 剂向该小鼠的眼给药。优选在回到常氧后约5天，从处理过的眼分离整 个视网膜。还从同 一小鼠或暴露于相同水平的高氧相同时长的同龄小鼠 的对照眼分离基本上整个视网膜。该对照眼优选已以缓冲液或盐水溶液 替换潜在治疗剂给药。对处理视网膜和对照视网膜的血管进行染色，以 便于鉴别和显示。
获得基本上整个染色的视网膜的显微照像图像，以显示高氧导致的 血管闭塞面积和在回到常氧后形成的视网膜前新血管丛面积。接着分析 显微照像图像以评估高氧条件导致的血管闭塞面积并评估回到常氧后 发生的病理性新血管生成的程度。通过比较经处理的眼和对照眼中血管 闭塞面积以及比较经处理的眼和对照眼中S见网膜前新血管丛面积来评 价潜在治疗剂的有效性。病理性新血管生成的程度通过比较经处理的眼和对照眼中显现一见网膜新血管丛的—见网膜区域来证实。 一见网膜前新血管 丛面积的减小表明具有血管生成抑制活性，即该试剂可抑制病理性新血 管生成。通过比较经处理的眼和对照眼中血管闭塞面积来进行血管再生 的评估。经处理的眼相对于对照血管闭塞面积的减少表明治疗剂诱导了 损伤视网膜的有益的生理性血管再生。
附图简要说明


图1显示了来自新生小鼠经染色的整个视网膜的显微照像拼接照
片，图解出生后9日龄(P9)至22日龄(P22)小鼠眼中血管的正常发育。 插图A、 B和C分別图解通过用FITC-葡聚糖染色观察到的P9、 P18和 P22时的血管。插图D、 E和F分别图解通过用凝集素GS染色观察到的 P9、 P18和P22时的血管。
图2显示了显微照像拼接照片和图，图解在P7至P12的时间段暴 露于高氧的新生小鼠中的视网膜血管系统的发育。插图A、 B和C为显 微照片，显示了血管闭塞面积。插图D(上图)为视网膜面积随年龄的变 化图。插图D(下图)为血管闭塞面积随年龄的变化图。插图E为显示左 眼视网膜面积与右眼视网膜面积相关性的散点图。插图F是左眼血管闭 塞面积与右眼血管闭塞面积相关性的散点图。插图G是显示观察者之间 低差异的柱状图，由4名观察者采用本发明的筛选方法对在不同年龄分 离得到的6个不同视网膜的血管闭塞面积进行测量。
图3显示了显微照片和图，图解在P7至P12的时间段暴露于高氧 的新生小鼠中视网膜前新血管丛的发育。插图A-F为显微照片，其中插 图A的相片显示视网膜前新血管丛(明亮的部分)。插图B显示插图A的 相片，其中血管丛为红色。插图C显示新血管丛区域仅是部分灌注的， 与下面的血管系统连接的血管丛显示为绿色。插图D显示异凝集素GS 染色的细胞主要为CD31 P日性的(绿色)，表明为血管细胞系。插图E显 示CD31阳性新血管丛中存在一些巨噬细胞细胞系的细胞(绿色)。插图G 显示新血管丛面积随年龄的变化图。插图H显示右眼和左眼新血管丛面 积的相关性。插图I是柱状图，图解根据本发明的篩选方法确定新血管 丛面积时观察者之间的低差异性。插图J显示通过本发明筛选方法以及 通过费力的测量ILM前细胞核的现有^黄切切片方法测量的血管丛面积 之间的相关性。
图4显示显微照片和图，图解根据本发明的筛选方法，对在P7至
P12的时间段暴露于高氧的新生小鼠中血管闭塞面积和视网膜前新血管 丛面积的定量。插图A:(右上照片)显示根据本发明筛选方法暴露于高 氧的对照小鼠眼的血管闭塞面积；(上部中间图像)显示对照小鼠眼新血 管丛面积(红色)；(左上图像)为对照视网膜的横切切片，显示ILM前细 胞核(箭头)。插图B:(右下照片)显示根据本发明筛选方法暴露于高氧和 经iNOS抑制剂处理的小鼠眼血管闭塞面积；(下部中间照片)显示经处 理的小鼠眼的新血管丛面积；(左下照片)为显示ILM前细胞核(箭头)的 经处理的视网膜的横切切片。插图B:(左图)比较对照眼和经iNOS处理 的眼的血管闭塞面积；(中图)比较对照眼和经iNOS处理的眼的新血管 丛面积；(右图)比较了对照眼和经iNOS处理的眼的ILM前细胞核的数
图5显示显微照片和图，图解根据本发明的筛选方法，对TrpRS的 血管生成抑制性片段对在P7至P12的时间段暴露于高氧的新生小鼠中 血管闭塞和新生血管丛形成的改善作用的定量情况。插图A为比较在本 发明筛选方法中以不同剂量T2-TrpRS处理的眼与经类似剂量的全长 TrpRS处理的眼的新血管丛面积的图。插图B为比较在本发明筛选方法 中以不同剂量T2-TrpRS处理的眼与经类似剂量的全长TrpRS处理的眼 的血管闭塞面积的图。插图C和D图解经T2-TrpRS处理的眼(C)与经 PBS緩冲液处理的对照眼(D)相比血管闭塞面积的减少。插图E图解相 对于对照目艮(下图)T2-TrpRS诱导的的加速的血管再生(上图)。插图F图 解VEGF适体引起血管闭塞面积血管化的延迟。插图G和H为本发明筛 选方法中比较T2-TrpRS和VEGF适体活性的图。
