氮限制适应性基因和蛋白质及其调节的制作方法

专利名称：：氮限制适应性基因和蛋白质及其调节的制作方法
技术领域：
：本发明涉及通过调节植物细胞中RING型遍在蛋白化连接酶的表达，调节植物农学性状的方法。本发明尤其涉及改进植物中氮利用的方法。本发明还涉及从拟南芥(Arabidopsisthaliana)中分离的包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质介导氮限制适应性(nitrogenlimitationadaptibility)并最终能够调节对氮限制的应答，包括氮再循环、花色素苷产生、糖转移和降低的光合作用。
背景技术：
：对作物植物农学特征的改良从农业开始就一直在进行。大部分适合作物生产的土地目前已被使用。因为人口持续增长，所以会需要改良的作物品种以充分地提供全世界的食物和饲料(Trewavas(2001)PlantPhysiol.125:174-179)。为了避免灾难性的饥荒和营养不良，未来的作物栽培种将需要使用等量的农业投入获得改进的产量。这些栽培种将需要更有效地抵抗不利条件如干旱、土壤盐碱化或疾病，当贫瘠的土地进行耕种时这会是特别重要的。最后，将期望获得下述栽培种，其具有改变的营养组成以增强人和动物营养并使得能够进行有效的食物和伺料加工。对所有这些性状而言，鉴定控制目的性状表型表达的基因对于通过常规或转基因手段加速优良作物种质的开发是决定性的。可获得大量高效的方法来帮助鉴定在农学重要性状的表达中起关键作用的基因。这些包括遗传学、基因组学、生物信息学和功能基因组学。遗传学是遗传机制的科学研究。通过鉴定改变目的途径或应答的突变，经典遗传学(或正向遗传学)能够帮助鉴定涉及这些途径或应答的基因。例如，对疾病具有增加的易感性的突变体可鉴定从病原体识别通向疾病抗性的植物信号转导途径的重要组件。遗传学也是通过育种改良种质的中心组件。通过遗传杂交的分子和表型分析，控制目的性状的基因座可以被绘图并在随后的世代中被跟踪。获知作物增加物(accession)之间表型变异下潜在的基因可使得能够开发下述标记物，所述标记物大幅提高种质改良方法的效率，并且打开了发现其他优良等位基因的通道。基因组学是对生物基因组的系统水平研究，所述生物基因组包括基因和相应的基因产物——RNA和蛋白质。在初级水平上，基因组方法提供了来自不同植物物种序列信息的巨大数据集，包括模式植物物种拟南芥的全长和部分cDNA序列和全基因组序列。最近，也可以获得作物植物基因组稻(Oryzasativa)基因组的最初序列草案(drafts叫uence)。全基因组序列的可用性使得可能开发在系统水平上研究其他分子互补物的工具，如阵列和芯片，其用于测定生物在特定条件下表达的基因的互补物。这些数据可被用作某些基因在不同植物表型的表达中起关键作用的潜能的最初指示。生物信息学方法与初级水平的基因组数据集直接结合，允许通过注解(annotative)或其他手段处理以揭示目的序列。使用例如相似性搜索、比对和种系发生分析，生物信息学通常可鉴定目的基因产物的同源物(homolog)。非常类似的同源物(例如在蛋白质全长上具有>卯％的氨基酸同一性)非常可能是直向同源物，即在不同的生物中具有同样的功能。功能基因组学可被定义为对基因及其产物的功能指定。功能基因组学从遗传学、基因组学和生物信息学中得到鉴定下述基因的途径，所述基因在具体的目的途径或应答中是重要的。表达分析例如使用高密度DNA微阵列(长来自基因组规模的生物测序)在单次实验中监测数千基因的mRNA表达。实验处理可包括引发目的应答的处理，所述目的应答例如用病原体感染的植物中的疾病抗性应答。为了给出微阵列用途的额外实例，可在一段发育时程内的不同组织中或在受目的应答影响的突变体中监测mRNA表达水平。蛋白组学也可通过在单次实验中检验数百个蛋白质的表达和翻译后修饰来帮助指定功能。蛋白组学方法在许多情况下与在微阵列实验中采取的监测mRNA表达的方法类似。蛋白质-蛋白质相互作用也可通过鉴定与途径或应答的已知组件相互作用的蛋白质，帮助将蛋白质指定至给定的途径或应答。对于功能基因组学而言，通常使用大^Mt酵母双杂交实验研究蛋白质-蛋白质相互作用。指定基因功能的另一方法是在异源宿主例如细菌大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达相应的蛋白质，然后进行纯化和酶检验。目的基因控制给定性状的能力的证实可来自例如在目的植物物种中的实验IHE。转基因植物目的基因的产生和分析可用于植物功能基因组学，这具有若干优点。基因通常可被超量表达和低表达(underexpressed)("敲除")，从而增加观察到下述表型的机会，所述表型将该基因与目的途径或应答联系在一起。转基因功能基因组学的两个方面有助于给予通过该途径的功能指定以高置信度水平。首先，在生活植物的背景下进行表型观察。其次，可以检查观察到的表型范围并与观察到的引入的转基因表达水平相关联。转基因功能基因组学在改良栽培种的开发中特别有价值。只有下述基因作为作物改良成就的候选基因被促进，所述基因在目的途径或应答中发挥作用并且能够另外赋予以期望的性状为基础的表型。在一些情况下，针对功能基因组学研究开发的转基因林系可在产品开发的初期直接使用。朝向植物功能基因组学的另一途径首先鉴定在特定目的基因中具有突变的植物林系，然后在所研究的性状上对这类基因敲除的结果进行表型评价。这样的途径揭示了特定性状表达必需的基因。通过功能基因组学鉴定的基因可在如上所述通过转基因手段改良种质的努力中直接使用，或被用于开发在作图和繁殖种群中鉴定目的等位基因踪迹的标记物。获知这类基因也可使得能够通过大量分子方法中的任意方法来构建自然中不存在的优良等位基因。在过去80年中，行栽作物(rowcrop)中产量的快速增加在大致相等的程度上归因于改进的遗传学和改进的农学实践。具体地，在作物如玉米中，高产杂种和大量氮肥^f吏用的組合在理想的条件下允许大于蒲式耳/英亩(bu/acre)的产量。然而，大量氮肥的使用具有负面的副作用，主要在于增加的该农民投入成本和增加的环境成本，因为硝酸盐污染是在许多农业地区显著促成淡水和海洋环境退化的主要问题。通过理解基因型对氮使用的作用来开发更有效利用氮的作物遗传学在降低生产者投入成本以及环境负荷中会是高度有利的。这对使用高水平氮肥栽培的作物如玉米而言尤其重要。氮使用效率可以以若干种方式定义，尽管最简单的是产量/应用的N。该方法中存在两个阶段首先，被吸收、储存和同化为氨基酸和其他重要含氮化合物的可获得的氮量；其次，被分配至种子而导致最终产量的氮比例。已对多种农业上重要的作物进行了多种产量研究以研究该问题(Lawlorl)W等，2001在LeaPJ，Morot-GaudryJF，编著PlantNitrogen.Berlin:Springer曙Verlag343-367;LafitteHR和EdmeadesGO1994FieldCropsRes39，15-25;LawlorDW2002JExpBot.53，773-87;MollRH等，1982AgronJ74,562-564)。这些实验已证明存在氮使用效率的遗传组件，但就确定何种基因对该过程是重要的而言，尚未证明这些实验是令人满意的。另外，玉米种植者一般不把在有限的氮肥下维持产量作为目标。这些类型的对氮使用的产量研究就多种使得实验难以解释的原因而言是困难的，所述原因包括在测试大田(testfield)中或在任何处理制度下的大田位点(fieldsites)之间缺乏可得氮的均一性，和其他环境因素的互相影响。在植物中，氮涉及两种作用。首先，氮作为必需的常量营养物影响植物生物量和作物产量(LamHM等，(1996)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.47，569-593)。其次，作为重要的信号，氮调节涉及氮和碳代谢的许多基因的表达(Crawford醒(1995)PlantCell7，859-868;StittM(1999)Curr.Opin.PlantBiol.2，178-186)，并调节植物发育如根分枝和发育、叶生长、茎分枝和开花时间(CrawfordNM&FordeBG(2002)。为了达到最优的生长和发育，植物必须从土壤中获得足够的氮营养物，所述足够的氮量取决于植物物种和发育阶段而在植物干重的2%和5%之间变化(Marschner，1995)。然而，因为土壤中的氮含量频繁地被许多无生物因素和生物因素降低，所以植物频繁地经受氮限制的生长条件，所述因素如土ii壤4曼蚀、雨水淋洗和微生物消耗(Good等，2004)。因此，氮限制适应性(adaptability)对植物而言是在氮可利用度受限时成功地完成其生命周期以产生后代而不是过早死亡并不育的重要的存活策略。在作物植物中，已发现该氮限制适应性与其产量正相关。Tollenaar和Wu(1999)报道了在过去数十年中提高玉米栽培种对氮限制的耐受显著地有助于玉米产量的遗传改良。许多研究已证明在氮限制生长条件下生长时，与较老的杂种相比，较新释放的玉米杂种能够更有活力地生长并产生更高的产量，这表明较新的玉米杂种比较老的玉米杂种具有更强的氮限制适应性(Castleberry等，1984;Duvick，1984，1997;McCullough等，1994;Ding等，2005)。这提示增加玉米栽培种对氮限制的适应性能够提高作物产量并可能允许降低所需的氮肥量。增加作物栽培种的氮限制适应性对目前的农业实践而言是重要的，所述实践中大量的氮肥被施用给作物以提高其产量(Frink等，1999)，且其中多于5()%被施用的氮营养物从作物-土壤体系中损失(Peoples等，1995)。因此，大量氮肥的使用必然提高作物生产的成本，并且也导致显著的氮污染水平(Good等，2004)。开发对氮限制具有增加的适应性的栽培种可4吏得可能降低所述成本同时维持作物产量并减少生产农业对环境的影响(Ding等，2005)。植物适应氮限制生长条件的分子^4']尚未#:详细描绘，并且尚未系统性地研究特异地涉及植物对氮限制适应的生理学和生物化学因素。然而，已经进行了关于氮胁迫对植物生长和发育的影响的大量研究，从中可推断出一些期望的植物氮限制适应性应答。这些应答包括生长和光合作用的降^f氐、氮从老的成熟器官到活性生长器官的再转移，和大量花色素苷的累积(Khamis等，19卯；Geiger等，1999;Ding等，2005;Mei和Thimann，1984;()no等，1996;Bongue-Bartelsman和Phillops，1995;Chalker-Scott，1999;Diaz等，2006)。另外，以下的发现提示植物装配有支配其对氮限制适应性的分子机制。在拟南芥中，硝酸盐限制显著提高了一种高亲和力硝酸盐转运蛋白NRT2.1的转录(Filleur等，2001)。Todd等(2004)发现氮缺乏显著和特异地上调MYB-样基因AtNsrl的表达。最近Diaz等(2006)报道在低氮条件下生长的拟南芥植物导致老莲座叶中叶绿素分解，和全部莲座中花色素苷的累积。在这些氮限制引起的生长应答的控制中，鉴定了十五种定量性状基因座(QTL)(Diaz等，2006)。然而，未发现在发生对氮限制的适应性应答中缺陷的突变体。因此，控制该现象的分子机制是完全未知的。花色素苷是多种苯基丙酸类化合物(phenylpropanoid)，生物合成自氨基酸苯丙氨酸的一类来自植物的有机化合物。苯基丙酸类化合物具有广泛的多种功能，包括防御食草动物、微生物攻击或其他伤害来源；作为细胞壁的结构组分(即木质素)；作为对紫外光的防护；作为色素(例如花色素苷)；和作为信号传导分子。花色素苷生物合成始于由酶查耳酮合酶(CHS)从p-香豆酸酰-CoA和丙二酸单酰-CoA缩合产生中间产物查耳酮。p-香豆酸酰-CoA代表了苯基丙酸类化合物代谢中的重要分支点，因为其是花色素苷和木质素二者生产中的中间产物。CHS对p-香豆酸酰-CoA的使用驱动了朝向黄酮类化合物(flavanoid)和花色素苷的苯基丙酸类化合物生物合成，而若干种其他酶对p-香豆酸酰-CoA的使用导致木质素生物合成。花色素苷一般不存在于叶中，直到叶绿素分解为止，此时植物开始合成花色素苷，假定用于氮转运期间的光保护作用。已知蛋白质遍在蛋白化在调节真核生物中大量的细胞过程中起主要作用。首先，蛋白质遍在蛋白化途径靶向用于被26S蛋白酶体降解的多种底物，如核转录因子、异常细胞质蛋白质和短寿命的调节蛋白质(Glickman和Ciechanover，2002)。其次，用遍在蛋白修饰蛋白质也以蛋白酶体-不依赖性的方式调节蛋白质定位、活性、相互作用配偶体和功能(Schnell和Hicke,2003;Sun和Chen,2004)。RING-型遍在蛋白E3连接酶负责靶向用于遍在蛋白化的特异底物蛋白质。RING结构域是C3HC4型锌指，其结合两个锌原子并涉及介导蛋白质-蛋白质的相互作用。在拟南芥中，一些含RING蛋白质如COP1和S1NATA5的功能表征提示RING结构域的生物学功能是参与遍在蛋白依赖型蛋白质降解(Moon等，2004),并因此在真核生物细胞调节中起主要和13关键的作用(Glickman和Ciechanover，2002)。Stone等(2005)报道了拟南芥基因组编码469个推定的含RING蛋白质，其可分为八类(Stone等，2005)。然而，尚不清楚是否所有的RING-指基因都是E3遍在蛋白连接酶(Moon等，2005)。在植物中，RING-型遍在蛋白连接酶的体内功能仍然极少阐述，其中拟南芥基因组编码预测的469个RING结构域蛋白质(Stone等，2005)。发明概述在确定控制植物中氮限制适应性的分子机制的努力中，本发明人分离和表征了一种称作lines(低无机氮诱导的早衰)的拟南芥突变体，其丧失了适应氮限制的能力。当应用了不足量的氮营养物(硝酸盐或铵)时，该lines突变体植物不能发生关键的氮限制适应性应答，并因此比野生型植物衰老得早得多并且更加迅速。可通过对lines植物应用大量氮肥来挽救该低氮诱导的早衰表型。详细的生理学、生物化学和分子分析证明当对突变体lines植物应用有限的氮营养物(3mM硝酸盐)时，它们在整组关键的氮限制适应性应答的发生中受损，并因此不能适应氮限制生长条件。通过图位克隆方法进一步鉴定了野生型LINES基因(AtlgOM60)并预测其编码RING-型遍在蛋白连接酶。这提示功能性LINES蛋白质参与蛋白质遍在蛋白化介导的拟南芥氮限制信号传导途径中关键负调节物的降解或修饰。由该lines突变体编码的截短的蛋白质缺乏RING结构域，所述突变体适应氮限制的能力受损。因此，本发明人已提供了对于下述分子机制的首次了解，所述分子机制控制植物对氮限制的适应性。对氮限制的适应性是植物的关键性状，并与作物产量正相关。消耗土壤中氮的大量生物因素和生物因素频繁地创建氮限制生长条件。为了应付该问题，植物已进化出一套氮限制适应性应答。然而认识仅限于涉及这些适应性应答的生理学和生物化学改变，而操纵植物对氮限制的适应性的分子机制是之前完全未知的。本文公开的RING结构域涉及调节植物对氮限制的适应性应答。因此，本发明涉及调节植物或植物细胞中特征的方法，其包括调节植物或植物细月包中RING-型遍在蛋白E3连接酶的表达。在本发明的一个实施方案中，通过对细胞施用有效量的下述物质调节RING-型遍在蛋白E3连接酶的表达，所述物质能够调节植物细胞中RING-型遍在蛋白E3连接酶的表达水平。在本发明的又一实施方案中，该物质增加植物细胞中RING-型遍在蛋白E3连接酶的表达水平。植物中待调节的特征可以是任何目的农学性状。在本发明的一个实施方案中，该特征是受到氮、碳和/或硫代谢、脂质生物合成、营养物感知、营养适应、电子传递和/或膜相关能量守恒(membraneassociatedenergyconservation)影响的任何特征。在本发明的又一个实施方案中，该特征选自以下一种或多种氮利用、产量、细胞生长、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、信号转导、基因调控、非生物胁迫耐受和营养组成。在本发明的又一个实施方案中，被调节的特征是以下一种或多种的提高或改进氮利用、产量、细胞生长、生殖、光合作用、氮同化作用、木质素生物合成、花色素苷生物合成、疾病抗性、分化、信号转导、基因调控、非生物胁迫耐受和营养组成。植物或植物细胞可来自期望调节其特征的任何植物。在本发明的一个实施方案中，植物细胞为双子叶植物、棵子植物或单子叶植物。在一个实施方案中，双子叶植物选自大豆、烟草或棉花。在本发明的又一实施方案中，单子叶植物选自玉米、小麦、大麦、燕麦、棵麦(rye)、粟、高粱(sorghum)、黑小麦(triticale)、黑麦、单粒小麦(einkorn)、斯佩耳特小麦(spdt)、双粒小麦(emmer)、画眉草(teff)、蜀黍(milo)、亚麻、格兰马草(grammagrass)、磨擦草属物种(Tripsacumsp.)和类蜀粟(teosinte)。在本发明的一个实施方案中，能够调节植物细胞中RING-型遍在蛋白E3连接酶基因表达水平的物质包括(a)SEQII)NO:l、3、5、7、9的核苷^列，或其片段或结构域，(b)编码SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷餅列，其片段或结构域，(c)与(a)或(b)具有基^Nl似性的核苷酸序列；(d)能够与(a)、(b)或(c)杂交的核苷酸序列；(c)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互补物的核苷酸序列。在本发明的一个优选实施方案中，被调节的特征是以下一种或多种的提高或改进氮利用、产量、细胞生长、生殖、光合作用、氮同化作用、木质素生物合成、花色素苷生物合成、疾病抗性、分化、信号转导、基因调控、非生物胁迫耐受和营养组成。在一个具体的实施方案中，本发明涉及改善植物或植物细胞中氮利用的方法，其包括增加植物或植物细胞中RING-型遍在蛋白E3连接酶基因的表达。改善植物中的利用将使得对植物施用减少的氮肥量，伴随着农民成本和环境成本的降低，因为硝酸盐污染是在许多农业地区显著促成淡水和海洋环境退化的主要问题。另外，改善氮利用可允许在下述环境中栽培新的变种和物种，所述环境在其他情况下不适合栽培所述新变种和物种。在本发明的一个实施方案中，增加植物细胞中RING-型遍在蛋白E3连接酶基因表达水平的物质包括编码RING-型遍在蛋白E3连接酶的核酸分子。在本发明的一个实施方案中，增加植物细胞中RING-型遍在蛋白E3连接酶基因表达水平的物质包括(a)SEQIDNO:l、5、7、9的核苷^列，或其片段或结构域，(b)编码SEQIDNO:2、6、8、10中任一多肽的核苷齡列，其片段或结构域，(c)与(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能够与(a)、(b)或(c)杂交的核苷酸序列；(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互补物的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，基本的相似性是与SEQIDNO:l所示核苷酸序列或其片段或结构域至少约65%的同一性，特别是约80%的同一性，特16别是卯％，更特别地是至少约95%的序列同一性。在一个实施方案中，与核苷酸序列SEQIDNO:l、其片段或结构域具有基本相似性的序列来自植物。在一个特别的实施方案中，该植物是双子叶植物。