专利名称：：一种新型微生物饲料添加剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属于微生物饲料添加剂
技术领域：
，特别涉及一种新型微生物饲料添加剂及其制备方法，该微生物饲料添加剂中所用的微生物能将亚油酸转化为共轭亚油酸。技术背景抗生素作为饲料添加剂使用已有50年的历史，为动物的生长和健康做出了巨大贡献，但同时又给人类健康和词料业的发展带来了许多潜在的威胁，主要表现在动物病原菌产生抗药性，导致抗生素用量的增加，引起内源性感染和二重感染。特别是长期使用会造成消化道内本身微生态失调和环境的污染。同时，抗生素在产品中的残留还直接影响人类的免疫和健康。词料微生物添加剂因具有安全、环保、无副作用和抗病、促生长等特点，受到世界各国科学家和动物饲养者的广泛认同和青睐。在提倡"绿色、安全、健康、营养"的今天，开发和生产微生物绿色词料添加剂，具有重要的现实、生态和经济意义。目前，各国用于微生物饲料添加剂的菌种主要分六类(1)芽孢杆菌类，主要有枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等；(2)乳酸菌类，主要有嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、粪链球菌等；(3)酵母类，主要有啤酒酵母、石油假丝酵母等；(4)优杆菌类，产乳酸；(5)拟杆菌类，主要有嗜淀粉拟杆菌、多毛拟杆菌、栖瘤胃拟杆菌、产琥珀酸拟杆菌等；(6)其它类，主要有黑曲霉、米曲霉和噬菌蛭弧菌等。美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种共42种；日本公布的用于微生物的菌种大约26种左右；我国则以芽孢杆菌、乳酸杆菌研制为主，产品多为单一菌剂和复合菌剂。我国在1993年公布了6种微生物饲料添加剂的菌种，1999年增加到12种，2003年增加到15种，2006年农业部658公告对微生物饲料添加剂菌种进行了调整，批准16种菌种可用于微生物饲料添加剂，包括地衣芽孢杆菌*，枯草芽孢杆菌，两歧双歧杆菌*，粪肠球菌，屎肠球菌，乳酸肠球菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，乳酸乳杆菌'，植物乳杆菌，乳酸片球菌，戊糖片球菌产朊假丝酵母，酿酒酵母，沼泽红假单胞菌和保加利亚乳杆菌、其中，枯草芽孢杆菌限产抗生素的菌株，地衣芽孢菌、两歧双歧杆菌、乳酸乳杆菌和戊糖片球菌需办理新饲料添加剂证书饲料。共轭亚油酸是一类由亚油酸衍生的共轭双烯酸的多种位置和几何异构体的总称。研究表明，共轭亚油酸具有以下诸多功能(1)具有抗癌作用，科学家通过对实验的老鼠进行研究发现共轭亚油酸能养活致癌物引起的皮肤癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和胸腺癌的发病率；(2)能诱导生物体内能量利用，参与脂肪分解与新陈代谢，使体内脂肪显著养活同时增加肌肉组织、水分和灰分的含量，起到减肥的作用；(3)具有高效的抗氧化性，可以作为抗氧化剂添加进食品中，防止食品的氧化和霉菌的产生，且无毒副作用，性质相对比较稳定；(4)能显著降低血液中总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇的水平，具有抗动脉硬化和抗血栓的性质；(5)共轭亚油酸能促进细胞分裂，阻止肌肉退化，延缓肌体免疫力的衰退，并抑制肿瘤的产生；(6)可提高生物体某些生理状态，如提高体内维生素A的水平及防止糖尿病的进一步发展。随着研究的深入，共轭亚油酸诸多的生物学功能相继被发现，并逐渐应用到动物保健和饲料中。在词料领域共轭亚油酸具有以下功能(1)提高饲料报酬，增加瘦肉率；(2)提高肉产品品质；(3)提高动物生产性能；(4)增强机体免疫力。