图6显示T2-TrpRS (SEQ ID NO: l)和突变体T2-TrpRS-GD(SEQ ID NO: 2)的氨基酸残基序列。
图7显示小TrpRS (mim-TrpRS)的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)。
图8显示T1-T卬RS的氨基酸残基序列(SEQIDNO: 4)。
优选实施方案的详细i兌明
促进缺血性视网膜组织有益的生理性血管再生的方法包括向患有 视网膜缺血的哺乳动物给予治疗有效量的色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS) 的血管生成抑制性片段，由此在促进视网膜损伤区域的生理性血管再生
的同时抑制了病理性新血管生成。优选地，该TrpRS片段通过玻璃体内 注射而向眼内给药。
TrpRS的优选的血管生成抑制性片段包括T2片段(T2-TrpRS; SEQ IDNO:l,图6)、 T2-TrpRS的突变体(T2画TrpRS-GD; SEQIDNO:2,图 6)、称为小TrpRS的截短的TrpRS (SEQ ID NO: 3,图7)和Tl-TrpRS (SEQ ID NO: 4,图8)。 T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 2)的氨基酸残基序列与SEQ ID NO: 1的不同在于两个氨基酸残基的置换(即S121G和Y122D)。更优 选地，TrpRS的血管生成抑制性片段为T2片段。
本发明的另 一 方面是评价治疗视网膜新血管疾病的推定治疗剂的 疗效的筛选方法。该方法利用氧诱导的视网膜病小鼠模型来模拟小鼠眼 的视网膜病病状。该方法包括将新生小鼠(优选约7日龄)暴露于高氧(例 如，75%氧气氛)达足以诱导视网膜血管发生可测量退化的一段时间，优 选约5天，随后将小鼠返回到常氧(即正常空气)。在返回到常氧后，接 着以潜在的治疗剂向每只小鼠的眼给药。优选地，向各小鼠的一只眼给 予治疗剂，而向另一只眼给予给予安慰剂如盐水或緩冲液作为对照。或 者， 一些小鼠可用作对照而另一些用潜在治疗剂处理。优选在返回到常 氧后约5天分离来自经处理小鼠和对照小鼠的整个视网膜，将它们的血 管染色以方便鉴定。
获得基本上整个染色的视网膜的显微照像图像，并进行分析以评价 由高氧条件导致的血管闭塞面积并评价在返回到常氧后发生的病理性 新血管生成的程度。潜在治疗剂的功效通过比较经处理的眼和对照眼的 血管闭塞面积和/或比较经处理的眼和对照眼浮见网膜前新血管丛面积来 进行评估。
鉴别和评价治疗视网膜新血管疾病的潜在治疗剂的疗效的优选筛 选方法包括，使新生小鼠暴露于高氧达足以诱导视网膜血管发生可测量 退化的一段时间，并使所述小鼠返回到常氧。接着，以推定治疗剂溶液 向小鼠的眼给药。在至多约5天之后，对小鼠实施安乐死，从给予所述 推定治疗剂的眼中取出基本上整个视网膜。对视网膜的血管染色，将基 本上整个染色视网膜显微照像以观察视网膜的血管。从图像中至少确定 (a)染色视网膜中可观察到的血管闭塞面积和(b)染色视网膜中视网膜前 新血管丛面积之一。然后，进行以下二者中的至少一种比较(i)将在上 述染色视网膜中可观察的血管闭塞面积与小鼠对照眼的染色视网膜中
可观察的血管闭塞面积进行比较，所述小鼠暴露于相同高氧条件但没有
被给予推定治疗剂；和(b)将上述染色视网膜中的视网膜前新血管丛面积
与小鼠对照眼的染色视网膜中的视网膜前血管丛面积进行比较，所述小 鼠暴露于相同高氧条件但没有被给予推定治疗剂。
鉴别和评价治疗视网膜新血管疾病的潜在治疗剂的疗效的优选筛
选方法包4舌
将7日龄新生小鼠暴露于含有约75%氧的气氛中约5天(高氧条
件)；
使小鼠返回到正常空气气氛(常氧)；
在返回到正常空气后，以潜在治疗剂向小鼠的一只眼给药； 使小鼠安乐死并从给予所述推定治疗剂的眼中取出基本上整个视 网膜；
对给予了推定治疗剂的眼的视网膜血管进行染色；
制备基本上整个染色的视网膜的至少 一 幅显微图像以观察其血
管；
从所述至少 一 幅显微图像确定染色视网膜中可观察到的血管闭塞 面积和染色浮见网膜中的-见网膜前新血管丛面积；