在一个更特别的实施方案中，该双子叶植物选自大豆、烟草、白杨或棉花。在另一特别的实施方案中，该植物是棵子植物。在另一特别的实施方案中，该植物是单子叶植物。在一个更特别的实施方案中，该单子叶植物是谷物。在一个更特别的实施方案中，该谷物可以是例如玉米、小麦、大麦、燕麦、棵麦、粟、高粱、黑小麦、黑麦、单粒小麦、斯佩耳特小麦、双粒小麦、画眉草、蜀黍、亚麻、格兰马草、磨擦草属物种或类蜀粟。在一个特别的实施方案中，分离的核酸包含下述核苷酸序列或由其组成，所述核苷酸序列能够与类蜀粟SEQIDNO:l所示核苷酸序列或其片段或结构域杂交。在一个特别的实施方案中，杂交允许序列在中严档变或高严格度下形成双链体。本发明的实施方案还包含与核苷酸序列SEQIDNO:l或其片段或结构域互补的核苷酸序列。本发明的实施方案还包含与下述核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述核苷酸序列与核苷酸序列SEQIDN():l或其片段或结构域具有基本相似性或能够与之杂交。在一个特别的实施方案中，具有基本相似性的核苷酸序列是核苷^列SEQIDNO:l或其片段或结构域的等位变体。在一个备选的实施方案中，具有基本相似性的序列是天然发生的变体。在另一备选的实施方案中，具有基本相似性的序列是核苷酸序列SEQIDNO:l或其片段或结构域的多态变体。在一个特别的实施方案中，分离的核酸含有大量区域，所述区域具有核苷酸序列SEQIDNO:l或其外显子或结构域。在一个特别的实施方案中，具有基本相似性的序列含有至少一个核苷酸的缺失或插入。在一个更特别的实施方案中，缺失或插入少于约三十个核苷酸。在最优选的实施方案中，缺失或插入少于约五个核苷酸。在一个特别的实施方案中，具有基本相似性的分离的核酸的序列包含至少一个密码子的取代或由其组成。在一个特别的实施方案中，该取代是保守的。在本发明的又一个实施方案中，核酸分子包含ATlg02860基因序列SEQIDNO:l或其功能性片段。在本发明的又一个实施方案中，核酸分子包含下述序列，所述序列在中等严格条件下与ATlg02860基因SEQIDNO:l或其功能性片段杂交。在本发明的另一实施方案中，核酸分子来自ATlg02860基因SEQIDNO:l的核苷,列并具有下述核苷,列，所述核苷酸序列包含对植物中表达特异的密码子。在本发明的又一个实施方案中，核酸是ATlg02860基因的lines突变，其包含序列SEQIDNO:3或其编码多肽SEQIDNO:4的功能性片段。在本发明的另一实施方案中，核酸分子是ATlg02860基因的拟南芥同源物，其包含AT2g38920基因SEQIDNO:5的序列，或其编码多肽SEQIDNO:6的功能性片段。在本发明的另一实施方案中，核酸分子是ATlg02860基因的稻同源物，其包含核苷*列SEQIDNO:7，或其编码多肽SEQIDNO:8的功能性片段。在本发明的另一实施方案中，核酸分子是ATlg02860基因的稻同源物，其包含核苷*列SEQII)NO:9，或其编码多肽SEQIDNO:IO的功能性片段。在另一实施方案中，被调节的特征是以下一种或多种的减少或降低氮利用、产量、细胞生长、生殖、光合作用、氮同化作用、木质素生物合成、花色素苷生物合成、疾病抗性、分化、信号转导、基因调控、非生物胁迫耐受和营养组成。在这样的实施方案中，物质会抑制RING-样遍在蛋白E3连接酶的表达。这类物质描述于第VI部分中，并可选自反义寡核苷酸、适体和双链RNA分子或RNA诱导的沉默复合物。这类物质可干扰SEQIDNO:l、5、7或9的RING-样遍在蛋白连接酶的表达。在本发明的一个实施方案中，当物质是核酸序列时，该核酸序列在植物的特异位点或组织中表达。该位点或组织为(例如但不限于)表皮、根、维管组织、分生组织、形成层、皮层、髓、叶和/或花。在一个备选的实施方案中，位点或组织为种子。本发明的实施方案还涉及用于调节植物细胞中特征的改组的核酸分子，所述改组的核酸分子含有大量核苷,列片段，其中至少一条片段编码RING-样遍在蛋白E3连接酶且其中大量序列片段中至少两条是从5，到3'的方向，这不是核酸中天然存在的大量片段的方向。在一个特别的实施方案中，含有大量核苷^列片段的改组的核酸分子中所有片段来自单个基因。在一个更特别的实施方案中，大量片段源自至少两个不同的基因。在一个更特别的实施方案中，改组的核酸与启动子序列有效连接。另一更特别的实施方案是使用嵌合的多核苷酸用于调节植物细胞中的特征，所述嵌合的多核苷酸包含与改组的核酸有效连接的启动子序列。在一个更特别的实施方案中，改组的核酸包含在宿主细胞内。在本发明的又一个实施方案中，能够调节植物细胞中RING-样遍在蛋白E3连接酶基因表达水平的物质包括(a)SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一所示的多肽序列，或其片段、结构域、重复或嵌合体；(b)与(a)具有基本相似性的多肽序列；(c)由下述核苷酸序列编码的多肽序列，所述核苷酸序列与SEQIDN():l、3、5、7、9所示核苷酸序列或其片段或结构域或与之互补的序列相同或具有基本的相似性；或(d)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在中等严格条件下能够与SEQIDNO:l、3、5、7、9所示核苷酸序列或与之互补的序列杂交。在一个更特别的实施方案中，多肽含有SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一个的多肽序列或其片段。在一个更特别的实施方案中，多肽是植物多肽。在一个更特别的实施方案中，植物是双子叶植物。在一个更特别的实施方案中，植物是棵子植物。在一个更特别的实施方案中，植物是单子叶植物。在一个更特别的实施方案中，单子叶植物是谷物。在一个更特别的实施方案中，谷物可以是例如玉米、小麦、大麦、燕麦、棵麦、粟、高粱、黑小麦、黑麦、单粒小麦、斯佩耳特小麦、双粒小麦、画眉草、蜀黍、亚麻、格兰马草、磨擦草属物种和类蜀粟。在一个实施方案中，多肽在植物各处表达。在一个更特别的实施方案中，多肽在植物的特异位点或组织中表达。在一个更特别的实施方案中，该位点或组织为例如表皮、根、维管组织、分生组织、形成层、皮层、髓、叶和花。在一个最特别的实施方案中，该位点或组织为种子。在一个特别的实施方案中，多肽适用于产生针对下述多肽具有免疫反应性的抗体，所述多肽由核普酸序列SEQIDNO:2或其片段或结构域编码。在一个特别的实施方案中，与SEQIDNO:2所示多肽序列或其外显子或结构域具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽序列的等位变体。在另一特别的实施方案中，与SEQIDNO:2所示多肽序列或其外显子或结构域具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽序列的天然发生的变体。在另一特别的实施方案中，与SEQIDNO:2所示多肽序列或其外显子或结构域具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽的多态变体。在另一特别的实施方案中，多肽是多肽序列SEQIDNO:2。在另一特别的实施方案中，多肽是功能性片段或结构域。在另一特别的实施方案中，多肽是嵌合体，其中该嵌合体可含有功能蛋白结构域，所述功能蛋白结构域包括结构域、重复、翻译后修饰位点或其他特性。在一个更特别的实施方案中，多肽是植物多肽。在一个更特别的实施方案中，植物是双子叶植物。在一个更特别的实施方案中，植物是棵子植物。在一个更特别的实施方案中，植物是单子叶植物。在一个更特别的实施方案中，单子叶植物是谷物。在一个更特别的实施方案中，谷物可以是例如玉米、小麦、大麦、燕麦、棵麦、粟、高粱、黑小麦、黑麦、单粒小麦、斯佩耳特小麦、双粒小麦、画眉草、蜀黍、亚麻、格兰马草、磨擦草属物种和类蜀粟。在一个特别的实施方案中，多肽在植物的特异位点或组织中表达。在一个更特别的实施方案中，该位点或组织可以是例如表皮、根、维管组织、分生组织、形成层、皮层、髓、叶和花。在另一特别的实施方案中，该位点或组织为种子。在一个特别的实施方案中，由下述核苷酸序列编码的多肽序列含有至20少一个核苷酸的缺失或插入，所述核苷酸序列与核苷酸序列SEQIDNO:l或其片段或结构域或与之互补的序列具有基本的相似性。在一个更特别的实施方案中，缺失或插入少于约三十个核苷酸。在一个最特别的实施方案中，缺失或插入少于约五个核苷酸。在一个特别的实施方案中，由下述核苷酸序列编码的多肽序列含有至少一个密码子的取代，所述核苷酸序列与核苷酸序列SEQIDNO:l或其片段或结构域或与之互补的序列具有基本的相似性。在一个更特别的实施方案中，该取代是保守的。在一个特别的实施方案中，与多肽序列SEQIDNO:2或其片段、结构域、重复或嵌合体具有基本相似性的多肽序列含有至少一个氨基酸的缺失或插入。在一个特别的实施方案中，与多肽序列SEQIDNO:2或其片段、结构域、重复或嵌合体具有基本相似性的多肽序列含有至少一个氨基酸的取代。本发明的实施方案还包括表达盒用于调节植物细胞中特征的用途，所述表达盒包含启动子序列，所述启动子序列与编码RING-样遍在蛋白E3连接酶的分离的核酸有效连接。在本发明的实施方案中，编码RING-样遍在蛋白E3连接酶的分离的核酸由以下组成或包括以下(a)SEQII)NO:l、3、5、7、9的核苷^列，或其片段或结构域，(b)编码SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷酸序列，其片段或结构域，(c)与(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能够与(a)、(b)或(c)杂交的核苷酸序列；(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互补物的核苷^列。还包括在本发明中的是包含表达盒的重组载体调节植物细胞中特征的用途，所述表达盒包含启动子序列，所述启动子序列与编码RING-样遍在蛋白E3连接酶的分离的核酸有效连接。在本发明的实施方案中，重组载体包含下述编码RING-样遍在蛋白E3连接酶的分离的核酸，所述核酸由以下组成或包括以下(a)SEQIDNO:l、3、5、7、9的核苷^f列，或其片段或结构域，(b)编码SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷酸序列，其片段或结构域，(c)与(a)或(b)具有基^目似性的核苷酸序列；(d)能够与(a)、(b)或(c)杂交的核苷酸序列；(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互补物的核苷酸序列。本发明还包括包含本发明的表达盒的植物细胞的用途，和含有这些植物细胞的植物的用途。本发明还包括包含本发明的表达盒的植物细胞，和含有这些植物细胞的植物。在一个特别的实施方案中，该植物是双子叶植物。在一个更特别的实施方案中，该双子叶^i物选自大豆、烟草、白杨或棉花。在另一特别的实施方案中，该植物是棵子植物。在另一特别的实施方案中，该植物是单子叶植物。在一个更特别的实施方案中，该单子叶植物是谷物。在一个更特别的实施方案中，谷物可以是例如玉米、小麦、大麦、燕麦、棵麦、粟、高粱、黑小麦、黑麦、单粒小麦、斯佩耳特小麦、双粒小麦、画眉草、蜀黍、亚麻、格兰马草、磨擦草属物种和类蜀粟。在一个实施方案中，表达盒在植物各处表达。在另一实施方案中，表达盒在植物的特异位点或组织中表达。在一个特别的实施方案中，该位点或组织可以是例如表皮、根、维管组织、分生组织、形成层、皮层、髓、叶和花。在一个备选的特别实施方案中，该位点或組织为种子。本发明的实施方案还提供了来自植物的种子和分离产物用于调节植物细胞中特征的用途，所述种子和分离产物含有包含启动子序列的表达盒，所述启动子序列与编码本发明的RING-样遍在蛋白E3连接酶基因的分离的核酸有效连接。在一个特别的实施方案中，表达载体包含一个或多个元件，例如但不限于启动子增强子序列、选择标记物序列，或复制起点、表位标签编码序列，或亲和纯化标签编码序列。在一个更特别的实施方案中，启动子增强子序列可以是例如CaMV35S启动子、CaMV19S启动子、烟草PR-la启动子、遍在蛋白和菜豆蛋白启动子。在另一实施方案中，启动子可在植物中工作，更特别地为组成型或诱导性启动子。在另一特别的实施方案中，选择标记物序列编码抗生素抗性基因。在另一特别的实施方案中，表位标签序列编码V5、肽Phe-His-His-Thr-Thr、血凝素或谷胱甘肽-S-转移酶。在另一特别的实施方案中，亲和纯化标签序列编码多聚氨基酸序列或多肽。在一个更特别的实施方案中，多聚M酸序列为多聚组氨酸。在一个更特别的实施方案中，多肽是壳多糖结合结构域或谷胱甘肽-S-转移酶。在一个更特别的实施方案中，亲和纯化标签序列包含内含肽编码序列。在一个特别的实施方案中，表达载体是真核生物表达载体或原核生物表达载体。在一个更特别的实施方案中，真核生物表达载体包含组织特异的启动子。更特别地，表达载体可在植物中工作。本发明的实施方案还涉及通过下述方法修饰的植物，所述方法包括向植物中引入核酸，其中核酸可以在植物中以有效影响修饰的量表达。该修饰可以是以下一种或多种目的性状的提高或降低。该修饰可包括基因的超量表达、低表达、反义调节、有义阻抑、诱导性表达、诱导性阻遏、或诱导性调节。在本发明的一个实施方案中，修饰涉及目的性状例如氮利用或产量的提高或改进。在一个实施方案中，表达盒涉及下述功能，所述功能例如但不限于碳、氮和/或硫代谢、氮利用、氮同化作用、光合作用、木质素生物合成、花色素苷生物合成、信号转导、细胞生长、生殖、疾病抗性、非生物胁迫耐受、营养组成、基因调控和/或分化。在一个更特别的实施方案中，表达盒涉及下述功能，例如氮利用、非生物胁迫耐受、增加的产量、疾病抗性和/或营养組成。在一个实施方案中，植物含有对植物表型或可测量特征的修饰，所述修饰归因于表达盒中含有的至少一个基因的表达。在一个特别的实施方案中，该修饰可例如是碳、氮和/或硫代谢、氮利用、氮同化作用、光合作用、木质素生物合成、花色素苷生物合成、信号转导、细胞生长、生殖、疾病抗性、非生物胁迫耐受、营养组成、基因调控和/或分化。本发明的实施方案还提供了来自植物的种子和分离产物，所述种子和分离产物含有包含启动子序列的表达盒，所述启动子序列与含有下述核苦酸序列的分离的核酸有效连接，所述核苷酸序列包括(a)SEQIDNO:l、3、5、7、9的核苷紗列，或其片段或结构域，(b)编码SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷酸序列，其片段或结构域，(c)与(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能够与(a)、(b)或(c)杂交的核苷酸序列；(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的核苷酸序列；或(f)是本发明的(a)、(b)、(c)或(d)的反向互补物的核苷酸序列。在一个特别的实施方案中，分离的产物包括酶、营养蛋白质、结构蛋白质、氨基酸、脂质、脂肪酸、多糖、糖、醇、纤维、黄酮类化合物、生物碱、类胡萝卜素、propanoid、类固醇、色素、维生素和植物激素。本发明的实施方案还涉及通超量表达含下述核苷酸序列的分离的核酸产生的分离产物，所述核苷*列包括(a)SEQIDNO:l、3、5、7、9的核苷,列，或其片段或结构域，(b)编码SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷酸序列，或其片段或结构域，(c)与(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能够与(a)或(b)杂交的核苷酸序列；(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的核苷酸序列；或(f)是根据^^开内容的(a)、(b)、(c)或(d)的反向互补物的核苷酸序列。在一个特别的实施方案中，产物在植物中产生。在另一特别的实施方案中，产物在细胞培养物中产生。在另一特别的实施方案中，产物在无细胞体系中产生。在另一特别的实施方案中，产物包括酶、营养蛋白质、结构蛋白质、氨基酸、脂质、脂肪酸、多糖、糖、醇、纤维、黄酮类化合物、生物碱、类胡萝卜素、propanoid、类固醇、色素、维生素和植物激素。在一个实施方案中，产物是RING-型遍在蛋白E3连接酶。在一个特别的实施方案中，产物是含有SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一氨基酸序列的多肽。本发明的实施方案还涉及分离的多核苷酸,其包含至少10个碱基的核苷餅列，所述核苷^>列与SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一序列的区域相同、互补或基本类似，且其中该多核苷酸适应多种用途中的任意用途。在一个特别的实施方案中，多核苷酸被用作染色体标记物。在另一特别的实施方案中，多核苷酸^f皮用作RFLP分析的标记物。在另一特别的实施方案中，多核苷酸^L用作定量性状关联育种的标记物。在另一特别的实施方案中，多核苷酸^^用作标记物-辅助育种的标记物。在另一特别的实施方案中，多核苷酸被用作双杂交系统中的钓餌序列，以鉴定下述序列，所述序列编码与钓斜序列编码的多肽相互作用的多肽。在另一特别的实施方案中，多核苷酸被用作对个体或个体群进行基因分型或鉴定的诊断指示剂。在另一特别的实施方案中，多核苷酸被用作遗传分析，以鉴定基因或外显子的边界。本发明的实施方案还涉及包含下述核酸分子或由其组成的表达载体，所述核酸分子包括(a)编码SEQIDNO:2、4、6、8、10所示任一多肽的核酸序列，或(b)SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一的片段、一个或多个结构域、或特;f正区i或；或(c)SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一所示的全核紗列或其片段，和异源序列。在一个特别的实施方案中，表达载体包含一个或多个元件，例如但不限于启动子增强子序列、选择标记物序列、复制起点、表位标签编码序列，或亲和纯化标签编码序列。在一个更特别的实施方案中，启动子增强子序列可以是例如CaMV35S启动子、CaMV19S启动子、烟草PR-la启动子、遍在蛋白和菜豆蛋白启动子。在另一实施方案中，启动子可在植物中工作,25更特别地为组成型或诱导性启动子。在另一特别的实施方案中，选择标记物序列编码抗生素抗性基因。在另一特别的实施方案中，表位标签序列编码V5、肽Phe-His-His-Thr-Thr、血凝素或谷胱甘肽-S-转移酶。在另一特别的实施方案中，亲和纯化标签序列编码多聚M酸序列或多肽。在一个更特别的实施方案中，多聚氨基酸序列为多聚组氨酸。在一个更特别的实施方案中，多肽是壳多糖结合结构域或谷胱甘肽-S-转移酶。在一个更特别的实施方案中，亲和纯化标签序列包含内含肽编码序列。在一个特别的实施方案中，表达载体是真核生物表达栽体或原核生物表达栽体。在一个更特别的实施方案中，真核生物表达载体包含组织特异的启动子。更特别地，表达载体可在植物中工作。