目前多采用直接将共轭亚油酸添加到饲料当中，但共轭亚油酸的获得主要从动植物中提取或采用化学合成的方法，其工艺复杂，又不够成熟，因此共轭亚油酸的销售价格居高不，对拓展动物保健和饲料应用领域十分不利。本发明采用一些特定的微生物，这些微生物能将亚油酸转化为共轭亚油酸，通过发酵及一定的后处理工艺，将微生物制成饲料添加剂，使其在畜禽肠道中生存繁殖，从而实现将亚油酸转化为共轭亚油酸的目的。本发明解决了直接添加共轭亚油酸造成的费用高的问题。且本发明采用的微生物包含在2006年农业部658公告批准的16种微生物当中。
发明内容本发明的目的在于利用能将亚油酸转化为共轭亚油酸的植物乳杆菌、粪肠球菌制成饲料添加剂，解决直接添加共轭亚油酸造成的费用高的问题。采用液体深层高密度发酵技术和一系列的后处理加工工艺实现本发明。本发明提供一种新型微生物词料添加剂，其特征是该添加剂中含有将亚油酸转化为共轭亚油酸的微生物。其中，所述的将亚油酸转化为共轭亚油酸的微生物是植物乳杆菌(丄0fCo6acz7/w51尸/a"ton/附)、粪肠球菌(五w&racoccws/aecafc);添力卩齐U中植物乳杆菌与粪肠球菌菌种的质量配比为从1:100至100:1。本发明提供了一种新型微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于制备工艺如下将亚油酸转化为共轭亚油酸的微生物一一物乳杆菌与粪肠球菌深层发酵培养，制备发酵液，再采用后处理工艺制成微生物饲料添加剂。所述的微生物深层发酵培养，制备发酵液，包括如下的步骤-1)斜面活化将植物乳杆菌，粪肠球菌菌种分别转接茄子瓶斜面培养基上，于37i:培养20h，使其处于对数中后期；所述的斜面培养基为MRS(g/L):葡萄糖20;胰蛋白胨10;牛肉膏10;酵母提取物5;柠檬酸二铵2;磷酸氢二钾2;MgS047H200.58;MnS04*4H200.25;吐温801mL;琼脂20。配制方法将MgS04'7H20，MnS04*4H20，葡萄糖以及吐温80以外的各成分溶解，冷至5(TC，以醋酸调节pH值为6.0-6.5，而后加入MgS047H20，MnS044H20，最后加葡萄糖和吐温80。在121。C，高压灭菌20min。2)菌悬液的制备将培养至对数中后期的种子分别用无菌水洗下，制成108CFU/mL的菌悬液。3)发酵液的制备将步骤2)得到的植物乳杆菌，粪肠球菌菌悬液，分别以5~10%的体积比接种到装有3035L发酵培养液的50L发酵罐中，在3237。C培养28~32h,搅拌转速为10(M50rpm，通气量为l~2vols/vol/min，控制初始pH值为6.5。所述的发酵液配方和步骤1)中斜面培养基相同。本发明提供一种新型微生物词料添加剂的制备方法，其特征在于后处理工艺采用以下几种方法进行微囊包被喷雾干燥法，冻干制剂法。下面分别描述各个后处理方法的工艺。1)微囊包被喷雾干燥法将检验合格的发酵液离心浓縮，得到的菌体作为芯材，采用肠溶性材料作为壁材，包括玉米蛋白，黄原胶，吐温-80和司盘-80作为乳化剂，乳化剂用量为1%10%，均质压力为3070MPa。进料温度为2060°C;进口温度为110200°C，出口温度为4580°C。2)冻干制剂法将检验合格的发酵液离心浓縮，得到菌体。采用脱脂牛奶和蔗糖为稳定剂，脱脂牛奶蔗糖稳定剂的组成为1L脱脂牛奶中加入20400克蔗糖，菌体与稳定剂的混合比例为h1030，冷冻干燥条件选择-6040。C的温度范围和0.10.4毫巴的真空度范围，其中，预冻阶段的温度范围为-20-6(TC，预冻时间为16小时；升华千燥阶段的真空度范围为0.10.4毫巴，升华干燥阶段的时间为1650小时，在这一时间范围内将预冻温度逐渐升温至常温状态。