将在上述染色视网膜中可观察的血管闭塞面积与小鼠对照眼的染 色视网膜中可观察的血管闭塞面积进行比较，所述小鼠暴露于相同高氧 条件但没有被给予推定治疗剂；以及
将上述染色视网膜中的视网膜前新血管丛面积与小鼠对照眼的染 色视网膜中可观察到的视网膜前血管丛面积进行比较，所述小鼠暴露于 相同高氧条件但没有被给予推定治疗剂。
病理性新血管生成的程度由在显微图^象中观察到的经处理的眼相 对于对照眼展现出视网膜前新血管丛的视网膜面积作为依据。视网膜前 新血管丛面积的减少表明具有血管生成抑制活性，即所述试剂抑制了病 理性新血管生成。对血管再生的评价由比较经处理的眼和对照眼的浮见网 膜中的血管闭塞面积来进行。经处理的眼相对于对照眼的视网膜中血管 闭塞面积的减少表明治疗剂诱导损伤的视网膜发生了有益的生理性血 管再生。
包含血管生成抑制性TrpRS片段的治疗组合物可包括药理学上合 适的、药物上可接受的载体、赋形剂和运载体。通常，这些载体包括水
或醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和緩冲介质如磷酸盐緩冲盐水 (PBS)。胃肠外运载体可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯 化钠、乳酸林格氏或不挥发油。此外，静脉内运载体可包括流体和营养 补充剂以及电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些电解质补充剂。 也可存在诸如防腐剂和其它添加剂的l武形剂，如抗孩i生物剂、抗氧化
齐寸、螯合剂以及惰斗生气体。在We附&g/ow '《尸/zarw"cew"C(2/ 14th
Ed., Mack Publishing Co., 1970,尤其是VIII部分，"Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture",第1461-1762页/>开了适合的制剂 助剂、载体、其它的赋形剂以及配制药物组合物的方法，在此将相关公 开内容通过参考加以并入。
所述治疗组合物可包装在适合的无菌并瓦或小瓶中，既可为多剂量形 式也可为单位剂量形式。所述容器优选在填充了本发明的组合物后被紧 密密封。优选地，所述组合物被包装在贴有标签的容器中，所述标签表 明存在于组合物中的药物，并带有政府机构如美国食品和药品管理局规 定形式的公告(反映该组合物得到相关法律的批准、剂量信息等)。该标 签优选含有有关该组合物的信息，这有利于卫生保健人员以该组合物向 患者给药。该包装也优选含有印刷的与组合物的给药、指导、适应症以 及任何需要告知的内容有关的信息资料。
氧诱导的视网膜病(OIR)模型
研究中所有动物操作都遵照人道和使用动物的严格操作指南进 4亍。4安照Smith e/"/. /m^". (9/^/2"/mo/. 1994; 35:101-111描述的
方案诱导OIR。将7日龄小鼠崽和它们的母亲从室内空气转移到约75% 氧的高氧环境5天，随后返回到室内空气中(常氧)。通过将动物笼子放 入经改装的人类嬰儿保育箱中来完成暴露于高氧条件。使氧流通穿过保 育箱(采用动物麻醉机控制流量)，通过FDA许可的氧分析仪(AX-300, Teledyne Analytical Instruments, CA, USA)监测和维持74-75%的氧7& 平。在5天的高氧过程中，每天检查所述动物至少三次。在整个实验中， 母亲可不受限制地获得食品和水。5天后，即出生后的第12天(P12), 将笼子返回到室内空气。
视网膜整装制片和免疫组织化学
使小鼠安乐死之后，将摘除的眼在含4%多聚曱醛的PBS中固定约 10分钟，通过在角膜缘(limbus)后接近虹膜根处进行环形切割而分割视 网膜，然后取出眼的前部。将晶状体和玻璃体切除，将视网膜与巩膜和 脉络膜层分开，这使视网膜为眼杯形。在视网膜中进行径向松弛切割使 其变平，并且从变平的视网膜小心地除去玻璃体的任何残留物。