本发明的实施方案还涉及包含核酸构建体或由其组成的细胞，所述核酸构建体包含表达栽体和与异源序列组合的下述核酸，所述核酸包括编码SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一所示多肽的核酸，或SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一所示的核酸，或其区段。在一个特别的实施方案中，细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞。在一个特别的实施方案中，细胞是植物细胞。在一个更特别的实施方案中，多肽在植物的特异位点或组织中表达。在一个最特别的实施方案中，该位点或组织可以是例如表皮、根、维管组织、分生组织、形成层、皮层、髓、叶和花。在备选的最特别的实施方案中，该位点或组织是种子。在一个特别的实施方案中，多肽涉及下述功能，例如碳、氮和/或硫代谢、氮利用、氮同化作用、光合作用、木质素生物合成、花色素苷生物合成、信号转导、细胞生长、生殖、疾病抗性、非生物胁迫耐受、营养组成、基因调控和/或分化。本发明的实施方案涉及下述多肽，所述多肽含有由下述分离的多核苷酸编码的多肽序列，所述分离的多核苷酸含有至少10个碱基的核苷^列，该序列与SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一序列的区域或其功能性片段相同、互补或基本相似，且其中该多核苷酸适用于下述用途，包括(a〕26核苷酸位置的用途；(b)作为RFLP分析标记物的用途；(c)作为定量性状关联育种的标记物的用途；(d)作为标记物-辅助育种的标记物的用途；(e)作为钓何序列在双杂交体系中用于鉴定编码多肽的序列的用途，所述多肽与钓斜序列编码的多肽相互作用；(f)作为对个体或个体群进行基因分型或鉴定的诊断指示物的用途；或(g)用于鉴定基因或外显子边界的遗传分析的用途。本发明还涉及包含至少10个碱基核苷酸序列的核酸分子的用途，该序列与区域SEQIDNO:3或其功能性片段相同、互补或基本相似，且其中该用途选自下组(i)作为低氮限制适应性标记物的用途；(ii)作为提高的木质素合成的标记物的用途；或(iii)作为低产量标记物的用途。还包括生产包含修饰的植物的方法，其包括步骤(l)提供核酸，其为含有核苷酸序列的分离的核酸，所述核苷酸序列包括(a)如SEQIDNO:l、3、5、7、9所示的核苷酸序列，或其外显子或结构域，(b)与(a)具有基本相似性的核苷酸序列；(c)能够与(a)杂交的核苷酸序列；(d)与(a)、(b)或(c)互补的核苷酸序列；或(c)是(a)、(b)或(c)的反向互补物的核苷酸序列；和(2)将核酸分子引入植物，其中所述核酸分子在所述植物中以有效影响修饰的量表达。在一个实施方案中，修饰包括植物中改变的特征，其中所述特征对应于被引入植物的核酸。在其他特别的实施方案中，该特征对应于碳、氮和/或硫代谢、氮利用、氮同化作用、光合作用、木质素生物合成、花色素苷生物合成、信号转导、细胞生长、生殖、疾病抗性、非生物胁迫耐受、营养组成、基因调控和/或分化。27在另一实施方案中，修饰包括提高或降低的表达，或植物产物的累积。特别地，该产物是植物的天然产物。同等特别地，该产物是植物的新产物或改变的产物。特别地，该产物包括RING-样遍在蛋白E3连接酶。本文公开的发明还包括制备重组蛋白质的方法，其包括步骤(a)在合适的培养条件下培养包含核酸构建体的重组细胞，所述构建体包含表达栽体和核酸，所述核酸包括编码如SEQIDNO:2、4、6、8、l()所示蛋白质的核酸，或SEQIDNO:l、3、5、7、9所示核酸序列或其节段；和(b)从重组细胞中分离其表达的重组蛋白质。本发明的实施方案提供了制备重组蛋白质的方法，其中表达载体包含一个或多个元件，包括启动子增强子序列、选择标记物序列、复制起点、表位标签编码序列，和亲和纯化标签编码序列。在一个特别的实施方案中，核酸构建体包含表位标签编码序列，且分离步骤包括使用对该表位标签特异的抗体。在另一特别的实施方案中，核酸构建体含有多聚氨基酸编码序列，且分离步骤包括使用包含多聚氨基酸结合物质的树脂，特别是其中多聚氨基酸为多聚组氨酸且多聚氨基酸结合树脂为镍-带电琼脂糖树脂。在另一特别的实施方案中，核酸构建体含有多肽编码序列，且分离步骤包括使用含多肽结合物质的树脂，特别是当多肽为壳多糖结合结构域且树脂含有壳多糖-琼脂糖凝胶(sepharose)时。本发明的实施方案还涉及通过下述方法修饰的植物，所述方法包括向植物中引入核酸，其中该核酸可在植物中以有效影响修饰的量表达。该修饰可以是例如碳、氮和/或硫代谢、氮利用、氮同化作用、光合作用、木质素生物合成、花色素苷生物合成、信号转导、细胞生长、生殖、疾病抗性、非生物胁迫耐受、营养组成、基因调控和/或分化。在一个实施方案中，经修饰的植物具有对除草剂、胁迫或病原体的提高或降低的抗性。在另一实施方案中，经i务饰的植物具有对光、水、氮或孩史量元素的增加或减轻的需求。在另一实施方案中，以植物蛋白质级分的比例计，经修饰的植物富含必需氨基酸。该蛋白质级分可以是例如总种子蛋白、可溶蛋白质、不溶蛋白质、可用水提取的蛋白质和脂质结合蛋白质。在另一实施方案中，经修饰的植物具有提高或降低的花色素苷色素。在另一实施方案中，经修饰的植物具有提高或降低的木质素累积。在另一实施方案中，植物对土壤中限制氮条件具有提高的灵敏度。修饰可包括基因的超量表达、低表达、反义调节、有义阻抑、诱导性表达、诱导性阻遏、或诱导性调节。本发明还涉及来自经修饰的植物的种子，或经修饰的植物的分离产物，其中该产物可以是酶、营养蛋白质、结构蛋白质、氨基酸、脂质、脂肪酸、多糖、糖、醇、纤维、黄酮类化合物、生物碱、类胡萝卜素、propanoid、类固醇、色素、维生素和植物激素。上述"发明概述"列举了本发明的若干个实施方案，并且在许多情况下列举了这些实施方案的变更和置换。该概述仅是大量和变化的实施方案的示例。提到给定实施方案的一个或多个特别特征同样是示例性的。一般可存在具有或不具有所述一个或多个特征的这样的实施方案；同样，这些特征可应用于本发明的其他实施方案，无论所述实施方案在概述中是否列出。为了避免过度重复，该概述不列举或提出这类特征的所有可能的组合。为了概述本发明和达到的超出现有技术的优点，上文已描述了本发明的某些目标和优点。当然，应当理解对本发明的任何具体的实施方案而言，不必须达到所有这些目标和优点。因此，例如本领域技术人员会知道本发明可以以下述方式进行，所述方式达到或最优化本文教导的一个优点或一组优点，而不必须达成本文可教导或提出的其他目标或优点。下面特别实施方案的详细描述使得本发明的其他方面、特征和优点变得显而易见。然而，应当理解详述和特别的实施例尽管指出本发明的优选的实施方案，但是仅以阐述的方式给出，因为本领域技术人员根据该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的多种改变和修饰。附图概述图1是阐述lines突变体中低氮诱导的早衰的一系列图片。野生型(Columbia,Col)和lines植物在分别含有1、3或10mM硝酸盐的LB2土29壤中生长18天(A)、26天(B)和32天(C)，供应1或3mM硝酸盐的lines植物中显示早衰表型。DAG:种子萌发后天数。箭头指出死亡的长角果。(D)和(E)是分别来自供应3mM硝酸钾的lines(上图)和Col(下图)植物的茎生叶和发育中的长角果。(E)中的箭头指出正在衰老的长角果尖端。对正在衰老的lines植物提供15mM硝酸盐终止了最初用1mM(F)或3mM(G)硝酸盐栽培的lines植物中的衰老进程。图2描绘了LINES基因的图位克隆和lines突变体的互补。(A)通过染色体I上臂上的两个侧翼SSP1标记物NF21B7(12个重组体)和NT7I23(6个重组体)定义LINES基因座的位置。进一步的绘图将LINES基因座定位在BAC克隆F22D16上，F22D16側接SSLp标记物473993(1个重组体)和CAPS标记物SNP247(1个重组体)。该区域约62.3kb并含有21个有注解的基因，其中仅在基因Atlg02860中检测到DNA片段缺失。以下的互补测试证实了Atlg02860就是LINES基因。(B)提供3mM硝酸盐后，用Atlg02860cDNA独立转化的野生型和三林lines才直物未显示提供3mM硝酸盐时的早衰表型，但是用空载体pGEAD转化的lines植物和lines自身在种子萌发后26天显示过早和快速的衰老。(C)和(D):分别通过PCR和RT-PCR在野生型、lines和转基因lines植物中检测多种版本的Atlg02860基因组DNA和cDNA。图3是LINES基因的分子分析。(A)预测的LINES蛋白质氨基酸序列(SEQIDNO:4)。LINES突变中的缺失残基标有下划线，(B)具有SPX和RING结构域的LINES结构图解。在截短的LINES中RING结构域的大部分缺失。(C)LINES直向同源物的系统进化分析，所述LINES直向同源物含有SPX和RING两种结构域。图4是在有限的氮供应下生长的lines和Col植物中氮获取和衰老过程的比较。(A)种子萌发后18天(DAG)茎中总氮含量百分比(w/w)。数值为均值±标准误(11=3)。(B)20DAG时lines和Col根中两个主要的硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1和NRT2.1的表达。(C)26DAG(上图)和32DAG(下图)时，来自lines和Col;tt物的莲座叶中的衰老进展。图片显示莲座中各位置的代表性叶。(D)lines和Col植物中衰老标记物基因SAG12的表达语。图5是在受限的氮供应下生长的lines和Col植物中，随着衰老过程改变的氮和碳代谢产物含量以及花色素苷量的分析。测试的代谢产物包括(A)硝酸盐；(B)总氨基酸；(C)蛋白质；(D)总氮百分比(w/w);(E)葡萄糖；(F)果糖；(G)蔗糖；(H)花色素苷；(I)叶绿素。条棒代表均值土标准差(n=3-6)。图6是提供了有限氮的lines和Col植物中随着衰老过程改变的相关基因表达。分析的基因包括涉及氮同化作用(Rl、NR2和GS2)、光合作用(RBCS和CAB1)和花色素苷合成(CHS)的基因。使用SGA12表达作为衰老过程的指示剂。定义为了清楚起见，如下定义说明书中使用的某些术语"关联/有效连接"是指两条核酸序列物理上或功能上相关联。例如，或位置使得调节DNA序列会影响编码或结构DNA序列的表达水平，则该启动子或调节DNA序列被称作与该DNA序列"关联"。"嵌合构建体，，是重组的核酸序列，其中启动子或调节核酸序列与核酸序列(所述核酸序列编码mRNA或被表达为蛋白质)有效连接或关联，使得调节核酸序列能够调节关联的核酸序列的转录或表达。嵌合构建体的调节核酸序列通常不与天然存在得而关联核酸序列有效连接。"辅因子"是酶催化的反应中所需的天然反应物，如有机分子或金属离子。辅因子为例如NAD(P)、维生素B2(包括FAD和FMN)、叶酸、钼蝶呤、维生素B"thiamin)、生物素、硫辛酸、泛酸和辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸、吡喷醛磷酸、泛醌、甲基萘醌类。任选地，辅因子可以再生和再使用。"编码序列，，是被转录为RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA的核酸序列。特别地，该RNA随后在生物中被翻译产生蛋白质。互补的"互补的"是指包含反向平行核苷酸序列的两条核香酸序列，其能够通过在反向平行的核苷酸序列中互补的碱基残基之间形成氢键而彼jt匕酉己Xt。酶活性在本文中表示酶催化底物转化为产物的能力。酶的底物包括酶的天然底物，但是也包括天然底物的类似物，所述类似物也可以被酶转>化为产物或转化为产物的类似物。例如通过测定某时间段后反应中的产物量，或通过测定某时间段后反应混合物中剩余的底物量来测量酶活性。还通过测定某时间段后反应混合物中剩余的未使用的反应辅因子的量，或通过测定某时间段后反应混合物中使用的辅因子的量来测量酶活性。还通过测定某时间段后反应混合物中剩余的自由能供体或能量富集分子(例如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的量，或通过测定某时间段后反应混合物中使用的自由能供体或能量富集分子(例如ADP、丙酮酸、乙酸或肌酸)的量来测量酶活性。表达盒本文使用的"表达盒"表示能够指导具体核苷酸序列在适当宿主细胞组中表达的核酸分子，其包含与目的核苷酸序列有效连接的启动子，所述目的核苷酸序列与终止信号有效连接。其一般还包含正确翻译核苷酸序列所需的序列。编码区通常编码目的蛋白质，但是也可编码有义或反义方向上的目的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这表示其至少一个组件对于其至少另一个组件而言是异源的。表达盒也可以是下述表达盒，所述表达盒是天然存在的，但是以适用于异源表达的重组形式获得。然而，表达盒相对于宿主一般是异源的，即表达盒的具体DNA序列在宿主细胞中天然不存在，并且必须已通过转化事件被引入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达盒中核苷酸序列的表达可以位于组成型启动子或诱导性启动子的控制下，所述诱导性启动子仅在所述宿主细胞暴露于一些具体的外部刺激时起始转录。在多细胞生物如植物的情况下，启动子也可以对具体的组织或器官或发育阶段是特异的。本文与核酸或蛋白质序列相关使用的术语"功能片段"表示保留全长32序列功能的序列片段或部分。基因术语"基因"被广泛用于表示与生物学功能相关联的任何DNA区段。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还包括非表达的DNA区段，例如形成其他蛋白质的识别序列的DNA区段。基因可得自多种来源，包括从目的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并可包括^皮设计为具有期望参数的序列。异源的/外源的术语"异源的"和"外源的"在本文中涉及核酸序列(例如DNA序列)或基因使用时表示来自具体宿主细胞的外部来源，或如果来自相同来源时，表示对其原始形式进行了修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对具体宿主细胞是内源的，但是已通过例如DNA改组的使用进行了修饰的基因。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，该术语是指对细胞是外源或异源的DNA区段，或对细胞是同源的但是位于宿主细胞核酸中下述位置的DNA区段，该元件通常不存在于所述位置。表达外源DNA区段得到外源多肽。"同源"核酸(例如DNA)序列是与引入该序列的宿主细胞天然关联的核酸(例如I)NA)序列。杂交短语"与……特异杂交，，是指在严格度条件下，当下述序列存在于复杂混合物(例如总细胞)DNA或RNA中时，一个分子只与该具体核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。"基本结合"是指探针核酸和靶核酸之间包含小量错配的互补杂交，可以通过降低杂交介质的严格度来调节所述错配，以达到靶核酸序列的期望检测。抑制剂使蛋白质如生物合成酶、受体、信号转导蛋白质、结构基因产物或运输蛋白的酶活性失活的化学物质。在本文中使用术语"除草剂"(或"除草化合物")定义下述抑制剂，对任何发育阶段的植物应用该抑制剂，藉此该除草剂抑制植物的生长或杀死植物。相互作用相互作用的品质或状态使得一种蛋白质或化合物对另一种蛋白质的有效性或毒性是抑制(拮抗剂)或增强(激动剂)的。当核酸序列编码的多肽与参考核酸序列编码的多肽具有相同氨基^列时，该核酸序列与参考核酸序列是"同类编码"的。等基因的在遗传上等同的植物，只是因为存在或不存在异源DNA序列而不同。分离的在本发明的上下文中，分离的DNA分子或分离的酶是通过人的介入远离其天然环境并因此不是天然产物的DNA分子或酶。分离的I)NA分子或酶可以以纯化的形式存在，或可存在于非天然的环境中，例如存在于转基因宿主细胞中。成熟蛋白质其中转运肽、信号肽和/或前肽部分已被去除的蛋白质。最小启动子可支持任何转录的最小的启动子部分，如TATA元件。在缺失上游激活时，最小启动子一般具有被大幅降低的启动子活性。存在合适的转录因子时，最小启动子发挥允许转录的作用。修饰的酶活性与植物中天然存在的酶活性不同的酶活性(即在缺失人对这类活性的直接或间接操作时天然存在的酶活性)，其对抑制天然存在的酶活性的抑制剂耐受。固有的是指存在于未经转化的植物细胞基因组中的基因。天然存在的术语"天然存在的"用于描述可在自然中发现的物体，其与由人人工生产的不同。例如，存在于生物体(包括病毒)中的蛋白质或核苷酸序列是天然存在的，所述蛋白质或核苷酸序列可从天然来源分离，并且未由人在实验室中有意地修饰。核酸术语"核酸，，是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的多聚体。除非特别地限制，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其与参考核酸具有类似的结合特性，并以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，具体的核酸序列还含蓄地包括其经保守修饰(例如简并密码子取代)的变体和互补序列以及明确指出的序列。特别地，可通过产生下述序列达成简并密码子取代，所述序列中一个或多个选定的(或所有)密码子的第三个位置被混合性碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等，NucleicAcidRes.19:5081(1991);Ohtsuka等，丄Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等，Mol.Cell.Probes8:91-9834(1994))。术语"核酸"或"核酸序列"也可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换4吏用。"ORF"表示可读框。百分比同一性在两条核酸或蛋白质序列的上下文中，短语"百分比同一性"或"百分比相同"是指针对最大对应进行比较和比对时，具有例如6()%，特别是70%,更特别是80。/。，仍然更特别是90。/。，进一步更特别是95%和最特别是至少99%的核苷酸或氨基酸残基同一性的两条或多条序列或亚序列(subsequence),其使用以下序列比较算法之一测量或通过视觉检查测量。特别地，百分比同一性存在于长度为至少约50个残基的序列区域中，更特别地存在于至少约IOO个残基的区域中，最特别地，百分比同一性存在于至少约150个残基中。在一个特别特定的实施方案中，百分比同一性存在于编码区的全长中。为了进行序列比较，通常一条序列发挥参考序列的作用，测试序列与该参考序列比较。使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机中，如果需要的话指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。序列比较算法随后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。