本发明的有益效果在于其解决了直接添加共轭亚油酸造成的费用高的问题，同时通过本发明的技术方案，其制备微生物饲料添加剂的方法所用的菌株能使亚油酸转化为共轭亚油酸，使其应用在饲料领域具有以下功能(1)提高饲料报酬，增加痩肉率；(2)提高肉产品品质；(3)提高动物生产性能；(4)增强机体免疫力。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。具体实施方式实施例1植物乳杆菌、粪肠球菌菌种发酵液中共轭亚油酸的检测方法如下1)液体活化将植物乳杆菌、粪肠球菌种分别接种于MRS液体培养基，37'C静止培养20h，使其处于对数中后期；所述的MRS液体培养基(g/L):葡萄糖20;胰蛋白胨10;牛肉膏10;酵母提取物5;柠檬酸二铵2;磷酸氢二钾2;MgS04.7H2O0.58;MnS04*4H2O0.25;吐温80lmL。配制方法将MgS04*7H20，MnS04*4H20，葡萄糖以及吐温80以外的各成分溶解，冷至50'C，以醋酸调节pH值为6.0-6.5，而后加入MgS047H20，MnS044H20，最后加葡萄糖和吐温80。在121'C，高压灭菌20min。2)液体发酵及其共轭亚油酸的测定将1)的种子液按照1%的接种量接种于添加0.5mg/ml亚油酸的MRS培养基中，37"静止培养24h，发酵液用异丙醇、正己烷提取，甲酯化后用气相色谱法测定共轭亚油酸生成量。植物乳杆菌发酵液中检测到共轭亚油酸112.30ug/ml，其构象c9，tll-18:2，粪肠球菌发酵液中检测到共轭亚油酸130.25ug/ml，其构象为c10，tl2-18:2。实施例2用50L发酵罐进行植物乳杆菌、粪肠球菌的液体深层高密度发酵，步骤如下1)斜面活化将植物乳杆菌，粪肠球菌菌种分别转接茄子瓶斜面培养基上，于37"C培养20h，使其处于对数中后期；所述的斜面培养基为MRS(g/L):葡萄糖20;胰蛋白胨10;牛肉膏10;酵母提取物5;拧檬酸二铵2;磷酸氢二钾2;MgS047H200.58;MnS04*4H200.25;吐温801mL;琼脂20。配制方法将MgS047H20,MnS044H20,葡萄糖以及吐温80以外的各成分溶解，冷至5(TC，以醋酸调节pH值为6.0~6.5，而后加入MgS047H20，MnS04'4H20，最后加葡萄糖和吐温80。在12厂C，高压灭菌20min。2)菌悬液的制备将培养至对数中后期的种子分别用无菌水洗下，制成108CFU/mL的菌悬液。3)发酵液的制备将步骤2)得到的植物乳杆菌，粪肠球菌菌悬液，分别以5~10%的体积比接种到装有30~35L发酵培养液的50L发酵罐中，在37'C培养28~32h,搅拌转速为10(M50rpm，通气量为卜2vols/vol/min，控制初始pH值为6.5。所述的发酵液配方和步骤1)中斜面培养基相同。实施例3采用喷雾干燥法进行后处理。将检验合格的发酵液离心浓縮，得到的菌体作为芯材，采用海藻酸钠作为壁材，吐温-80和司盘-80作为乳化剂，乳化剂用量为1%，均质压力为30MPa,进料温度为2(TC;进口温度为110'C，出口温度为45'C。最后进行质量检验，合格后进行包装，入库。实施例4采用喷雾干燥法进行后处理。将检验合格的发酵液离心浓縮，得到的菌体作为芯材，采用海藻酸钠作为壁材，吐温-80和司盘-80作为乳化剂，乳化剂用量为10%，均质压力为70MPa，进料温度为60'C;进口温度为20(TC，出口温度为80'C。最后进行质量检验，合格后进行包装，入库。实施例5采用喷雾干燥法进行后处理。将检验合格的发酵液离心浓缩，得到的菌体作为芯材，采用海藻酸钠作为壁材，吐温-80和司盘-80作为乳化剂，乳化剂用量为5%，均质压力为50MPa，进料温度为45'C;进口温度为15(TC，出口温度为6(TC。最后进行质量检验，合格后进行包装，入库。实施例6采用冻干制剂法进行后处理。