对于FITC-葡聚糖血管造影术，通过腹膜内注射Ketamme HC1 (Ketalar, Parke Davis, UK, 100mg/kg)连同松弛剂赛拉。秦(2mg/kg)使动物 麻醉。将大约300 pl的高分子量(2 x 106 Da) FITC-葡聚糖(浓度50mg/ml, Sigma, St. Louis, MO)注射进左心室，让其循环约2分钟，然后使动物安 乐死并摘除眼。为了进行异凝集素G4染色，将视网膜在4%多聚曱醛中 后固定约45分钟，并在室温下与来自O^om" w'm/ /z"/o/z"的异凝集素 G4-旧4 (异凝集素GS)卵孚育过夜，所述G4-IB4被缀合到Alexa Fluor 59 4 (Molecular Probes,在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中1:150稀释)以得到"异凝集 素GS-594"。在2小时的时间段内用PBS洗涤4-5次后，用SLOW FADE (Molecular Probes)将视网膜以整装制片形式固定于载玻片上用于后来的 照像。
由于异凝集素GS不仅会对血管内皮细胞染色，也会活化鼠类巨噬 细胞，因此在一部分视网膜中使用内皮标志物CD31特异性多克隆抗体 (BD Biosciences-Pharmmgen,在10。/o胎牛血清(FBS)/100/。 NGS缓冲液中 1:100稀释)和针对巨噬细胞标志物F4/80的抗体(1:150)，以进一步表征 异凝集素GS阳性细胞。视网膜用含20。/。FBS、 20%NGS的PBS在室温 下封闭1小时并与第一抗体和异凝集素GS-594終育过夜。如上所述， 在用PBS洗涤后，加入Alexa 488缀合的第二抗体(Invitrogen Corporation)作用2小时，洗涤并固定视网膜。
照《象和定量
采用带有分辨率为512 x 512像素的检测器的4x物镜进行显微照 像。采用共聚焦显微镜(BioRad)特別小心地刚好聚焦于视网膜内界膜之 上，以使得筛板前新血管丛比下面的浅层血管丛更突出，使随后的新血 管丛定量更容易。大部分情况下，从每个视网膜获得四个重叠的照片(每 个表示一见网膜的四分之一)。然后采用Adobe PHOTOSHOP 6.0，通过 使用视网膜界标如视神经盘和大血管排列照片来形成拼接照片。这些拼
接的照片使得能观察整个视网膜并对其定量。在闭塞区域和所有的新血 管形成区域都位于视网膜中心的少数情况下，获得集中于视神经盘的单 一4X照片。尽管外周视网膜并未全部包括在这些照片中，但这些情况
下完全可看到有关的OIR诱导的变化。每张单独的照片被转化为2x2 英寸大小(每英寸分辨率为300象素)，然后形成拼接照片并对闭塞面 积和新血管丛面积进行定量。
在产生照片和创建视网膜拼接照片之后，由个体通过盲法方案对血 管闭塞和异常新血管形成进行定量以排除偏见，并在需要时在显微镜下 观察真实的 一见网膜以帮助确定照片中真实的闭塞面积和新血管丛面
积。为了测量血管闭塞面积，使用了 Adobe PHOTOSHOP⑧的徒手选择 工具。扫描无血管区域的边界，计算以像素表示的所有闭塞面积。测量 新血管丛面积也在视网膜整装制片的构造中进行，并以异凝集素在这些 区域中的更高强度染色、它们的特征性外观和通过聚焦于视网膜内界膜 之上而产生的照片为基础。使用Adobe PHOTOSHOP⑧软件中的魔棒工 具通过手工专门选择新生血管丛。接着确定以像素表示的总面积。若所 测量的面积以像素表示，则应用一转换因子，对于我们的参数来说，它 被计算出是27.8，V像素，由此得到绝对面积(pm2)。这个转换因子是基 于图像采集(4x放大镜头)和在Adobe PHOTOSHOP⑧软件中输入和创建 拼接照片时的拼接照片组合参数如大小(2x2英寸)和分辨率(每英寸300 像素)而计算得到的。
视网膜横切和前内界膜细胞核计数
在其中的6只眼中，在对整装制片的构造进行定量之后，将视网膜 从载玻片取出并进行横切和前内界膜细胞核计数。在4% PFA中再次固 定后，将视网膜包埋在石蜡中并将其整体连续切片。进行标准的H&E 染色，并对存在于ILM玻璃体侧(vitreal side)的所有细胞核计数。计算 每个切片细胞核的平均数。在另一组用iNOS抑制剂(见下文)处理的眼 中，将整个眼包埋在石蜡中，横切，用H&E染色，并对横切的样品计 数，如Smith "a/.以前所述。鉴定出^L神经，将其每一侧的2-4张切片(间 隔30-90 )Lim)进行新血管生成计数。
注射血管生成抑制性化合物
对于单次注射处理，在P12天(返回到常氧后)进行玻璃体内注射， 或对于两次注射处理，在P13和P16天进行玻璃体内注射。每种情况中，