可例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&W扁ch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr"Madison,WI)或通过视觉检查(一般参见Ausubel等，下文)，对用于比较的序列进行最佳比对。适用于测定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(19卯)中。公众可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得运行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字长(shortword)鉴定高分#^列对(HSP)，所述短字长与数据库序列中相同长度的字长比对时匹配或满足一些正值的阈值分数T。T是指邻域字长分数阈值(Altschul等，19卯)。这些初始的邻域字长匹配(hit)发挥起始下述搜索的种子的作用，所述搜索寻找含有它们的更长的HSP。该字长匹配随后在两个方向上沿着各序列扩展，直到累积的比对分数能够被提高为止。对核苷酸序列而言，使用参数M(—对匹配残基的奖励分数；始终〉0)和N(错配残基的罚分；始终<0)计算累积的分数。对氨基,列而言，使用评分矩阵计算累积分数。当累积的比对分数从其达到的最大值跌落数量X、累积的分数由于一个或多个负分残基比对的累积而达到或低于零、或达到任一序列的末端时，停止字长匹配在各方向上的扩展。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列而言)使用11的字长(W)、10的预期(E)、100的截断、M-5、=-4和两条链的比较作为默认值。对M酸序列而言，BLASTP程序使用3的字长(W)、10的预期(E)和BLOSUM62评分矩阵作为默i^值(见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法还在两个序列之间进行相似性的统计学分析(见例如Karlin&AItschul，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA卯5873-5787(1993))。由BLAST提供的相似性的一种度量为最小概率和(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中，最小概率和小于约O.l，更特别地小于约0.01，和最特别地小于约0.001，则认为测试核酸序列与参考序列相似。前蛋白质通常靶向细胞器(如叶绿体)并且仍包含其天然转运肽的蛋白质。纯化的应用于核酸或蛋白质时，术语"纯化的"表示核酸或蛋白质基本上不含其他分子组件，所述分子组件在天然状态下与所述核酸或蛋白质相连。尽管其可以是干燥的或在水性溶液中，但是其特别地处于同质状36态(homogeneousstate)。通常4吏用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析测定纯度和同质性。在制品中是优势种类的蛋白质是基本纯化的。术语"纯化的"表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上给出一个条带。具体地，这表示核酸或蛋白质至少约50%纯净，更特别地至少约85。/。纯净，和最特别地至少约99%纯净。当来自两条核酸各自的序列在子代核酸中组合时，该两条核酸是"重组的"。当核酸均为重组的底物时，这两条序列是"直接"重组的。当序列使用中间体如交换(cross-over)寡核苷酸重组时，两条序列是"间接重组的"。对间接重组而言，不多于一条序列是重组的真实底物，并且在一些情况下，序列均不是重组的底物。"调节元件"是指涉及控制核苷酸序列表达的序列。调节元件包括与目的核苦酸序列有效连接的启动子和终止信号。它们一般还包括核苷,列适当翻译所需的序列。显著的提高大于测量技术中固有误差的卩艮度的酶活性提高，特别是在存在抑制剂时野生型酶活性提高约2倍或更大，更特别地提高约5倍或更大，最特别地提高约IO倍或更大。显著更少表示酶反应的产物量被减少得多于测量技术中固有误差的限度，特别是在缺失抑制剂时野生型酶活性减少约2倍或更大，更特别地减少约5倍或更大，最特别地减少约IO倍或更大。特异的结合/免疫交叉反应性两条核酸序列或蛋白质基本相同的指标是第一核酸编码的蛋白质与由笫二核酸编码的蛋白质免疫杂交反应或特异结合。因此，例如当两个蛋白质仅由保守取代区别时，蛋白质一般与第二蛋白质M本相同的。涉及蛋白质或肽时，短语"与抗体特异(或选择性)结合"或"与……特异(或选择性)免疫反应"是指在存在蛋白质的异源群体和其他生物制品时决定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，特定的抗体与具体的蛋白质结合，并且不以显著的量与样品中存在的其他蛋白质结合。在这类条件下与抗体的特异结合可需要下述抗体，所述抗体因其对具体蛋白质的特异性而被选择。例如，可选择针对下述蛋白质产生的抗体获得与该蛋白质特异免疫反应而不与其他蛋白质(除多态变体以外)特异免疫反应的抗体，所述蛋白质具有本发明的任何核酸序列编码的氨基酸序列。可使用多种免疫测定方式选择与具体蛋白质特异免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定、Western印迹、或免疫组织化学选择与蛋白质特异免疫反应的单克隆抗体。可用于测定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述见Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,NewYork"HarlowandLane")。特异或选择性的反应通常会是背景信号或噪音的至少两倍，更通常是背景的多于10到IOO倍。在核酸杂交实验如Southern和Northern杂交的语境中，"严格杂交条件"和"严格杂交洗涤条件"是序列依赖性的，并在不同的环境参数下不同。更长的序列在更高的温度下特异杂交。核酸杂交的广泛指南见Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分第2章，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays"Elsevier,NewYork。一般地，高严格度杂交和洗涤条件被选择为比确定的离子强度和pH下特异序列的热解链温度(Tm)低约5°C。通常在"严格条件"下，探针会与其靶亚序列杂交，但不与其他序列杂交。Tm是50%的靶序列与优选的匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。非常严格的条件被选择为等于具体探针的Tm。在Southern或Northern印迹的滤纸上用于互补核酸杂交的严格杂交条件的实例是42。C下含lmg肝素的50。/。甲酰胺中过夜进行杂交，所述互补核酸具有多于100个互补的残基。高度严格洗涤条件的实例是72'C下0.15MNaCl约15分钟。严格洗涤条件的实例是65。C下0.2xSSC洗涤15分钟(SSC緩冲液的描述见Sambrook，下文)。通常，在高严格度洗涤之前进行低严格度洗涤，去除背景探针信号。用于例如多于100个核苷酸双链体的中严格度洗涤的实例是45。C下lxSSC15分钟。例如多于100个核苷酸双链体的低严格度洗涤的实例是40。C下4-6xSSC15分钟。对短探针(例如约10到5038个核苷酸)而言，严格条件通常涉及在pH7.0到8.3下少于约1.0MNa离子的盐浓度，通常约0.01到1.0MNa(或其他盐)离子浓度，而温度通常至少约30°C。也可通过去稳定剂如曱酰胺的添加达到严格条件。一般地，是具体杂交实验中针对无关探针观察到的信噪比2倍(或更高)的信噪比表示检测到特异杂交。如果其所编码的蛋白质M本相同的，则在严格条件下彼此不杂交的核酸仍然M^目同的。这发生于例如使用遗传密码子允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时。以下是杂交/洗涤条件集合的实例，其可用于克隆与本发明的参考核苷酸序列同源的核苷酸序列参考核苷酸序列与所述参考核苷酸序列在7%十二烷基^克酸钠(SDS)、0.5MNaP04、1mMEDTA中于50。C下特异杂交，在2XSSC、0.1%SDS中于50。C洗涤；更期望在7。/。十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP04、1mMEDTA中于5(TC下特异杂交，在1XSSC、0.1%SDS中于50。C下洗涤；进一步更期望在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNal)04、1mMEDTA中于50。C下特异杂交，在0.5XSSC、0.1%SDS中于50。C下洗涤；特别地在7%十二烷1^克酸钠(SDS)、0.5MNaP04、1mMEI)TA中于50。C下特异杂交，在0.1XSSC、0.1%SDS中于50。C下洗涤；更特别地在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA中于50。C。C下特异杂交，在0.1XSSC、0.1%SDS中于65。C下洗涤。"亚序列"是指分别包含更长的核酸或氨基酸(例如蛋白质)序列的一部分的核酸或M酸序列。基本相似性在两条核酸或蛋白质序列的语境中，术语"基本相似性"是指基本相似的两条或更多序列或亚序列，例如具有50%，特别是60%，更特别是70%，进一步更特别是80%，仍然更特别是卯％，还更特别是95%和最特别是99%序列同一性。底物底物是酶天然识别并在酶天然发挥其功能的生物化学途径中转化为产物的分子，或是该分子经修饰的版本，该版本也被酶识别并在于天然发生的反应相似的酶反应中被酶转化为产物。转化用于将异源DNA引入植物细胞、植物组织或植物中的方法。39转化的植物细胞、植物组织或植物理解为不仅包括转化过程的终产物，而且包括其转基因后代。"转化的"、"转基因的"和"重组的"是指其中已引入异源核酸分子的宿主生物，如细菌或植物。核酸分子可被稳定整合进宿主的基因组中，或核酸分子也可作为染色体外分子存在。这类染色体外分子可以自我复制。转化的细胞、组织或植物理解为不仅包括转化过程的终产物，而且包括其转基因后代。"非转化的"、"非转基因的"或"非重组的"宿主是指不含有异源核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。存活力本文使用"存活力"是指植物的适应度(fitness)参数。针对植物发育的纯合表现对其进行测定，指出何种蛋白质对于植物生长是必要的。发明详述I.性状功能基因组学的一般描述功能基因组学的目的是鉴定控制生物表型表达的基因，并使用多种方法学，包括担不限于生物信息学、基因表达研究、基因和基因产物相互作用、遗传学、生物化学和分子遗传学。例如，生物信息学能够通过在异源生物中鉴定在氨基酸或核苷酸水平上具有高相似性(同源性)程度的基因，为给定的基因指定功能。基因在mRNA或蛋白质水平上的表达能够通过将基因的表达与环境应答、发育过程或遗传(突变)或分子遗传(基因超量表达或低表达)干扰相关联来指定功能。基因在mRNA水平上的表达可单独(Northern分析)或与其他基因一起(微阵列分析)检查，而基因在蛋白质水平上的表达能够单独(天然或变性的蛋白质凝胶或免疫印迹分析)或与其他基因一起(蛋白质组分析)检查。对蛋白质/蛋白质和蛋白质/DNA相互作用的了解能够通过鉴定在相同生物学过程中一起发挥作用的蛋白质和核酸序列来指定功能。遗传学可通过证明基因中的DNA损伤(突变)对生物具有可计量的影响来对基因指定功能，所述影响包括担不限于其发育；激素生物合成和应答；生长和生长习性(植物结构)；mRNA表达谱；蛋白质表达谦；抗病能力；对非生物胁迫的耐受；获得营养物的能力；光合作用效率；改变的初级和次级代谢；和多种植物器官的组成。生物化学可通过证明由基因编码的蛋白质(特别是在异源生物中表达时)单独或与其他蛋白质一起具有某种酶活性来指定功能。分子遗传学能够通过在天然植物或在异源生物中超量表达或低表达基因，并观察上文遗传学功能指定中所述的可定量影响来指定功能。在功能遗传学中，使用任何或所有这些方法(通常一起使用)，基于大量生物表型中的任意表型为基因指定功能。本领域才支术人员明白，所有这些不同的方法学均可提供证明具体基因功能的数据，并且这类证据随着递增数量的数据而更强大，所述数据用于功能指定特别是来自一种方法学，更特别地来自两种方法学，并且进一步更特别地来自多于两种方法学。另外，本领域技术人员明白，不同的方法学在证明基因功能指定的证明力度中可不同。通常生物化学、遗传学和分子遗传学证据的资料被认为比生物信息学或基因表达证据的资料更有力，但不总是如此。最后，本领域技术人员明白，对不同的基因而言，来自一种方法学的一种资料在证据的力度方面可以是不同的，所述证据由用于这些不同基因功能指定的各种不同资料提供。森林物种性状功能基因组学(silviculturalspeciestraitfunctionalgciHmiics)的目的是鉴定性状基因，即能够在森林植物中赋予有用性状的基因。这类性状包括但不仅限于增加的产量，无论是质量还是品质；增加的营养物获取和增加的代谢效率；用于建筑、纤维(组织)或加工的植物组织增强或改变的营养物组成；增加的工业加工实用性；增加的植物抗病性；增强的不良环境条件(非生物胁迫)耐受，所述不良环境条件包括但不仅限于干旱、过冷、过热、或过量的土i裏盐度或极端^或M;和植物结构或发育中的改变，包括发育时间的改变。通过转基因或非转基因手段鉴定的这类性状基因的运用可以为了森林学的利益显著地改良森林植物。作物性状功能基因组学(croptraitfunctionalgenomics)的目的是鉴定作物性状基因，即能够在作物植物中赋予有用的农业性状的基因。这类农业性状包括但不仅限于增加的产量，无论是质量还是品质；增加的营养物获取和增加的代谢效率；用于食品、饲料或加工的植物组织增强或改变的营养物组成；增加的农业或工业加工实用性；增加的植物抗病性；增强的不良环境条件(非生物胁迫)耐受，所述不良环境条件包括但不仅限于干旱、过冷、过热、或过量的土壤盐度或极端g或M;和植物结构或发育中的改变，包括发育时间的改变。通过转基因或非转基因手段鉴定的这类性状基因的运用可以为了农业的利益显著地改良作物植物。对人和动物消耗而言，谷物均是地球上最重要的作物植物。在稻、玉米、小麦、大麦、棵麦、燕麦和其他农业重要的单子叶植物中观察到遗传同线性(大染色体区段内基因顺序的保守)，这有助于以单个谷物基因的序列为1^出对来自不同谷物物种的直向同源基因进行绘图和分离。稻在谷物中具有最小(420Mb)的基因组，并且近期是公众和私人的基因组测序与EST测序努力的主要焦点。为了在稻[小麦基因组中鉴定控制[性状的作物性状基因，以一种或多种功能基因组方法为基础对来自稻基因组草图[小麦EST数据库的基因进行优先顺序处理(prioritize)。例如，4吏用净皮稻稻瘟菌(Magnaporthegrisea)感染的稻植物的全基因组表达研究对控制疾病抗性的候选基因进行优先顺序处理。然后可以以稻全基因组序列的分析为基础，预测稻性状基因候选者的全长和部分cDNA,并使用可商业获得的PCR引物挑选程序通过设计和使用PCR扩增引物将其分离。引物被用于从稻cDNA文库或第一链cI)NA中PCR扩增全长或部分cDNA。使用植物分子遗传学方法将得自任一方法的cDNA克隆用于构建载体，所述载体被设计为改变这些基因在转基因植物中的表达，所述分子遗传学方法在下文详述。通过在转基因植物中超量表达或低表达关键性状基因来改变植物表型是对植物基因指定功能的一种有力和确定的方法。鉴定具有改变的目的性状的转基因植物的实验被用于明确地指定这些基因用于通过转基因方法或经典育种方法改良稻(并扩展至其他谷物)的实用性。II.cI)NA的鉴定、克隆和测序42本发明cDNA的克隆和测序在实施例1中描述。本发明的分离的核酸和蛋白质可在大范围的植物、棵子植物、单子叶植物和双子叶植物中使用，尤其是在单子叶植物如稻、小麦、大麦和玉米中^f吏用。在一个更特别的实施方案中，单子叶植物是谷物。在一个更特别的实施方案中，谷物可以是例如玉米、小麦、大麦、燕麦、棵麦、粟、高粱、黑小麦、黑麦、单粒小麦、斯佩耳特小麦、双粒小麦、画眉草、蜀黍、亚麻、格兰马草、磨擦草属物种或类蜀粟。在一个最特别的实施方案中，谷物是稻。其他植物的属包括，但不仅限于南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、Gragaria、百乐M艮属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠痴属(Atropa)、辣丰权属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、花薄荷属(Majorana)、菊苣属(Cichorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panie画)、狼尾草属(Penniset腿)、毛K属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、香瓜属(Cucumis)、Browaalia、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(PhaseoIus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(()ryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。本发明还提供了对包含本发明核酸分子的植物或植物部分进行基因分型的方法。任选地，该植物是单子叶植物，例如但不仅限于稻或小麦。基因分型提供了区分染色体对同源物的手段，并可用于在植物种群中区分分离体。分子标记物方法可用于系统发生研究，表征作物变种间的亲缘关系，鉴定杂交种或体细胞杂种(somatichybrid),定位影响单基因性状的染色体43区段，图位克隆，和研究定量的遗传(参见PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,第7章，Clark编著，Springer-Verlag，Berlin1997;Paterson，A.H.，"TheDNARevolution",GenomeMappinginPlants中的第2章，Paterson,A.H.编著，Academic出版/R.GLandsCo.,Austin,Texas1996)。基因分型方法可使用任何数量的分子标记物分析技术，例如但不仅限于限制长度多态性(RFLP)。如本领域所公知的，RFLP由DNA限制片段长度中的差异产生，所述差异得自相同基因的等位基因之间的核苷酸差异。因此，本发明提供了以下通过使用RFLP分析分离本发明的基因或核酸或遗传上连锁的染色体序列的方法。连锁的染色体序列在本发明核酸的50厘摩(50cM)内，40或30cM内，特別地在20或10cM内，更特别地在5、3、2或1cM内。III.