将检验合格的发酵液离心浓縮，得到菌体，冻干制剂法采用脱脂牛奶和蔗糖为稳定剂，脱脂牛奶蔗糖稳定剂的组成为1L脱脂牛奶中加入20克蔗糖，菌体与稳定剂的混合比例为1:10,将冻干混合液置于冷冻干燥器中，在-2(TC条件下进行预冻1小时，然后在0.1毫巴真空度条件下进行冷冻干燥，首先在1个小时内使温度上升到0'C，在0t:状态下保持2个小时，然后在13个小时内是温度逐渐上升到4(TC，获得菌种的冻干制剂。最后进行质量检验，合格后进行包装，入库。实施例7采用冻干制剂法进行后处理。将检验合格的发酵液离心浓縮，得到菌体。采用冻干制剂法进行后处理。冻干制剂法采用脱脂牛奶和蔗糖为稳定剂，脱脂牛奶蔗糖稳定剂的组成为1L脱脂牛奶中加入400克蔗糖，菌体与稳定剂的混合比例为h30，将冻干混合液置于冷冻干燥器中，在-60'C条件下进行预冻6小时，然后在0.4毫巴真空度条件下进行冷冻干燥，首先在1个小时内使温度上升到0'C，在0'C状态下保持2个小时，然后在47个小时内使温度逐渐上升到4(TC，获得菌种的冻干制剂。最后进行质量检验，合格后进行包装，入库。实施例8采用冻干制剂法进行后处理。将检验合格的发酵液离心浓縮，得到菌体，采用冻干制剂法进行后处理。冻干制剂法采用脱脂牛奶和蔗糖为稳定剂，脱脂牛奶蔗糖稳定剂的组成为1L脱脂牛奶中加入300克蔗糖，菌体与稳定剂的混合比例为1:20，将冻干混合液置于冷冻干燥器中，在-40'C条件下进行预冻4小时，然后在0.2毫巴真空度条件下进行冷冻干燥，首先在l个小时内使温度上升到Ot:,在0'C状态下保持2个小时，然后在25个小时内使温度逐渐上升到4(TC，获得菌种的冻千制剂。最后进行质量检验，合格后进行包装，入库。实施例9植物乳杆菌粪肠球菌葡萄糖的配比为h1:18，采用效率高的双轴高效卧式搅拌机，搅拌时间控制为90s，获得新型微生物饲料添加剂产品。最后进行质量检验，合格后进行包装，入库。实施例10本发明的微生物饲料添加剂的动物喂养功效选择同批的杜X长X大三元杂保育出栏健康活泼小猪60头，根据体重及性别比例相近的原则，将小猪分为A、B两个组，其中A组为对照组，设2个重复，B组为试验组，设2个重复，每组12头，公母各半，分头编号；A组词喂常规玉米一豆粕型日粮不添加微生物饲料添加剂，B组在A组基础日粮的基础上添加0.1%的本发明的微生物饲料添加剂。饲喂30d。表l、试验猪日粮配方及营养水平(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>赖氨酸0.880.88蛋氨酸+胱氨酸0.570.57成本核算(元/T)_1789.00_1794.40预混料大北农仔猪预混料s511，各组所用预混料均相同。日增重为846.05g，试验组平均日增重比对照组提高45.62%，料肉比为1.66，比对照组降低了30.3%,腹泻率为3.45%,比对照组降低了54%，具体试验结果表2、3、4，饲喂结果表明，本发明产品能够提供仔猪对粗词料的消化率和利用率，明显增加日增重，降低料肉比，提供饲料报酬，增加经济效益，提高动物生产性能，增强机体免疫力。表2、各试验组猪只体重及增重<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3、各试验组猪只的料肉比情况<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4、小猪腹泻头日数及腹泻率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一种新型微生物饲料添加剂，其特征是该添加剂中含有将亚油酸转化为共轭亚油酸的微生物。2.如权利要求1所述的新型微生物饲料添加剂，其特征在于所述将亚油酸转化为共轭亚油酸的微生物是植物乳杆菌(Z^"o6flc/〃MsP/fl"ton/m)、粪肠球菌(五"/eracocc^/aeo/")。3.如权利要求2所述的新型微生物饲料添加剂，其特征在于添加剂中植物乳杆菌与粪肠球菌菌种的质量配比为从1:100至100:1。