采用配有33号针头的Hamilton注射器注射0.5 pL体积的适合溶液(PBS 对照、含有各治疗剂的PBS溶液或含有组合治疗剂的PBS溶液)。注射 在赤道部和角膜缘之间进行。注射时，通过解剖显微镜观察针头的位 置，以保证其位于玻璃体腔内，由此尽可能减少视网膜或晶状体损伤的 几率。注射后，使眼睑复位以关闭裂隙。
结果
小鼠出生后视网膜血管发育的正常过程被很好地表征，该过程包括 出生时自视神经盘出现的浅层血管的向心生长以及在大约9-11天后达 到视网膜的远端边缘。接近出生后的第一周结束时，短血管开始从这个 浅层网络向下生长以形成深层网络，这通常在约P11-12时完成。接着， 形成最后的中间层血管(IL)。该过程伴随有改型和修剪波动，基本上在 约P21-23完成。在新生的C57B16/J小鼠中，暴露于高水平的氧显著地 改变了这种有序的事件顺序。在P7和P12之间暴露于75%氧后，在视 网膜中心有大面积的血管网络退化(血管闭塞)，仅留下大血管并且基本 上没有毛细血管网络。这可在P9眼的葡聚糖灌注(
图1，插图A)和异凝 集素染色(
图1,插图D)整装制片中看到。异凝集素阳性的巨噬细胞也存 在于血管闭塞区域中(
图1,插图D以及图2，插图C)。外周视网膜还显 示了主要由浅层血管构成的血管网络的迹象(图2，插图C)。在P12天返 回到常氧后，血管化不足的视网膜中相对缺血的状态促进了浅层血管从 外周向内再生，同时伴随有形成深层血管的视网膜内的血管出芽以及在
视网膜和玻璃体交界处(视网膜前血管丛)的异常出芽。到约Pis时，血
管闭塞区域较小，围绕视神经盘和沿大视网膜动脉延伸(
图1,插图B和 E),视网膜前血管丛表现为明亮染色的凝集素阳性区(
图1，插图E,图 3，插图A)。重要的是，注意到在用荧光染料(这种情况下为葡聚糖 FITC),灌注一见网膜血管后，血管闭塞区域明显被明显地勾画出，而血 管丛不容易鉴别(比较图]，插图B和插图E)。到约P22-23时，视网膜 通常几乎都发生了血管再生(图l,插图C和插图F)并且几乎可分辨出血 管丛，尽管还要几天它才会表现出完全正常的外观。
实施例1定量血管闭塞的面积和视网膜血管再生的速率
为了定量血管闭塞面积和视网膜血管再生速率，采用荧光显微镜以 低放大倍数对注射了葡聚糖的或异凝集素染色的视网膜整装制片照
像。4个重叠的照片用于构建视网膜的拼接照片(图2，插图A)，采用易
于获得的计算机照片处理程序测量闭塞面积(黄色)以及总的视网膜(蓝
色线)面积(图2，插图B)。由于有血管和无血管的视网膜之间的边界在 这些制片中通常是很确定的，因此观察者之间的差异非常小(图2,插图 G)。小心地不要将存在有切割或固定人为瑕疯区域包括进该分析区域 中。总的视网膜面积随时间的变化显示在图2的上部插图D中。视网膜 的生长似乎在高氧期间持续，总的视网膜面积在P8和P13之间生长了 大约20%。随后，该变化速率减小。血管闭塞和血管再生的时程(图2， 插图D，下图)显示闭塞在P7暴露于高氧后快速出现，并在P8-P12之间 占总一见网膜面积的约30-35%。返回到常氧后的血管再生以较慢的速率 出现，广泛的新血管生成在约P16 (返回到常氧后第四天)开始。这个过 程相当对称，这通过两侧眼(即同一只动物的眼)之间的总视网膜面积 的高相关性(图2，插图E)尤其是血管闭塞的程度(图2,插图F)得以证 实。优选地，在实施本发明的方法中使用对侧眼对照。
实施例2.定量异常新血管生成的程度
在P15和P22之间，尤其是从P17-P19开始，在小鼠OIR才莫型的祸j 网膜和玻璃体界面处出现异常血管生长。这些视网膜前血管丛在视网膜 的血管化外周区域和闭塞中心区域的交界处尤其明显。通过对伸向内界 膜(ILM)玻璃体侧的细胞的核进行计数，这些错误导向的血管元件通常 在H&E染色、石蜡包埋的横切切片中被定量。但是，由于细胞群覆盖 于浅层血管网络之上，因此这些区域也可在异凝集素染色的整装制片照 相中清楚可见(
图1插图E，图3插图A)。采用强度阈工具(在多种商 品化照片分析程序中可获得)，或Adobe PHOTOSHOP⑧软件手工选择 一见网膜前血管丛形成区域，这些强烈染色的异凝集素阳性区域的面积可 被方便地测量(图3，插图B，新血管区域标为红色)。共聚焦协助弄清 这些细胞的位置以及它们与下面的视网膜血管的关系(图3,插图C)。 值得注意的是，通过这些增生区域内静脉内注射的葡聚糖-FITC的绿色 斑点可知，这些区域仅仅是被部分灌注的(图3，插图C)。这种有限的