目的'性状本发明包括编码下述蛋白质的多核苷酸的鉴定和分离，所述蛋白质涉及氮利用、花色素苷生物合成和木质素生物合成。改变与这些性状相关的基因的表达能够用于根据期望改良或修饰植物、木材和/或谷物。实施例描述了分离的目的基因，和分析表达改变及其对植物特征的影响的方法。本发明的一个方面提供了用于改变(即提高或降低)本发明的核酸分子和多肽在植物中的水平的组合物和方法。具体地，本发明的核酸分子和多肽被组成型地、时间或空间(例如在发育阶段、某些组织中和/或以一定数量)地表达，这对于非重组改造的植物是不典型的。因此，本发明提供了在这类示范性应用中改变上文鉴定的特定特征的实用性。VI.在转基因植物中控制基因表达本发明还涉及包含核酸分子的转化的细胞、转化的植物、种子和植物部分，和通过改变本发明基因的表达来修饰目的表型性状的方法。A,修饰编码序列和相邻序列来自异源来源的基因在植物中的转基因表达可涉及对这些基因的修饰，以达到和最优化其在植物中的表达。具体地，在植物中在独立的转录物上表达下述细菌ORF是最佳的，所述细菌ORF编码独立的酶但是由天然微生物中同一转录物编码。为了达成该目的，将各微生物ORF各自分离并克隆在盒中，所述盒在ORF的5'末端提供;f直物启动子序列并在ORF的3，末端提供植物转录终止子。分离的ORF序列特别包含起始ATG密码子和终止STOP密码子，但是可包含除起始ATG和终止STOP密码子之外的额外序列。另外，ORF可以是截短的，但仍然保留所需的活性；对尤其长的ORF而言，保留活性的截短的版本对于在转基因生物中表达可以是优选的。"植物启动子，，和"植物转录终止子"旨在表示在植物细胞中工作的启动子和转录终止子。这包括可来自非植物来源如病毒(一个实例是花椰菜花叶病毒)的启动子和转录终止子。在一些情况下，对ORF编码序列和相邻序列的修饰不是必需的。分离含目的ORF的片段并将其插入植物启动子下游就是足够的。例如，Gaffncy等(Science261:754-756(1993))在转基因植物中成功地表达了位于CaMV35S启动子和CaMVtml终止子控制下的假单胞杆菌(Pseudomonas)nahG基因，而未修饰编码序列，且假单胞菌基因ATG上游的核苷酸和STOP密码子下游的核苷酸仍然与nahGORF相连。特别地，应该留下尽可能少的相邻微生物序列连接在ATG上游和STOP密码子下游。事实上，这类构建可取决于限制性位点的可用性。在其他情况下，来自微生物来源的基因的表达可在表达中产生问题。这些问题已在本领域中充分表征，并且对来自某些来源如芽孢杆菌(Bacillus)的基因而言尤其常见。这些问题可适用于本发明的核苷^列，且这些基因的修饰可使用本领域目前公知的技术进行。可遇到以下的问题l.密码子选择。植物中特定的密码子选择与某些^:生物中特定的密码子选择不同。将克隆的微生物ORF中的密码子选择与植物基因(尤其是来自耙植物的基45因)中的选择进行比较，会使得能够识别ORF中应当被特别改变的密码子。通常，植物进化趋向于在单子叶植物的第三个碱基位置中对核苷酸C和G的有力偏好，而双子叶植物常在该位置使用核苷酸A或T。通过修饰基因以掺入具体靶转基因物种的特定密码子选择，会解决下文所述关于GC/AT含量和不合理剪接的许多问题。2.GC/AT含量。植物基因通常具有多于35°/。的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列能够在植物中引起若千问题。首先，ATTTA基序被认为引起信号的去稳定化并存在于在许多短寿命mRNA的3，末端。其次，多腺苷酸化信号如AATAAA在信息中不适当位置的发生被认为引起转录的过早截断。另外，单子叶植物可将富含AT的序列识别为剪接位点(见下文)。3.与起始的曱硫氨酸相邻的序列。植物与微生物的区别在于其信息不具有确定的核糖体结合位点。更确切地说，认为核糖体与信息的5，末端结合并扫描第一个可获得的ATG，在这里开始翻译。然而，认为存在对与ATG相邻的某些核苷酸的偏好，并且可通过在ATG处包含真核生物共有的翻译起始子来增加^^生物基因的该表达。Clontech(1993/1994目录，第210页，引入本文作为参考)提出一条序列作为大肠杆菌uidA基因在植物中表达的共有翻词，起始子。另外，Joshi(N.A.R.15:6643-6653(1987)，引入本文作为参考)比较了与ATG相邻的许多植物序列，并提出另一共有序列。在植物中表达微生物ORF时遇到困难的情况下，在起始ATG处包含这些序列中的一条可促进翻译。在这些情况下，共有序列的最后三个核苷酸可由于其对第二个AA残基的修饰而不适合包含在修饰的序列中。与起始甲硫氨酸相邻的特定序列可在不同的植物物种间不同。对位于GenBank数据库中14个玉米基因的调查提供了以下的结果14个玉米基因中起始ATG前的位置_10-9-8-7-6-5-4-3-2-1C38462560107T3034321110A2314323723G6360654615可对核苷酸要掺入其中的期望的植物物种和为了掺入特定核苷酸而被修饰的与ATG相邻的序列进行该分析。4.去除不合理的剪接位点。从非植物来源克隆并且未针对在植物中表达进行最优化的基因也可含有在植物中被识别为5'或3，剪接位点并被切割的基序，因此产生截短的或删除的信息。可使用本领域公知的技术去除这些位点。修饰编码序列和相邻序列的技术是本领域公知的。在微生物ORF的原始表达低并认为如上文所述改变序列是合适的的情况下，可根据本领域公知的方法完成合成基因的构建。这些方法例如描述于公开的专利公开文本EP0385962(属于Monsanto)、EP0359472(属于Lubrizol)和WO93/07278(属于Ciba-Gdgy)中，其均引入本文作为参考。在大部分情况下，优选使用瞬时测定方案(这是本领域公知的)在基因构建体转移至转基因植物之前测定其表达。B.构建植物表达盒旨在在转基因植物中表达的编码序列首先被装配在表达盒中的可在植物中表达的合适启动子之后。该表达盒也可包含转基因表达所需或选择的任何其他序列。这类序列包括但不限于转录终止子、增加表达的外来序列如内含子、关键序列(vitalsequence),和旨在将基因产物靶向特定细胞器和细胞区室的序列。然后可将这些表达盒容易地转移至下文所述的植物转化载体。以下描述了典型的表达盒的多种组件。l.启动子用于表达盒中的启动子的选择会确定转基因在转基因植物中的空间和时间表达模式。选择的启动子会在特异的细胞类型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)或在特异的组织或器官(例如才艮、叶或花)中表达转47基因，且该选择会反映期望的基因产物累积位置。或者，选择的启动子可驱动基因在不同的诱导^H牛下表达。启动子的强度(即启动转录的能力)不同。根据使用的宿主细胞体系，可使用大量合适启动子之任一，包括基因固有的启动子。以下是可用于表达盒中的启动子的非限制性实例。a.组成型表达，遍在蛋白启动子遍在蛋白是已知在许多细胞类型中累积的基因产物，且其启动子从若干物种中被克隆用于在转基因植物中使用(例如向日葵-Binet等，PlantScience79:87-94(1991);玉米-Christensen等，PlantMolec.Biol.12:619-632(1989);和拟南芥-Callis等，J.Biol.Chem.265:12486-12493(1990)和Norris等，PlantMol，Biol.21:895-906(1993))。已在转基因单子叶植物体系中个开发了玉米遍在蛋白启动子，并且其构建用于单子叶植物转化的序列和载体在专利公开EPO342926(属于Lubrizol)中公开，该文献引入本文作为参考。Taylor等(PlantCellRep.12:491-495(1993))描述了包含玉米遍在蛋白启动子和第一内含子的载体(pAHC25)，以及通过微粒轰击被引入后其在大量单子叶生物细胞悬浮液中的高活性。对于用于本发明核苷#列，拟南芥遍在蛋白启动子是理想的。遍在蛋白启动子适用于在转基因植物(单子叶植物和双子叶植物二者)中的基因表达。合适的载体是pAHC25的衍生物或该申请中描述的任何转化载体，其通过引入适当的遍在蛋白启动子和/或内含子序列被修饰。b.组成型表达，CaMV35S启动子质粒pCGN1761的构建描述于公开的专利申请EP0392225(实施例23)中，该文献引入本文作为参考。pCGN1761含有"双，，CaMV35S启动子和tml转录终止子，在启动子和终止子之间具有特有的EcoRI位点，并具有pUC-型主链。构建了具有^"饰的多接头的pCGN1761的f汴生物，其除了已有的EcoRI位点外还包含NotI和XhoI位点。该衍生物被命名为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX适用于为了在转基因植物中在35S启动子的控制下表达的目的，在其多接头内克隆cDNA序列或编码序列(包括微生物ORF序列)。这类构建体的整个35S启动子-编码序列-tml终止子盒可通过启动子5，的HindIII、Sphl、Sail和Xbal位点和终止子，3的Xbal、BamHI和BglI位点切割用于转移至转化载体，如下文所述的转化栽体。另外，可通过HindIII、Sphl、Sall、Xbal或Pstl的5'切割或任何多接头限制性位点(EcoRI、NotI或XhoI)的3'切割去除双35S启动子片段，用于置换另一启动子。如果期望的话，可通过引入可增加翻译的序列在克隆位点附近进行修饰。这尤其适用于期望超量表达时。例如，可通过如美国专利No.5,639,949的实施例37所述最优化翻译起点来修饰pCGN1761ENX,所述文献引入本文作为参考。c.组成型表达，肌动蛋白启动子已知若干种肌动蛋白同种型在大部分细胞类型中表达，因此肌动蛋白启动子是组成型启动子的良好选择。具体地，已克隆和表征了来自稻Actl基因的启动子(McElroy等，PlantCell2:163-171(19卯))。发现启动子的1.3kb片段含有在稻原生质体中表达所需的所有调节元件。另外，已构建了基于Actl启动子的大量表达载体，它们尤其用于单子叶植物(McElroy等，Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))。这些载体整合了Actl-内含子1、Adhl5，侧翼序列和Adhl-内含子l(来自玉米醇脱氢酶基因)和来自CaMV35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S与Actl内含子或Actl5，侧翼序列与Actl内含子的融合物。(GUS报告子基因)起始ATG附近序列的最优化也增加了表达。McElroy等(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))所述的启动子表达盒可被容易地修饰用于基因表达，并尤其适合在单子叶植物宿主中使用。例如，从McElroy构建体中取出含启动子的片段并用于置换pCGN1761ENX中的双35S启动子，然后所述pCGN1761ENX可用于插入特异的基因序列。然后可将由此构建的融合基因转移至适当的转化栽体。在独立的报道中，也发现稻Actl启动子与其第一个内含子指导在培养的大麦细胞中的高表达(Chibbar等，PlantCellRep.I2:506-509(1993))。d.诱导性表达，PR-1启动子pCGN1761ENX中的双35S启动子可用选择的任何另一启动子代替，49所述另一启动子会导致适当的高表达水平。举例而言，美国专利No.5,614,395中所述的可化学调节的启动子之一(如烟草PR-la启动子)可代替双MS启动子。或者，可使用Lebel等，PlantJ.16:223-233(1998)中所述的拟南芥PR-1启动子。通过限制性酶将选择的启动子从其来源特异切割，但是也可以使用带有适当末端限制性位点的引物进行PCR扩增从而从其来源特异切割。要进行PCR-扩增时，应当在靶栽体中克隆扩增的启动子之后对启动子再测序以检验扩增错误。将可化学/病原体调节的烟草PR-la启动子从质粒pCIB1004(用于构建体，见EP0332104的实施例21，该文献引入本文作为参考)中切割并转移至质粒pCGN1761ENX(Uknes等，PlantCell4:645-656(1992))。用Ncol切割pCIB1004，并通过用T4I)NA聚合酶处理使得到的线性片段的3'突出端成为平端。然后用HindIII切割该片段，对得到的含PR-la启动子片段进行凝胶纯化并克隆进pCGN1761ENX中，所述pCGN1761ENX已去除了双35S启动子。这如下完成用Xhol切割并用T4聚合酶变平端，然后用HindIII切割，并分离含较大载体-终止子的片段，pCIB1004启动子片段被克隆进上述片段中。这产生了pCGN1761ENX衍生物，其具有PR-la启动子和tml终止子和具有特有的EcoRI和Notl位点的插入多接头。可向该载体中插入选择的编码序列，随后将融合产物(即启动子-基因-终止子)转移至任何选择的转化载体，包括下文所述的转化载体。可使用多种化学调节剂在根据本发明转化的植物中诱导选择的编码序列表达，所述化学调节剂包括美国专利第5,523,311号和第5,614,395号中公开的苯并噻二唑、异烟酸和水杨酸化合物。e.诱导性表达，乙醇诱导性启动子也可使用可由某醇或酮(如乙醇)诱导的启动子赋予本发明编码序列的诱导性表达。这样的启动子例如为来自无冠构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的alcA基因启动子(Caddick等，(1998)Nat.Biotechnol16:177-180)。在构巢曲霉中，alcA基因编码醇脱氢酶I，其表达在存在化学诱导剂时由AlcR转录因子调节。就本发明的目的而言，将质粒palcA:CAT中的CAT编码序列替换为本发明的编码序列，以形成编码序列处于alcA基因启动子控制下的表达盒，所述质粒palcA:CAT包含与最小35S启动子融合的alcA基因启动子序列(Caddick等，(1998)Nat.Biotcchnol16:177-180)。这4吏用本领域>^知的方法完成。f.诱导性表达，糖皮质激素诱导性启动子还涉及使用基于类固醇激素的系统诱导本发明核*列的表达。例如，使用糖皮质激素介导的诱导体系(Aoyama和Chua(1997)ThePlantJournal11:605-612)并通过应用糖皮质激素诱导基因表达，所述糖皮质激素例如是合成的糖皮质激素，特别是地塞米松，特别是以O.lmM到lmM，更特别是从10mM到100mM范围内的浓度。就本发明的目的而言，用本发明的核酸序列代替萤光素酶基因序列，形成本发明的核酸序列处于与35S最小启动子融合的六拷贝GAL4上游激活序列的控制下的表达盒。这使用本领域公知的方法完成。反式作用因子包括与疱疹病毒蛋白VP16(Triezenberg等，(1988)GenesDevel.2:718-729)融合的GAL4DNA-结合结构域(Keegan等，(1986)Science231:699-704),所述疱疹病毒蛋白VP16与大鼠糖皮质激素受体的激素结合结构域融合(Picard等，(1988)Cell54:1073-1080)。融合蛋白的表达由本领域已知的或本文所述的启动子控制。该表达盒还包含在下述植物中，所述植物包含与6xGAL4/最小启动子融合的本发明的核酸序列。因此，融合蛋白的组织特异性或器官特异性的实现，导致杀虫毒素的可诱导的组织或器官特异性。g.根特异表达另一种基因表达模式是根表达。合适的根启动子是由deFramond(FEBS290:103-106(1991))和美国专利第5,466,785号所述的玉米金属硫蛋白样(MTL)基因启动子，所述文献引入本文作为参考。将该"MTL"启动子转移至用于插入选定基因的合适载体如pCGN1761ENX,并随后将整个启动子-基因-终止子盒转移至目的转化载体。h.创伤诱导性启动子创伤诱导性启动子也适用于基因表达。已描述了大量这类启动子(例如Xu等，PlantMolec.Biol.22:573-588(1993)，Logemann等，PlantCell1:151-158(1989)，Rohrmeier&Lehle，PlantMolec.Biol.22:783-792(1993)，Firek等,PlantMolec.Biol.22:129-142(1993)，Warner等，PlantJ.3:191-201(1993))且其均适用于本发明。Logemann等描述了双子叶马铃薯wiml基因的5'上游序列。Xu等显示来自双子叶植物马铃薯的创伤诱导性启动子(pin2)在单子叶植物稻中有活性。另外，Rohrmeier&Lehle描述了使用标准技术克隆玉米WiplcDNA，该cDNA是创伤诱导的并可用于分离同族(cognate)启动子。类似地，Firek等，和Warner等描述了来自单子叶植物石刁柏(Asparagusofficinalis)的创伤诱导基因，该基因在局部创伤和病原体侵入位点表达。使用本领域公知的克隆技术，可将这些启动子转移至合适的载体，与关于本发明的基因融合，并用于在植物创伤位点表达这些基因。i.髓特异表达专利申请WO93/07278描述了优先在髓细胞中表达的玉米trpA基因的分离，该文献引入本文作为参考。提出了扩展至转录起点-n^bp的基因序列和启动子。使用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移至载体如pCGN1761，其中该启动子能够替换35S启动子，并用于驱动外源基因以髓特异的方式表达。事实上，含有髓特异启动子或其部分的片段可被转移至任何载体，并针对在转基因植物中的实用性进行修饰。j.叶特异表达Hudspeth&Grula(PlantMolecBiol12:579-589(1989))已描述了编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用标准分子生物学技术，可使用该基因的启动子驱动任何基因以叶特异的方式在转基因植物中表达。k.花粉特异表达WO93/07278描述了玉米钙依赖性蛋白激酶(CDPK)基因的分离，该基因在花粉细胞中表达。基因序列和启动子扩展至从转录起点"00bp。使用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移至载体如pCGN1761，其中该启动子能够替换35S启动子，并用于驱动本发明的核52酸序列以花粉特异的方式表达。2.转录终止子可获得大量在表达盒中使用的转录终止子。它们负责终止超出转基因的转录并校正mRNA多聚腺苷酸化。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcSE9终止子。其可用于单子叶植物和双子叶植物。另外，可使用基因的固有转录终止子。3.用于增加或调节表达的序列发现来自转录单位内的大量序列增加基因表达，并且这些序列可与本发明的基因组合使用，提高本发明的基因在转基因植物中的表达。多种内含子序列已显示增加表达，尤其是在单子叶植物细胞中。例如，发现当引入玉米细胞中时，玉米Adhl基因的内含子显著增加位于其同族启动子下的野生型基因的表达。发现内含子l是尤其有效的，并在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中增加表达(Callis等，GenesDevelop.1:1183-1200(1987))。