4.一种新型微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于制备工艺如下将亚油酸转化为共轭亚油酸的微生物_一植物乳杆菌与粪肠球菌深层发酵培养，制备发酵液，再采用后处理工艺制成微生物饲料添加剂。5.如权利要求4所述的新型微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述微生物深层发酵培养，制备发酵液，包括如下的步骤1)斜面活化将植物乳杆菌，粪肠球菌菌种分别转接茄子瓶斜面培养基上，于37'C培养20h，使其处于对数中后期；所述的斜面培养基为MRS(g/L):葡萄糖20;胰蛋白胨10;牛肉膏10;酵母提取物5;柠檬酸二铵2;磷酸氢二钾2;MgS047H200.58;MnS04'4H200.25;吐温801mL;琼脂20。配制方法将MgS04*7H20，MnS04*4H20，葡萄糖以及吐温80以外的各成分溶解，冷至5(TC，以醋酸调节pH值为6.0-6.5，而后加入MgS047H20，MnS044H20，最后加葡萄糖和吐温80。在121。C，高压灭菌20min。2)菌悬液的制备将培养至对数中后期的种子分别用无菌水洗下，制成108CFU/mL的菌悬液。3)发酵液的制备将步骤2)得到的植物乳杆菌，粪肠球菌菌悬液，分别以5~10%的体积比接种到装有3035L发酵培养液的50L发酵罐中，在3237'C培养28~32h，搅拌转速为100150rpm，通气量为l~2vols/vol/min，控制初始pH值为6.5。所述的发酵液配方和步骤1)中斜面培养基相同。6.如权利要求4所述的新型微生物词料添加剂的制备方法，其特征在于后处理工艺采用以下几种方法进行微囊包被喷雾干燥法，冻干制剂法。7.如权利要求6中所述的新型微生物词料添加剂的制备方法，其特征在于所述的微囊包被喷雾干燥法将如权利要求5中所述菌株的发酵液经检验合格后离心浓缩，得到的菌体作为芯材，采用肠溶性材料为壁材，包括玉米蛋白，黄原胶，吐温-80和司盘-80作为乳化剂，乳化剂用量为1%10%，均质压力为3070MPa，进料温度为2060°C;进口温度为110200°C，出口温度为4580°C。8.如权利要求6中所述的新型微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的冻干制剂法将如权利要求5中所述菌株的发酵液经检验合格后离心浓縮，得到菌体，采用脱脂牛奶和蔗糖为稳定剂，脱脂牛奶蔗糖稳定剂的组成为1L脱脂牛奶中加入20400克蔗糖，菌体与稳定剂的混合比例为l:1030，冷冻干燥条件选择-604(TC的温度范围和0.10.4毫巴的真空度范围，其中，预冻阶段的温度范围为-20-6(TC，预冻时间为16小时；升华干燥阶段的真空度范围为0.10.4毫巴，升华干燥阶段的时间为1650小时，在这一时间范围内将预冻温度逐渐升温至常温状态。全文摘要本发明涉及一种新型微生物饲料添加剂，具体地说是涉及含有产生共轭亚油酸菌株的微生物饲料添加剂及其制备方法，属于微生物饲料添加剂
技术领域：
。该微生物饲料添加剂为将植物乳杆菌，粪肠球菌，分别进行液体深层高密度发酵培养的发酵液，采用微囊包被喷雾干燥法，冻干制剂法制成粉剂。该微生物饲料添加剂能在畜禽的肠道中将亚油酸转化为共轭亚油酸，起到促进畜禽的生长性能、降低脂肪、增加瘦肉率、调节免疫反应等作用，也解决了饲料中直接添加共轭亚油酸造成的费用高的问题。且由该方法制备的微生物饲料添加剂活菌含量高、产品保存时间长、杂菌污染少。文档编号A23K1/00GK101278702SQ200710065159公开日2008年10月8日申请日期2007年4月5日优先权日2007年4月5日发明者孙占敏,宋维平,张玳华,云莫,赵雁青申请人:北京大北农科技集团有限责任公司