灌注水平妨碍了采用葡聚糖-FITC血管造影术来充分地观察和定量血管 丛。细胞特异性的标志物显示血管丛中大部分的异凝集素阳性细胞表达
内皮标志物CD31,证实了它们的血管特征(图3,插图D)。值得关注的 是，如F4/80免疫染色所示，巨噬细胞系的细胞也存在于细胞团中(图3, 插图E)。
异常血管化的程度和时程被显示在图3,插图G中。在P16-P加之 间，大约12-16%的总视网膜面积被新血管丛所覆盖，在P17达到顶峰。 重要的是，注意到这些血管丛在P15-P22之间出现连续和快速的改型。 紧随伴随有改型的视网膜血管再生后，改型的面积也减小。早期看到的 相对较大的伸出的细胞群(图3，插图A-E)被修剪至异凝集素阳性细胞 行，这些细胞群通常沿着视网膜血管分布(图3，插图F)并最终在P22_P25 之间消失(
图1，插图F)。
尽管两侧眼之间在血管丛形成方面的相关性不如在血管闭塞方面 的相关性那样好，但它仍然基本上是对称的过程(图3,插图H)。不管所 研究的时间点以及外观血管形成的程度如何，观察者之间的差异也很低 (图3，插图I),这证实了本发明定量方法的一致性和清晰性。最后，为 了检测在整装制片中测量的新血管面积是否与横切切片中的ILM前(即 视网膜前)细胞核计数相关，将之前定量过的整个固定的视网膜包埋在石 蜡中，横切并在所有切片中对ILM前细胞核计数。图2插图J显示6 只不同眼的每一 只中的血管丛面积之比和细胞核计数之比，所述血管丛 面积和细胞核计数被归一化为每个参数的均值。显然，这两种定量方法 总体是一致的(即，具有较大血管丛面积的眼倾向于也具有较大的细胞核
计数，反之亦然)。但是，本发明方法的定量方案优于横切计数的方法， 原因在于整个视网膜被同时评估。
实施例3. iNOS抑制剂的血管生成抑制性作用
通过检测新的血管生成抑制剂——抑制剂iNOS——对视网膜血管 再生和血管生成抑制的影响，本发明定量技术的应用被进一步评估，并 和现有技术中的ILM前细胞核计数进行比较。通过每天一次腹膜内注 射，在P12-P17之间向小鼠眼递送抑制剂(或对照盐水)，在P17摘除眼， 并用所述两技术之一进行定量。图4插图A显示P17对照小鼠(上排)和 iNOS抑制剂处理的动物(下排)的视网膜的整装制片和横切切片。左边插
图中绘出了血管闭塞区域(蓝色线)，中间插图中在同一整装制片上标出 了的新血管丛面积(红色)，以及IL M前细核的实例显示在右边的才黄切 切片中(箭头)。与对照相比，注射lNOS抑制剂将血管闭塞面积减少了
约28%(图4,插图B,左侧柱)。从整装制片上定量得到的新血管丛面 积减少了约30% (中间柱)，这与在横切切片中对ILM前细胞核计数时观 察到的作用强度(即，约36%,右下图)相当。
实施例4. T2-TrpRS有效地抑制了 OIR才莫型中的新血管丛形成
T2-T卬RS为色氨酸tRNA合成酶(TrpRS)的蛋白水解平片段，它被 证实在几种血管生成模型(包括小鼠Matrigel模型和新生小鼠视网膜血 管生成模型)中具有有效的抑制血管生成潜能。将本发明的方法用于测试 T2-TrpRS对小鼠OIR模型中病理性新血管生成的作用。采用本发明的 定量方法，还评估了氧诱导的血管闭塞之后T2-TrpRS注射对浅层视网 膜血管丛的血管再生的影响。当在P12即小鼠刚从高氧(75% 02)返回到 常氧时进行玻璃体内注射时，T2-T卬RS以剂量依赖的方式显著地减少了 P17时新血管丛形成的面积(图5)。全长色氨酸tRNA合成酶(FL-TrpRS) 也在最高剂量时表现出一些活性，当与等量注射的T2-TrpRS相比时， 观察到显著较低水平的抑制作用。由于之前FL-TrpRS被发现在其它血 管生成模型中没有抑制血管生成的活性，因此观察的活性有可能是由于 体内注射后FL-TrpRS天然切割为类似于T2-TrpRS的产物所引起的。