在相同的实验体系中，来自玉米bronzel基因的内含子具有类似的增加表达的效果。内含子序列已被常规地整合进植物转化载体中，通常在非翻译的前导区内。也已知来自病毒的大量非翻译前导序列增加表达，并且它们在双子叶植物细胞中尤其有效。特别地，来自烟草花叶病毒(TMV，"W-序列")、玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已显示有效增加表达(例如Gallie等，Nucl.AcidsRes.15:8693-8711(1987);Skuzeski等，PlantMolec.Biol.15:65-79(19卯))。本领域已知的其他前导序列包括但不仅限于小核糖核酸病毒前导区，例如EMCV前导区(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein，O.、Fuerst，T.R.和Moss,B.PNASUSA86:6126-6130(1989));马铃薯Y病毒(potyvirus)前导区，例如TEV前导区(烟草蚀斑病毒)(Allison等，I986);MDMV前导区(玉米矮花叶病毒)；Virology154:9-20);人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导区(Macejak，D.G.和Sarnow,P.,Nature353:90-94(1991));来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白53mRNA(AMVRNA4)的非翻译前导区(Jobling，S.A.和Gehrke，L.，Nature325:622-625(1987));烟草花叶病毒前导区(TMV)，(Gallie，D.R.等，MolecularBiologyofRNA，第237-256页(1989));和玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)前导区(Lommel，S.A.等，Virology81:382-385(1991))。还参见I)dla画Cioppa等，PlantPhysiology84:965-968(1987)。除了将一个或多个上述元件整合进本发明的乾表达盒的5，调节区内以外，也可整合乾表达盒特有的其他元件。这类元件包括但不仅限于最小启动子。最小启动子旨在表示无上游激活时是无活性的或几乎无活性的基本启动子元件。当不存在反式作用子或当不存在增强子或应答元件结合位点时，这样的启动子在植物中具有低背景活性。尤其适用于植物中乾基因的一种最小启动子是Bzl最小启动子，其得自玉米的bronzel基因。该Bzl核心启动子通过在位于-53和-58的Nhel位点切割，得自"myc"突变体Bzl-萤光素酶构建体pBzlLucR98。Roth等，PlantCell3:317(1991)。衍生的Bzl核心启动子片段因此从-53扩展至+227，并在5'非翻译区包含Bzl内含子-1。还适用于本发明的是通过使用合成的TATA元件创建的最小启动子。该TATA元件允许RNA聚合酶因子识别启动子，并在不缺失激活时赋予基底水平的基因表达(一般参见Mukumoto(1993)PlantMolBiol23:995-1003;Green(2000)TrendsBiochemSci25:59-63)。4.基因产物在细胞内的靶向已知在植物中存在靶向基因产物的多种机制，并且已较详细地表征了控制这些机制功能的序列。例如，基因产物到叶绿体的靶向由存在于多种蛋白质氨基端的信号序列控制，该信号序列在叶绿体输入时被切割，产生成熟的蛋白质(例如Comai等，J.Biol.Chem.263:15104-15109(1988))。这些信号序列可与异源基因产物融合，影响异源产物进入叶绿体的输入(vandenBroeck等，Nature313:358-363(1985))。编码适当信号序列的I)NA可从下述cDNA的5，端分离，所述cDNA编码RUBISCO蛋白质、CAB蛋白质、EPSP合酶、GS2蛋白质和已知定位于叶绿体的许多其他蛋白质。还参见美国专利第5,639,949号的实施例37中题为"ExpressionWithChloroplastTargeting，，的部分。其他基因产物定位于其他细胞器如线粒体和过氧化物酶体中(例如Unger等，PlantMolec.Biol.13:411-418(1989))。也可利用编码这些产物的cl)NA影响异源基因产物到这些细胞器的靶向。这类序列的实例是核编码的ATP酶和线粒体特异的天冬氨酸氨基转移酶同种型。靶向细胞蛋白质体已由Rogers等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6512-6516(1985)描述。另外，已^^征了引起基因产物靶向到其他细胞区室的序列。氨基端序列负责到ER、质外体的靶向和从糊粉细胞的胞外分泌(Koehler&Ho，PlantCell2:769-783(19卯))。另外，氨基端序列与氣基端序列组合负责基因产物的液泡孝巴向(Shinshi等，PlantMolec.Biol.14:357-368(19卯)。通过将上述适当的靶向序列与目的转基因序列融合，可能指导转基因产物去往任何细胞器或细胞区室。对叶绿体靶向而言，例如将来自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的叶绿体信号序列与转基因的氨基端ATG融合。选择的信号序列应包括已知的切割位点，构建的融合物应考虑切割所需的切割位点后的任何氨基酸。在一些情况下，可通过在切割位点和转基因ATG之间添加少量氨基酸，或者通过替换转基因序列中的一些氨基酸来满足该需要。可如下测试针对叶绿体输入构建的融合物的叶绿体吸收效率将体外转录的构建体体外翻译，然后使用Bartlett等，在Edelmann等(编著)MethodsinChloroplastMolecularBiology,Elsevier,第1081-1091页(1982)和Wasmann等，Mol.Gen.Genet.205:446-453(1986)中所述的技术进行体外叶绿体吸收。这些构建技术是本领域公知的，并同样适用于线粒体和过氧化物酶体。分子靶向的上述机制不仅可与其同族启动子组合使用，而且也可以与异源启动子组合使用，从而完成在启动子的转录调节下特异的细胞靶向目标，所述启动子具有与靶向信号来源的启动子不同的表达才莫式。C.构建植物转化栽体可用于植物转化的大量转化载体是植物转化领域的普通技术人员已知的，并且与本发明有关的这些基因可与任何这类载体组合使用。载体的选择应取决于特异的转化技术和转化的靶物种。对某些耙物种而言，不同的抗生素或除草剂选择标记物可以是特异的。转化中常规使用的选择标记物包括赋予卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因(Messing&Vierra.Gene19:259-268(1982);Be糧等，Nature304:184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等，Nucl.AcidsRes18:1062(19卯)，Spencer等，Theor.Appl.Genet79:625-631(19卯))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger&Diggelmann,MolCellBiol4:2929-2931)、和赋予对甲氨蝶呤(methatrexate)抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBOJ.2(7):1099-1104(1983))、赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利第4，940，935号和第5,188,642号)和提供代谢甘露糖的能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因(美国专利第5,767,378号和第5,994,629号)。l.适用于农杆菌(Agrobacterium)转化的载体许多载体可用于4吏用才艮瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的转化。这些栽体通常带有至少一个T-DNA边界序列并包括载体如pBINl9(Bcvan，Nucl.AcidsRes.(1984))。下文描述了适用于农杆菌转化的两种典型载体的构建。a.pCIB200和pCIB2001:二元载体pCIB200和pCIB2001用于构建与农杆菌一起使用的重组载体，并以如下方式构建。如下创建pTJS"kan:Narl消化pTJS75(Schmidhauser&Helinski,，1.Bacteriol.164:446-455(1985))，该消化允许切除四环素抗性基因，然后插入来自pUC4K的带有NPTII的Accl片段(Messing&Vierra，Gene19:259-268(1982):Bevan等，Nature304:184-187(1983):McBride等，PlantMolecularBiology14:266-276(19卯))。将Xhol接头与PCIB7的EcoRV片段连接，所述EcoRV片段含有左侧和右侧T-DNA边界、植物可选择的nos/nptll嵌合基因和pUC多接头(Rothstein等，Gene53:153-161(1987))，并将Xhol-消化的片段克隆进SalI-消化的pTJS75kan中，创建pCIB200(也见EP0332104，实施例19)。56pCIB200含有以下的特有多接头限制性位点EcoRI、Sstl、Kpnl、BglII、Xbal和Sall。pCIB2001是通过向多接头中插入额外的限制性位点创建的pCIB200的衍生物。pCIB2001多接头中特有的限制性位点是EcoRI、Ss仏Kpnl、BglII、Xbal、Sall、Mhil、Bcll、AvrII、Apal、Hpal和Stul。除了含有这些特有的限制性位点以外，pCIB2001还具有植物和细菌卡那霉素选择、用于农杆菌介导的转化的左侧和右側T-DNA边界、用于在大肠杆菌和其他宿主间流通的来自RK2的trfA功能，且OriT和OriV功能也来自RK2。pCIB2001多接头适用于克隆含有其自身调节信号的植物表达盒。b.pCIB10及其潮霉素选择衍生物二元载体pCIB10含有用于在植物中选择的编码卡那霉素抗性的基因和T-DNA右侧和左侧边界序列，并掺入来自广泛宿主范围质粒pRK252的序列，这允许其在大肠杆菌和农杆菌二者中复制。其构建由Rothstein等(Genc53:153-161(1987))描述。构建了pCIB10的多种衍生物，其掺入由Gritz等(Gene25:179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸转移酶基因。这些衍生物使得能够在只有潮霉素(pCIB743)时，或在潮霉素和卡那霉素(pCIB715，pCIB717)上选择转基因植物。2.适用于非农杆菌转化的载体不使用根瘤农杆菌的转化绕过了选择的转化载体中对T-DNA序列的需要，因此除了如上所述含有T-DNA序列的载体外可使用缺乏这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体吸收(例如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择主要取决于对被转化的物种的特异选择。下文描述了适用于非农杆菌转化的典型载体的构建。a.pCIB3064:pCIB3064是适用于直接基因转移技术的来自pUC的载体，所述直接基因转移技术与除草剂basta(或膦丝菌素)选择组合。质粒pCIB246包含与大肠杆菌GUS基因和CaMV35S转录终止子有效融合的CaMV35S启动子，并描述于PCT已7>开的申请WO93/07278中。该载体的35S启动子在起点5，含有两条ATG序列。以去除ATG并产生限制性位点Sspl和PvuII的方式使用标准PCR技术突变这些位点。新的限制性位点距离特有的Sail位点96和37bp，并距离真实的起点101和42bp。得到的pCIB246矛汴生物被称作pCIB3025。然后通过用SalI和SacI消化从pCIB3025中切除GUS基因，使末端变平端并重新连接，产生质粒pCIB3060。质粒pJIT82得自JohnInnesCentre,Norwich,切下含有来自绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的bar基因的400bpSmal片段并插入pCIB3060(Thompson等，EMBOJ6:2519-2523(1987))的Hpal位点中。这产生了pCIB3064,其包含处于CaMV35S启动子和终止子控制下的用于除草剂选择的bar基因、氨千青霉素抗性基因(用于在大肠杆菌中选择)和具有特有位点SphI、Pstl、HindIII和BamHI的多接头。该载体适用于克隆含有其自身调节信号的植物表达盒。b.pSOG19和pSOG35:pSOG35是一种转化载体，其利用大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DFR)作为赋予甲氨蝶呤抗性的可选择标记物。使用PCR扩增35S启动子、来自玉米Adhl基因的内含子6(-550bp)，和来自pSOG10的18bpGUS非翻译前导序列。还通过PCR扩增编码大肠杆菌II型二氢叶酸还原酶基因的250-bp片段，并将这两条PCR片段用来自pB1221(Clontech)的Sacl-Pstl片段装配，所述Sacl-Pstl片段包含pUC19载体主链和胭脂碱合酶终止子。这些片段的装配产生pSOG19，其含有与内含子6序列、GUS前导区、DHFR基因和胭脂碱合酶融合的35S启动子。用来自玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)的前导序列替换pSOG19中的GUS前导区，产生载体pS()G35。pSOG19和pSOG35带有氨苄青霉素抗性的pUC基因，并具有可用于克隆外源物质的HmdIII、Sphl、PstI和EcoRI位点。3.适用于叶绿体转化的载体为了在植物质体中表达本发明的核苷酸序列，使用质体转化载体pPH143(WO97/32011，实施例36)。将核苷酸序列插入pPH143中，从而替换PROTOX编码序列。然后将该栽体用于质体转化，并选择具有壮观霉素抗性的转化体。或者，将核苷酸序列插入pPH143中，使其替换aadH基因。在该情况下，针对PROTOX抑制剂抗性选择转化体。D.转化一旦本发明的核酸被克隆进表达体系内，将其转化进植物细胞中。可以通过大量本领域认可的方式将本发明的受体和靶表达盒引入植物细胞中。再生植物的方法也是本领域公知的。例如，Ti质粒载体已用于递送外源DNA,以及直接DNA吸收、脂质体、电穿孔法、显微注射和微粒。另外，来自农杆菌属的细菌可用于转化植物细胞。下文描述了转化双子叶植物和单子叶植物的代表性技术，以及代表性的质体转化4支术。l.双子叶植物的转化双子叶植物的转化技术是本领域公知的，并包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及原生质体或细胞对外源遗传材料的直接吸收。这可通过PEG或电穿孔介导的吸收、粒子轰击介导的递送或显孩i注射完成。这些技术的实例由Paszkowski等，EMBOJ3:2717-2722(1984)、Potrykus等，Mol.Gen,Genet.199:169-177(1985)、Reich等，Biotechnology4:1001-1004(1986)和Klein等，Nature327:70-73(1987)描述。在各情况下，使用本领域已知的标准技术将转化的细胞再生为整林植物。农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的特异技术，因为其转化的高效率和针对许多不同物种的广泛实用性。农杆菌转化通常涉及带有目的外来DNA的二元载体(例如pCIB200或pCIB2001)到适当农杆菌菌抹的转移，该转移可取决于宿主农杆菌菌株(例如对pCIB200和pCIBMOl而言是菌林CIB542(Uknes等，PlantCell5:159-169(1993))在共同存在的Ti质粒或染色体上带有的vir基因的互补物。通过三亲本交配步骤，使用带有重组二元栽体的大肠杆菌、辅助大肠杆菌菌林完成重组二元载体到农杆菌的转移，所述助手大肠杆菌菌林包含质粒如pRK2013并能够将重组二元载体移动至靼农杆菌菌抹。或者，可通过DNA转化将重组二元栽体转移至农杆菌(Hiifgen&Willmitzer，Nucl.AcidsRes.16:9877(1988))。59通过重组农杆菌转化乾植物物种常涉及农杆菌与来自植物的外植体的共同培养，并且遵循本领域公知的方案。在可选择培养基上再生带有抗生素或除草剂抗性标记物的转化的组织，所述标记物存在于二元质粒T-DNA边界之间。用基因转化植物细胞的另一途径涉及在植物组织和细胞中推进惰性或有生物学活性的颗粒。该技术在均属于Sanford等的美国专利第4,945,050号、第5,036,006号和第5，100，792号中公开。一般地，该步骤涉及在有效穿透细胞外表面并在其内部提供整合的条件下在细胞中推进惰性或生物学活性的颗粒。使用惰性颗粒时，可通过用含有期望基因的载体包裹颗粒而将载体引入细胞中。或者，可用载体包围靶细胞，使得载体通过颗粒的活跃(wake)被带入细胞中。也可向植物细胞组织中推进生物学活性颗粒(例如干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，分别含有想要引入的DNA)。2.单子叶植物的转化现在大部分单子叶植物物种的转化也已成为常规。特异的技术包括使用PEG或电穿孔技术将基因直接转移进入原生质体，和粒子轰击进入愈伤组织中。转化可用单个DNA物种或多种DNA物种(即共转化)进行，这两种技术均适用于本发明。共转化可具有下述优点避免完整载体构建和产生下述转基因植物，所述转基因植物中目的基因和可选择标记物是未连锁的基因座，使得能够在随后的世代中去除可选择标记物，这被认为是期望的。然而，使用共转化的缺点是独立的DNA物种被整合进基因组中的频率低于100。/。(Schocher等，Biotechnology4:1093-1096(1986))。专利申请EP0292435、EP0392225和WO93/07278描述了从玉米的良种自交系(eliteinbredline)制备愈伤組织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体，和从转化的原生质体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等，(PlantCell2:603-618(1990))和Fromm等，(Biotechnology8:833-839(1990))已公开了使用粒子轰击转化来自A188-的玉米才朱系的技术。