还在对照和T2-TrpRS处理过的视网膜中对闭塞区域进行了定量以 分析在氧诱导的闭塞之后对视网膜的生理性血管再生的影响(图5,插图 B)。尽管T2-TrpRS有效地抑制了新血管丛形成，但没有抑制正常的浅 层和深层视网膜血管丛的血管再生。事实上，即使是在低剂量下， T2-TrpRS注射过的碎见网膜也始终显示出显箸乂#强的血管再生。在 T2-TrpRS注射过的视网膜中，与P]7 PBS对照注射的视网膜中闭塞面积 相比，P17时闭塞面积始终减少约40% (图5，插图B)。注射时(P12) 闭塞面积基本相等(数据未示出)。因此，在P17时闭塞面积的显著和料 想不到的减少暗示了 T2-TrpRS具有在抑制病理性新血管形成的同时促 进生理性血管再生的新活性。在注射1.25 mg/眼T2-TrpRS后，视网膜的 血管形态看起来几乎正常，特別是与正常或对照注射的OIR视网膜相比 (图5，插图C-E)。甚至在P22,当新血管丛自然退化并且视网膜愈合时，当与P17 T2-TrpRS注射的视网膜相比时，对照OIR视网膜中的新血管 看起来极其异常(图5,插图E)。注射了 FL-TrpRS的视网膜也证实血管 再生过程显著增强，但仅是在高剂量时。
将T2-TrpRS在OIR模型中的活性直接与被证明为VEGF165活性的 拮抗剂VEGF适体的活性进行比较，并且已证实可有效抑制OIR诱导的 新血管丛形成。两种血管生成抑制性分子都为新血管丛形成的有效抑制 剂。与VEGF适体处理的一见网膜相比，注射了 1.25 mg/眼T2-TrpRS的 眼表现新血管丛面积的轻微但显著的减少。由此，甚至在注射低于所述 适体IO倍摩尔浓度后，T2-TrpRS仍然在OIR模型中显示出对新血管丛 形成有高度竟争性的抑制活性。与T2-TrpRS不同，VEGF适体不增强浅 层血管丛的血管再生。实际上，尽管VEGF适体不抑制生理性血管再生 的发生，但血管再生始终滞后于对照运载体(PBS)注射的视网膜(图5， 插图F-G)。在进行两次单独的低剂量注射之后，VEGF适体处理过的眼 的这种血管再生过程的滞后在P19天更为明显(图5,插图H)。
讨论
目前所接受的定量OIR模型中异常新血管生成的方法基于对H&E 染色、石蜡包埋的眼的组织学横切切片中筛板前细胞核的计数。这种方 法及其费时耗力，相当不稳定并且依赖于观察人员，并且，由于不产生 整装制片，它也妨碍了在同一眼中对血管闭塞程度的精确定量。尽管以 前报道了采用整装制片分析法来分析无血管区域，但据我们所知，本发 明的方法是可用于在同 一眼分析中定量新血管丛形成和闭塞的绝对面 积的第 一 个筛选方法。本发明的方法采用常规的组织切片和染色方法以 及容易获得的计算机程序，使其容易被掌握，具有较低的观察者间差 异。此外，因为整个视网膜而非有限数量的切片被定量，这种新方法也 具有减少取样误差的优点。在现有技术的横切切片方法中，将和玻璃体 系统有关的玻璃体细胞核与和新血管丛有关的那些玻璃体细胞核区分 开也是有困难的，尤其是在玻璃体系统持续存在的OIR模型中。在本方 法中，在切割过程中通常去除了玻璃体血管，并且任何保留的残余物可 容易地从分析中鉴别出并排除。
本发明的筛选方法用于评估T2-TrpRS在病理性血管生成的OIR模 型中的血管生成抑制性活性。观察到T2-TrpRS对OIR才莫型中病理性新
血管生成具有强的、剂量依赖性血管生成抑制性影响。注射约1.25 pg/
眼的T2-TrpRS导致对新血管丛形成的基本完全抑制。^见察到的这些效 果即使不高于VEGF适体的效果，也与之相当，其中所述VEGF适体为 另一种OIR模型中有效的病理性新血管形成抑制剂。通过在两次注射较 低剂量的抑制剂后在P19时分析视网膜新血管生成来评估对OIR有关的 新血管生成的长期影响。T2-TrpRS抑制了病理性新血管生成并将血管丛 形成减少了75%以上，而在用VEGF适体(OJmg/眼/注射，519皮摩尔) 处理后仅减少55%。
令人惊讶地，T2-TrpRS还可促进氧诱导的视网膜病后有益的生理性 血管再生过程。尽管闭塞面积在注射时相等，但在经T入TrpRS处理的 —见网膜中闭塞面积始终相对于对照一见网膜减少一半。因此，T2-TrpRS 处理引起令人惊讶地更快和更完全的视网膜愈合，并且获得的血管在解 剖学上更接近正常的视网膜血管。
在不偏离本发明新特征的精神和范围情况下，可对上述实施方案进
行多种改变和修饰。本文描述的具体实施方案并非旨在或被推断为是进 行限制。
权利要求
1.一种促进缺血性视网膜组织有益的生理性血管再生的方法，所述方法包括向患有视网膜缺血的哺乳动物给予治疗有效量的色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)的血管生成抑制性片段，所述有效量足以抑制病理性新血管生成和促进所述视网膜缺血性区域的生理性血管再生。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述TrpRS的血管生成抑制性 片段为T2-TrpRS (SEQ ID NO: 1)。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述TrpRS的血管生成抑制性 片段为T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 2)。