另夕卜，WO93/07278和Koziel等，(Biotechnology11:194-200(1993))描述了通过粒子轰击转化玉米良种自交系的技术。该技术利用在授粉后天从玉米穗中切下的1.5-2.5mm长的未成熟玉米胚和Pl)S-1000He生物射弹设备用于轰击。稻的转化也可利用原生质体或粒子轰击通过直接基因转移技术进行。已针对Japonica-型和Indica-型描述了原生质体介导的转化(Zhang等，PlantCellRep7:379-384(1988);Shimamoto等，Nature338:274-277(1989);Datta等，Biotechnology8:736-740(19卯))。这两种类型常规地也可使用粒子轰击转化(Christou等，Biotechnology9:957-962(1991))。另夕卜，WO93/21335描述了通过电穿孔转化稻的技术。专利申请EP0332581描述了用于生产、转化和再生早熟禾亚科(Pooideae)原生质体的技术。这些技术允许转化鸭茅属(Dactylis)和小麦。另夕卜，Vasil等(Biotechnology10:667-674(1992))已描述了使用粒子轰击进C型长期可再生愈伤组织中的小麦转化，Vasil等(Biotechnology11:1553-1558(1993))和Weeks等(PlantPhysiol.102:1077-1084(1993))还描述了使用粒子轰击未成熟胚和来自未成熟胚的愈伤组织的小麦转化。然而，用于小麦转化的特异技术涉及通过粒子轰击未成熟胚转化小麦，并且在基因递送之前包括高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击之前，将任何数量的胚(长度为0.75-1mm)涂布于含3。/。蔗糖(Murashiga&Skoog，PhysiologiaPlantarum15:473-497(1962))和3mg/12,4-D的MS培养基上用于诱导体细胞胚，这允许在暗中继续。在选择的轰击日，将胚从诱导培养基上取下并置于渗压剂(即以期望浓度添加蔗糖或麦芽糖的诱导培养基，所述期望浓度通常为15。/。)上。允许胚质壁分离2-3小时，然后进行轰击。典型的是每个耙平板二十个胚，尽管不是必须的。使用标准步骤将带有适当基因的质粒(如pCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金颗粒上。使用~1000psi的爆发压，使用标准80筛目，用DuPontBiolistics⑧氦设备轰击各个胚平板。在轰击后，将胚放置回暗中并恢复约24小时(仍然在渗压剂上)。24小时后，将胚从渗压剂上取出并;^文回诱导培养基上，在那里保持一个月后再生。约一个月后，将具有发育中胚胎发生愈伤組织的胚外植体转移至再生培养基(MS+1mg/升NAA,5mg/升GA)，所述再生培养基还含有适当的选择剂(在pCIB3064的情况下为10mg/1basta，在pSOG35的情况下为2mg/1曱氨蝶呤)。约一个月后，将发育的茎转移至已知为"GA7s"的更大无菌容器中，所述容器含有半浓度MS、2。/。蔗糖和相同浓度的选择剂。还描述了使用农杆菌对单子叶植物的转化。见WO94/00977和美国专利第5,591,616号，均引入本文作为参考。还参见Negrotto等，PlantCellReports19:798-803(2000)，其引入本文作为参考。对该实例而言，使用稻(Oryzasativa)产生转基因植物。可使用多种稻栽培种(Hiei等，1994，PlantJournal6:271-282;Dong等，1996，MolecularBreeding2:267-276;Hiei等，1997，PlantMolecularBiology,35:205-218)。另外，下文所述的多种培养基组分可在数量上变化或被取代。通过在MS-CIM培养基(MS基础盐，4.3g/升；B5维生素(200x)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解产物，300mg/升；2，4-D(1mg/ml)，2m1/升；用1NKOH调节pH至5.8;Phytagel,3g/升)上起始胚胎发生应答和/或从成熟的胚建立培养物。接种培养物应答起始阶段的成熟胚或确立的培养物林系，并与含有期望的栽体构建体的根瘤农杆菌菌林LBA4404(农杆菌属)共同培养。在28。C将来自于甘油储存液的农杆菌在固体YPC培养基(100mg/L壮观霉素和任何其他适当的抗生素)上培养2天。将农杆菌重悬于液体MS-CIM培养基中。将农杆菌培养物稀释至OD600为0.2-0.3并添加乙酰丁香酮至200fiM的终浓度。在溶液与稻培养物混合之前添加乙酰丁香酮，以诱导农杆菌将DNA转移至植物细胞。为了接种，将植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除液体细菌悬浮液，将接种的培养物置于共同培养培养基上并在22。C孵育两天。然后将培养物转移至含替卡西林(400mg/升)的MS-CIM培养基上以抑制农杆菌的生长。对使用PMI可选择标记物基因的构建体(Reed等，InVitroCell.Dev.Biol.-Plant37:127-132)而言，在7天后将培养物转移至含甘露糖作为糖类来源的选择培养基(含2。/。甘露糖、300mg/升替卡西林的MS),并在暗中培养34周。然后将抗性菌落转移至再生诱导培养基(不含2，4-D，含0.5mg/升IAA、1mg/升玉米素、200mg/升特美汀、2。/。甘露糖和3%山梨糖醇的MS)，并62在暗中培养14天。然后将增殖的菌落转移至另一轮再生诱导培养基，并移至光照培养室。将再生的茎转移至含GA7-1培养基(不含激素并含有2%山梨糖醇的MS)的GA7容器中保持2周，然后当它们足够大并具有足够的根时移至温室。将植物在温室中移植至土壤(T0世代)，生长至成熟，并收获T1种子。3.质体的转化将珊西烟(Nicotianatabacumc.v.'Xanthinc，)的种子在T琼脂培养基上以l，，的环形阵列每盘七粒播种在T琼脂培养基上，并在播种后12-14天用1^im鴒颗粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轰击，所述颗粒如(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS卯，913—917)所述主要用来自质粒pPH143和pPH145的I)NA包裹。将轰击的幼苗在T培养基上孵育两天，之后切下叶，并远轴向上置于光明中(350-500pmol光子/m2/s)含500照/ml盐酸壮观霉素(Sigma，St.Louis,MO)的RMOP培养基平板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(19卯)PNAS87，8526—8530)。将轰击后三到八周在漂白的叶下出现的抗性茎亚克隆至相同的选择培养基上，允许形成愈伤组织，并对次生茎进行分离和亚克隆。通过Southern印迹的标准才支术(Sambrook等，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor)评价独立的亚克隆中转化的质体基因组拷贝(同质性)的完全分离。在1%Tris-硼酸盐(TBE)琼脂糖凝胶上分离BamHI/EcoRI-消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)PlantMolBiolReporter5，346"349)，转移至尼龙膜(Amersham)并用3￥-标记的随机引物DNA序列作为探针检测，该序列对应于0.7kbBamHI/HindlllDNA片段，所述片段来自含有部分rps7/12质体靶向序列的pC8。使同质性茎在含壮观霉素的MS/IBA培养基(McBride，K.E.等，(1994)PNAS91，7301-7305)上无菌生根，并转移至温室。V.育种和种子产生A.育种通过用本发明的核酸序列转化获得的植物可以是大量植物物种中任一，包括单子叶植物和双子叶植物；然而，本发明方法中使用的植物特别地选自上文公开的具有农业重要性的靶作物。本发明基因的表达与具有生产和品质重要性的其他特征组合，可通过育种整合进植物中。育种方法和技术是本领域已知的。参见例如Welsh丄R.，FundamentalsofPlantGeneticsandBreeding,JohnWiley&Sons,NY(1981》CropBreeding,WoodD.R.(编著)AmericanSocietyofAgronomyMadison,Wisconsin(1983》MayoO.，TheTheoryofPlantBreeding,第二版，Clarendon出版，Oxford(1987);Singh,D.P"BreedingforResistancetoDiseasesandInsectPests,Springer-Verlag，NY(1986);和Wricke和Weber，QuantitativeGeneticsandSelectionPlantBreeding,WalterdeGruyter和Co.,Berlin(1986)。操作进入上述转基因种子和植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长传递，并因此可在后代植物中保留和繁殖。一般地，所述保留和繁殖利用被开发为适应特定目的的已知农业方法，例如耕耘、播种或收获。也可以使用专门化的方法如水培法或温室技术。因为生长中的作物容易受到由昆虫或感染引起的攻击和损伤以及与杂草植物的竟争，所以采取手段控制杂草、植物疾病、昆虫、线虫和其他不利条件以提高产量。这些包括机械手段如耕耘土i裏或去除杂草和感染的植物，以及应用农药如除草剂、杀真菌剂、杀配子剂、杀线虫剂、生长调节剂、熟化剂和杀昆虫剂。在植物育种中可进一步利用转基因植物和根据本发明的种子的有利遗传特性，其目的在于开发具有改良的特性的植物，所述改良特性例如对害虫、除草剂或胁迫的耐受，改进的营养价值，提高的产量，或引起更少倒伏或落粒损失的改良的结构。多种育种步骤由明确确定的人为介入表征，例如选择待杂交的林系、指导亲M系的传粉、或选择适当的后代植物。根据期望的特性，采取不同的育种手段。相关技术是本领域公知的，包括但不仅限于杂交、近交、回交育种、多林系育种(multilinebreeding)、变种掺合(varietyblend)、种间杂交、非整倍体技术等等。杂交技术还包括通过机械、化学或生物化学手段对植物不育化，产生雄性或雌性不育植物。用64不同林系的花粉对雄性不育植物异花传粉确保雄性不育但雌性能育植物的基因组会均一地获得两种亲a系的特性。因此，根据本发明的转基因种子和植物可用于改良的植物林系育种，例如提高常规方法如除草剂或杀虫剂处理的有效性，或允许植物由于其修饰的遗传特性而进行所述方法。或者，可获得具有改进的胁迫耐受的新作物，其由于最优化的遗传"装置"产生收获的产物，该产物比不能耐受同等不利发育条件的产物具有更好的品质。B.种子生产在种子生产中，萌发品质和种子的均一性是关键的产物特征。因为难以使作物不含其他作物和杂草的种子，所以为了控制种子带有的疾病和生产具有良好萌发的种子，在培育、调节(conditioning)和销售纯净种子领域有经验的种子生产者开发了相当广泛和明确定义的种子生产实践。因此对农民而言，购买满足特定品质标准的经过^r验的种子而不是使用从其自己作物收获的种子是常见的实践。作为种子使用的繁殖材料通常用防护涂层处理，所述防护涂层包含除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或其混合物。通常使用的保护性涂层包含化合物如环己烯亚胺、萎锈灵(carboxin)、塞仑(TMTD^))、methalaxyl(Apron6)和甲基嘧咬磷(Actdlic6)。如果期望的话，将这些化合物与制剂领域常用的其他运载体、表面活性剂或促进应用的佐剂一起配制，提供针对细菌、真菌或动物害虫引起的损伤的保护。可通过用液体制剂浸渍遗传材料，或通过用组合的湿或干制剂涂布来应用保护性涂层。其他应用方法如在芽或果实处定向处理也是可能的。VI.改变核酸分子的表达以如下途径之一实现本发明核酸分子表达的改变A."有义"阻抑通过"有义，，阻抑获得本发明核苷酸序列表达的改变，特别是其表达的降低(参考例如Jorgensen等，(1996)PlantMol，Biol.31,957-973)。在该情况下，本发明核苷酸序列的整体或部分包含在DNA分子中。该DNA分子与在包含耙基因的细胞(特别是植物细胞)中有功能的启动子特异地有效连接，并被引入该细胞，其中该核苷酸序列可表达。核苷酸序列以"有义方向"插入DNA分子中，这意味着核苷酸序列的编码链可以被转录。在一个特别的实施方案中，核苷酸序列是可完全翻译的，且核苷酸序列中包含的所有遗传信息或其部分被翻译为多肽。在另一特别的实施方案中，核普酸序列是可部分翻译的，并且翻译了一条短肽。在一个特别的实施方案中，这通过在核苷酸序列中插入至少一个过早的终止密码子实现，所述终止密码子使翻译停止。在另一个更特别的实施方案中，核苷酸序列被转录，但是未产生翻译产物。这通常通过去除核苷酸序列编码的多肽的起始密码子例如"ATG"实现。在一个更特别的实施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子被稳定整合在植物细胞的基因组中。在另一特别的实施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子包含在染色体外复制分子中。在含有上段所述DNA分子之一的转基因植物中，对应于DNA分子中包含的核苷酸序列的核苷酸序列的表达被特异降低。特别地，DNA分子中的核苷酸序列与其表达被降低的核苷酸序列至少70%相同，更特别地至少8()%相同，还更特别地至少卯％相同，还更特别地至少95%相同，还更特别地至少99%相同。B."反义"阻抑在另一特别的实施方案中，通过"反义"阻抑获得发明核苷酸序列表达的改变，特别是其表达的降低。本发明核苷酸序列的整体或部分包含在I)NA分子中。该DNA分子与在植物细胞中有功能的启动子特异地有效连接，并被引入该细胞，其中该核苷酸序列可表达。核苷酸序列以"反义方向，，插入DNA分子中，这意味着核苷酸序列的反向互补物(有时也称作非编码链)可以被转录。在一个特别的实施方案中，包含核苷酸序列或其部分的I)NA分子被稳定整合在植物细胞的基因组中。在另一特别的实施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子包含在染色体外复制分子中。引用了描述该途径的若千出版物用于进一步阐述(Green,P.J.等，Arm.Rev.Biochem.55:569-597(1986);vanderKrol，A.R.等，AntisenseNuc.Acids&Proteins,第125-141页(1991);Abd，P.P.等，PNASroc.Natl.Acad.Sci.USA86:6949-6952(1989);Ecker，丄R.等，Proc.Natl.Acad.Sci,USANAS83:5372-5376(1986年8月))。在含有上段所述DNA分子之一的转基因植物中，对应于DNA分子中包含的核苷酸序列的核苷酸序列的表达被特异降低。特别地，DNA分子中的核苷酸序列与其表达被降低的核苷酸序列至少70%相同，更特别地至少80%相同，还更特别地至少90%相同，还更特别地至少95%相同，还更特别地至少99%相同。C.同源重组在另一特别的实施方案中，通过同源重组在基因组中修饰了对应于本发明核苷,列的至少一个基因组拷贝，所述同源重组如Paszkowski等，EMBOJournal7:4021-26(1988)中所进一步阐述的。该技术利用同源序列的下述特性识别;f皮此并通过本领域已知为同源重组的过程互相交换核苷列。同源重组可在细胞中核苷*列的染色体拷贝和通过转化？1入细胞的核苷^列的进入拷贝之间发生。特异的修饰因此被精确地引入核苷酸序列的染色体拷贝中。在一个实施方案中，修饰了本发明核苷酸序列的调节元件。这类调节元件可通过使用本发明核苷酸序列或其部分作为探针筛选基因组文库容易地获得。现存的调节元件被不同的调节元件代替从而改变核苦酸序列的表达，或其被突变或缺失从而消除核苷酸序列的表达。在另一实施方案中，通过缺失部分核苷酸序列或整体核苷酸序列或通过突变修饰核苷酸序列。本发明还涉及突变的多肽在植物细胞中的表达。已描述了对破坏内源植物基因的这些技术更近期的改进(Kempin等，Nature389:802-803(1997)，以及Miao和Lam，PlantJ.，7:359-365(1995)。在另一特别的实施方案中，通过用嵌合寡核苷酸转化细胞在核苷^列的染色体拷贝中引入突变，所述嵌合寡核苷酸由双链体构型的一段连续的RNA和DNA残基组成，其末端上带有双重发夹帽。寡核苷酸的另一特性是例如RNA残基处2，-O-甲基化的存在。RNA/DNA序列被设计为与本发明核苷酸序列的染色体拷贝序列排列在一条链上(align),并含有期望的核苷酸改变。例如，该4支术在美国专利5,501,967和Zhu等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8768-8773中进一步阐述。D.核酶在另一实施方案中，用对编码本发明多肽的RNA特异的催化性RNA或核酶切割编码本发明多肽的RNA。核酶在转基因植物中表达并导致植物细胞中编码本发明多肽的RNA数量减少，从而导致细胞中累积的多肽数量减少。该方法在美国专利4,987,071中进一步阐述。E.显性失活突变体在另一特别的实施方案中，改变了本发明核苷酸序列编码的多肽活性。这通过在转基因植物中表达蛋白质的显性失活突变体导致内源蛋白质活性丧失来实现。F.适体在又一实施方案中，通过在转基因植物中表达与蛋白质特异结合的核酸配体(即所谓的适体)抑制本发明多肽的活性。优选地通过SELEX(通过指数式富集法对配体的系统性进化)方法获得适体。在SELEX方法中，具有随机化序列区域的单链核酸的候选混合物与蛋白质接触，并从候选混合物的剩余部分分离对靶具有提高的亲和力的那些核酸。扩增分离的核酸产生富含配体的混合物。若干次重复后获得对多肽具有最优亲和力的核酸，并用于在转基因植物中表达。该方法在美国专利5,270,163中进一步阐述。G.锌指蛋白也使用与本发明核苷酸序列或其调节区结合的锌指蛋白改变核苷#列的表达。特别地，核苷酸序列的转录被降低或提高。锌指蛋白例如描述于Beerli等，(1998)PNAS95:14628-14633.中或WO95/19431、WO98/54311或WO96/06166中，所述文献均通过参考整体并入本文。H.dsRNA还通过如例如WO99/32619、WO99/53050或WO99/61631中所述的dsRNA干扰获得本发明核苷酸序列表达的改变，所述文献均通过参考整体并入本文。在另一特别的实施方案中，通过双链RNA(dsRNA)干扰获得本发明核苷酸序列表达的改变，特别是表达的降低。本发明核苷酸序列的整体，特别是其部分包含在DNA分子中。该DNA分子的大小特别地为100到1000个核苷酸或更多；最佳大小可根据经验确定。同一DNA分子的两个拷贝是连接的，由间隔DNA分子隔开，使得第一拷贝和第二拷贝处于相反的方向。