4. 如权利要求1所述的方法，其中所述TrpRS的血管生成抑制性 片段为小-TrpRS (SEQ ID NO: 3)。
5. 如权利要求1所述的方法，其中所述TrpRS的血管生成抑制性 片段为Tl-TrpRS (SEQ ID NO: 4)。
6. —种鉴别和评价治疗视网膜新血管疾病的潜在治疗剂的疗效的 筛选方法，所述方法包括使新生小鼠暴露于高氧达足以诱导视网膜血管系统发生可测量退 化的一^a时间；使所述小鼠返回到常氧；在返回到常氧后，以推定的治疗剂向所述小鼠的眼给药； 在向所述眼给予所述推定治疗剂后多至约5天后，使所述小鼠安乐死；从给予了所述推定治疗剂的安乐死小鼠眼中取出基本上整个视网膜；对给予了所述推定治疗剂的所述视网膜的所述血管系统染色； 制备所述视网膜的染色的血管系统的至少 一 幅显微图像，观察所述 至少一幅图像中血管闭塞面积和视网膜前新血管丛面积；并进行下列比较中的至少一种(a)将在所述染色视网膜中可观察的所 述血管闭塞面积与小鼠的对照眼的染色浮见网膜中可观察的血管闭塞面 积进行比较，其中所述小鼠暴露于相同高氧条件但所述对照眼并没有被 给予所述推定治疗剂；和(b)将所述染色视网膜中的所述视网膜前新生血 管丛面积与小鼠的对照眼的染色视网膜中可观察的视网膜前血管丛面 积进行比较，其中所述小鼠暴露于相同高氧条件但所述对照眼并没有被 给予所述推定治疗剂。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述新生小鼠在首次暴露于高氧时为约7日龄。
8. 如权利要求6所述的方法，其中所述新生小鼠暴露于高氧约5天。
9. 如权利要求6所述的方法，其中通过将所述小鼠置于含有约75%氧的气氛中而使所述小鼠暴露于高氧。
10. 如权利要求6所述的方法，其中所述小鼠的一只眼被给予所述 推定治疗剂，而另 一只眼被给予非治疗性溶液作为对照。
11. 一种鉴别和评价治疗视网膜新血管疾病的潜在治疗剂的疗效的 筛选方法，所述方法包4舌使7日龄新生小鼠暴露于含有约75%氧的气氛中约5天(高氧条件)；使所述小鼠返回到正常空气气氛(常氧)； 在返回到正常空气后，以潜在治疗剂向所述小鼠的眼给药； 使所述小鼠安乐死并从给予所述推定治疗剂的所述眼中取出基本 上整个视网膜；对给予了所述推定治疗剂的所述眼的所述视网膜血管系统进行染色；制备基本上整个染色的所述视网膜的至少一幅显微图像，所述至少 一幅图像显示所述染色一见网膜中血管闭塞面积和视网膜前新生血管丛 面积；从所述至少一幅图<象确定所述染色碎见网膜中可观察的血管闭塞面 积和所述染色视网膜中的视网膜前新血管丛面积；将在所述染色视网膜中可观察的血管闭塞面积与小鼠对照眼的染 色视网膜中可观察的血管闭塞面积进行比较，所述小鼠暴露于相同高氧 条件但所述对照眼并没有被给予所述推定治疗剂；并将所述染色视网膜中的视网膜前新血管丛面积与小鼠对照眼的染 色视网膜中可观察到的视网膜前血管丛面积进行比较，所述小鼠暴露于 相同高氧条件但所述对照眼并没有被给予所述推定治疗剂。
12. 如权利要求]1所述的方法，其中所述对照眼和被给予了所述推 定治疗剂的所述眼来自同一只小鼠。
全文摘要
本发明提供了一种促进缺血性视网膜组织有益的生理性血管再生的治疗方法。所述方法包括向患有视网膜血管缺血的哺乳动物给予治疗有效量的色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)的血管生成抑制性片段，由此在促进视网膜损伤区域有益的生理性血管再生的同时抑制病理性新血管生成。在一个优选的实施方案中，TrpRS的血管生成抑制性片段为T2-TrpRS或T2-TrpRS-GD。优选地，所述哺乳动物为患有视网膜缺血的人。还公开了一种鉴别和评价治疗视网膜新血管疾病的治疗剂的筛选方法。
文档编号A01N37/18GK101179935SQ200680013849
公开日2008年5月14日 申请日期2006年2月24日 优先权日2005年2月24日
发明者E·巴宁, E·阿吉拉, M·弗里兰德 申请人:斯克里普斯研究学院