在特别的实施方案中，DNA分子的第一拷贝M向互补物(也已知为非编码链)，第二拷贝是编码链；在最特别的实施方案中，第一拷贝是编码链，第二拷贝是反向互补物。间隔DNA分子的大小特别地为200到10,000个核苷酸，更特别地为400到5000个核苷酸，最特别地为600到1500个核苷酸长。间隔特别地是DNA的随机片段，更特别地是与dsRNA干扰的靼生物无同源性的DNA随机片段，最特别地是被靶生物有效剪接的功能性内含子。被间隔分开的DNA分子的两个拷贝与在植物细胞中有功能的启动子有效连接，并被引入植物细胞中，核苷酸序列可在该细胞中表达。在一个特别的实施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子被稳定整合进植物细胞的基因组中。在另一特别的实施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子包含在染色体外复制的分子中。引用了描述该方法的若干出版物用于进一步阐述(Waterhouse等，(l998)PNAS95:13959-13964;Chuang和Meyerowitz(2000)PNAS97:4985-4990;Smith等，(2000)Nature407:319-320)。通过dsRNA干扰改变核苷酸序列的表达还描述于例如WO99/32619、WO99/53050或WO99/61631中，其均通过参考整体并入本文。在含有上段所述DNA分子之一的转基因植物中，对应于DNA分子中包含的核苷酸序列的核苷酸序列的表达被特异降低。特别地，DNA分子中的核苷酸序列与其表达被降低的核苷酸序列至少70%相同，更特别地至少80%相同，还更特别地至少卯。/。相同，还更特别地至少95%相同，还更特别地至少99%相同。I.插入DNA分子(插入诱变)在另一特别的实施方案中，DNA分子^L插入本发明核苷酸序列的染色69体拷贝或其调节区中。特别地，这类DNA分子包含能够在植物细胞中转录的转座元件，例如Ac/Ds、Em/Spm、突变子(mutator)。或者，DNA分子包含农杆菌T-DNA的T-DNA边界。T-DNA分子也可包含重组酶或整合酶识别位点，该位点可用于从植物细胞的染色体去除DNA分子的部分。也包括使用T-DNA、转座子、寡核苷酸的插入诱变方法或本领域技术人员已知的其他方法。使用T-DNA和转座子用于插入诱变的方法描述于Winklcr等，(1989)MethodsMol.Biol.82:129-136和Martienssen(1998)PNAS95:2021-2026中，其通过参考整体并入本文。丄缺失诱变在另一实施方案中，通过缺失核苷酸序列或调节序列的一部分，在细胞或植物中序列的基因组拷贝中创建本发明核酸分子的突变。缺失诱变的方法是本领域技术人员已知的。参见例如Miao等，(1995)PlantJ.7:359。在另一实施方案中，通过化学诱变或辐射在大的植物群体中随机产生缺失，并通过正求或反求遗传学分离在本发明的基因中具有缺失的植物。已知用快中子或y射线辐照引起植物中的缺失突变(Silverstone等，(19卵)PlantCdl，10:155-169;Bruggemann等，(1996)PlantJ"10:755-760;Redei和Koncz，在MethodsinArabidopsisResearch,WorldScientific出版(1992)，第16-82页)。如在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中所示(Liu等，(1999)，GenomeResearch,9:859-867.)，可使用PCR在反求遗传学策略中恢复本发明基因中的缺失突变，所述PCR使用合并的基因组DNA集合。正求遗传学策略应涉M示PTGS的林系的诱变，随后针对PTGS的缺失筛选M2后代。可期望这些突变体中的一些破坏了本发明的基因。这可通过针对本发明基因的Southern印迹或PCR，用来自这些突变体的基因组DNA进行评价。K.在植物细胞中超量表达在另一特别的实施方案中，本发明的编码多肽的核苷酸序列^^量表达。用于超量表达本发明核酸分子的核酸分子和表达盒的实例在上文描述。本发明还包括本领域技术人员已知用于超量表达核酸分子的方法。70在一个特别的实施方案中，在植物的每个细胞中改变了本发明核苷酸序列的表达。这例如通过同源重组或通过在染色体中插入获得。也可通过例如在下述启动子的控制下表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶获得，所述启动子能够在植物的每个细胞中表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶。组成型表达，诱导性、组织特异性或发育调节性表达也在本发明的范围内，并导致本发明的核苷酸序列在植物细胞中表达的组成型、诱导性、组织特异性或发育调节性改变。根据本发明的教导(例如如下文所述)制备下述构建体并转化进植物细胞中，所述构建体用于表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶，或用于超量表达本发明的核苦酸序列。VII.多肽本发明还涉及包含氨基断列SEQIDNO:2、4、6、8、IO的分离的多肽。具体地，本发明涉及包含氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、8、10的分离的多肽和具有保守氨基酸修饰的变体。本领域技术人员会明白，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各个取代、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码的序列中单个氨基酸或小比例的氨基酸)是"保守修饰"，所述修饰导致用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。保守修饰的变体提供与未经修饰的多肽相似的生物学活性。列出功能类似的氨基酸的保守取代的表格是本4页i或已知的。参见Crighton(1984)Proteins,W.H.FreemanandC()mpany。在一个特别的实施方案中，与多肽序列SEQIDNO:2具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽序列的等位变体，包括多肽序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10或其外显子或结构域。在另一特别的实施方案中，与SEQIDNO:2所示多肽序列具有基本相似性的多肽或其外显子或结构域，是SEQIDNO:2所示多肽序列的天然存在的变体。在另一特别的实施方案中，与SEQIDNO:2所示多肽序列具有基本相似性的多肽或其外显子或结构域，是SEQIDNO:2所示多肽序列的多态变体。在另一特别的实施方案中，具有基本相似性的序列含有至少一个氨基酸的缺失或插入。在一个更特别的实施方案中缺失或插入为少于约10个氨基酸。在一个最特别的实施方案中，缺失或插入为少于约三个氨基酸。在一个特别的实施方案中，具有-基本相似性的序列编码至少一个氨基酸处的取代。在另一特别的实施方案中，具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽序列或其片段、结构域、重复或嵌合体的等位变体。在另一特别的实施方案中，分离的核酸包含来自下述核苷酸序列编码的多肽序列的大量区域，所述核苷酸序列与SEQIDNO:l所示核普酸序列或其片段或结构域或与之互补的序列相同或具有基本相似性。在另一特别的实施方案中，多肽是SEQIDNO:2所示多肽。在另一特别的实施方案中，多肽是功能性片段或结构域。在另一特别的实施方案中，多肽是嵌合体，其中该嵌合体可包含功能性蛋白质结构域(包括结构域、重复、翻译后修饰位点)或其他特征。在一个更特别的实施方案中，多肽是植物多肽。在一个更特别的实施方案中，植物是双子叶植物。在一个更特别的实施方案中，植物是棵子植物。在一个更特别的实施方案中，植物是单子叶植物。在一个更特别的实施方案中，该单子叶植物是谷物。在一个更特别的实施方案中，谷物可以是例如玉米、小麦、大麦、燕麦、棵麦、栗、高粱、黑小麦、黑麦、单粒小麦、斯佩耳特小麦、双粒小麦、画眉草、蜀黍、亚麻、格兰马草、磨擦草属物种和类蜀粟。在另一特别的实施方案中，谷物是稻。在一个特别的实施方案中，多肽在植物的特异位点或组织中表达。在一个更特别的实施方案中，该位点或组织为例如但不限于表皮、维管组织、分生组织、形成层、皮层或髓。在一个最特别的实施方案中，该位点或组织为叶或鞘、根、花和发育中的胚珠或种子。在一个更特别的实施方案中，该位点或组织可以是例如表皮、根、维管组织、分生组织、形成层、皮层、髓、叶和花。在一个更特别的实施方案中，该位点或组织为种子。在一个特别的实施方案中，由下述核苷酸序列编码的多肽序列是SEQII)NO:l所示核苷酸序列的突变体并包含至少一个核苷酸的取代、缺失或72插入，所述核苷酸序列与SEQIDNO:l所示核苷酸序列具有基本相似性，包括核苷齡列SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9或其片段或结构域或与之互补的序列。在一个更特别的实施方案中，缺失或插入少于约三十个核苷酸。在一个最特别的实施方案中，缺失或插入少于约五个核苷酸。在一个特别的实施方案中，由下述核苷酸序列编码的多肽序列包含至少一个密码子的取代，所述核苷酸序列与SEQIDNO:l、3、5、7、9所示核苷酸序列或其片段或结构域或与之互补的序列具有基本的相似性。在一个更特别的实施方案中，该取代是保守的。在一个特别的实施方案中，与SEQII)NO:2所示多肽序列或其片段、结构域、重复或嵌合体具有基本相似性的多肽序列包含至少一个氨基酸的取代、缺失或插入。本发明的多肽、其片段或变体可包含来自本发明多肽的任何数量的连续氨基酸残基，其中所述残基数量选自由10到本发明全长多肽的残基数组成的整数组。特别地，多肽的部分或片段是功能性蛋白质。本发明包括下述活性多肽，其具有天然(非合成的)内源多肽比活性的至少20%、30%或40%，特别地至少50%、60%或70%,最特别地至少80%、卯％或95%。另夕卜，底物特异性(kcat/Km)任选地与天然(非合成的)的内源多肽基本相似。通常，Km会是天然内源多肽的至少30%、40%或50%;更特别地是至少60%、70%、80%或卯％。测定和定量测定活性和底物特异性的方法是本领域技术人员公知的。作为免疫原存在时，本发明的分离的多肽会引发与本发明多肽特异反应的抗体的生产。因此，为了例如但不仅限于免疫测定或蛋白质纯化技术的目的，本发明的多肽可用作免疫原，用于构建与本发明的蛋白质免疫反应的抗体。测定结合的免疫测定法是本领域技术人员公知的，例如但不仅限于ELISA或竟争性免疫测定法。本发明的实施方案还涉及由^^开内容的分离的核酸分子编码的嵌合多肽，其包括含有由下述分离的核酸编码的多肽序列的嵌合多肽，所述分离的核酸含有下述核苷酸序列，其包括(a)如SEQIDNO:l、3、5、7、9所示的核普酸序列或其外显子或结构域，(b)与(a)具有基本相似性的核苷酸序列；(c)能够与(a)杂交的核苷酸序列；(d)与(a)、(b)或(c)互补的核苷酸序列；或(e)是(a)、(b)或(c)的反向互补物的核苷酸序列；或(f)其功能性片段。含有由分离的核酸编码的多肽序列的多肽，所述核酸含有编码下述多肽的核苷M列、其互补物或其反向互补物，所述多肽包含下述多肽序列(a)SEQIDNO:2所示的多肽序列，或其结构域、重复或嵌合体；(b)与(a)具有基本相似性的多肽序列，包括SEQIDNO:4、SEQIDN():6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:IO所示的多肽序列；(c)由下述核苷酸序列编码的多肽序列，所述核苷酸序列与SEQIDN():l、3、5、7、9所示核苷酸序列或其外显子或结构域或与之互补的序列相同或具有基本的相似性；(d)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在中等严格条件下能够与SEQIDNO:l、3、5、7、9所示核苷酸序列或与之互补的序列杂交；和(a)、(b)、(c)或(d)的功能性片段；或(c)其功能性片段。本发明的分离的核酸分子适用于在重组改造的细胞如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或植物细胞中表达本发明的多肽。该细胞在非天然条件(例如数量、组成、定位和/或时间)下产生多肽，因为其4皮遗传改变为如此。本领域技术人员知道可用于表达编码本发明蛋白质的核酸的大量表达体系，并且不在下文中详细描述这些体系。简言之，通常例如通过将核酸或eDNA与启动子(组成型或可调节的)有效连接，然后整合M达载体中实现编码本发明的多肽的分离的核酸的表达。载体适用于在原核生物或真核生物任一中复制和/或整合。常用的表达载体包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调节编码多肽的核酸分子表达的启动子。为了获得所克隆的核酸分子的高水平表达，期望使用指导转录的包含强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子的表达栽体。本领域技术人员应当明白可对本发明的多肽进行修饰而不减小其生物学活性。可进行一些修饰来利于本发明多肽的克隆、表达或进入融合蛋白的整合。此类修饰是本领域公知的，并包括但不仅限于在氨基端添加以提供起始位点的甲硫氨酸，或置于任一末端以创建方便定位纯化序列的额外氨基酸(例如多聚组氨酸)。也可向载体中引入限制性位点或终止密码子。在一个特别的实施方案中，表达载体包含一个或多个元件，例如但不限于启动子增强子序列、选择标记物序列、复制起点、表位标签编码序列，或亲和纯化标签编码序列。在一个更特别的实施方案中，启动子增强子序列可以是例如CaMV35S启动子、CaMV19S启动子、烟草PR-la启动子、遍在蛋白启动子和菜豆蛋白启动子。在另一实施方案中，启动子可在植物中工作，更特别地为组成型或诱导性启动子。在另一特别的实施方案中，选择标记物序列编码抗生素抗性基因。在另一特别的实施方案中，表位标签序列编码V5、肽Phe-His-His-Thr-Thr、血凝素或谷胱甘肽-S-转移酶。在另一特别的实施方案中，亲和纯化标签序列编码多聚氨基酸序列或多肽。在一个更特别的实施方案中，多聚氨基酸序列为多聚组氨酸。在一个更特别的实施方案中，多肽是壳多糖结合结构域或谷胱甘肽-S-转移酶。在一个更特别的实施方案中，亲和纯化标签序列包含内含肽编码序列。可使用原核细胞作为宿主细胞，例如但不仅限于大肠杆菌和本领域已知的其他微生物菌抹。用于在原核生物中表达蛋白质的方法是本领域技术人员公知的，并可见于许多实验室手册如MolecularCloning:ALaboratoryManual,丄Sambrook等，(1989，ColdSpringHarborLaboratory出版)中。本领域技术人员可获得大量控制表达的启动子、核糖体结合位点和操纵子，也可获得可选择标记物如抗生素抗性基因。选择的载体类型是为了允许最佳生长和在选定的细胞类型中表达。可获得大量真核生物表达体系，例如但不仅限于酵母、昆虫细胞系、植物细胞和哺乳动物细胞。异源蛋白质在酵母中的表达和合成是^^知的(见Sherman等，MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratory出版，1982)。广泛用于产生真核生物蛋白质的常用酵母菌林是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，并且可从商业供应商(例如Invitrogen)获得用于表达的载体、菌林和方案。可用用于产生蛋白质的表达载体转染哺乳动物细胞体系。本领域技术人员可获得许多合适的宿主细胞系，例如但不限于HEK293、BHK21和CH()细胞系。用于这些细胞的表达载体可包含表达控制序列如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSVtk启动子或磷酸甘油酸酯激酶(pgk)启动子)、增强子和蛋白质加工位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。适用于产生蛋白质的其他动物细胞系可商业获得或来自保藏机构如美国典型培养物保藏中心。用于在昆虫细胞中表达蛋白质的表达载体通常来自SF9杆状病毒或本领域已知的其他病毒。可获得大量合适的昆虫细胞系，包括但不仅限于蚊幼虫、蚕、黏虫(armyworm)、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系。转染动物和低等真核细胞的方法是已知的。使用大量方法制备真核细胞感受态以引入DNA，所述方法包括但不仅限于磷酸4丐沉淀、受体细胞与含有DNA的细菌原生质体的融合、用含有DNA的脂质体处理受体细胞、l)EAE糊精、电穿孔、生物射弹和将DNA直接显微注射进细胞中。转化的细胞使用本领域公知的手段培养(参见Kuchler，R.J"BiochemicalMethodsinCellCultureandVirology,l)owden，HutchinsonandRoss,Inc.1997)。一旦本发明的多肽被表达，可使用本领域技术人员已知的方法将其从细胞中分离和纯化。可使用Western印迹技术或放射免疫测定或其他标准的免疫测定4支术监测纯化过程。蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知和4吏用的(参见R.Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag，NewYork1982:Deutscher，GuidetoProteinPurification,Academic出版(19卯))。本发明的实施方案提供了产生重组蛋白质的方法，其中表达载体包含一个或多个元件，包括启动子增强子序列、选择标记物序列、复制起点、表位标签编码序列，和亲和纯化标签编码序列。在一个特别的实施方案中，核酸构建体包含表位标签编码序列，且分离步骤包括使用对该表位标签特异的抗体。在另一特别的实施方案中，核酸构建体含有多聚氨基酸编码序列，且分离步骤包括使用包含多聚氨基酸结合物质的树脂，特别是多聚氨基酸为多聚组氨酸且多聚氨基酸结合树脂为镍-带电琼脂糖树脂。在另一特别的实施方案中，核酸构建体含有多肽编码序列，且分离步骤包括使用含多肽结合物质的树脂，特别是多肽为壳多糖结合结构域且树脂含有壳多糖-琼脂糖凝胶。本发明的多肽可以使用本领域技术人员已知的非细胞合成方法合成。用于固相合成的才支术由Barany和Mayfield，Solid-PhasePeptideSynthesis,在Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第2巻第3-284页，SpecialMethodsinPeptideSynthesis,PartA;Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85:2149-56(1963)和Stewart等，SolidPhaseP印tideSynthesis,第二版，PierceChem.Co.,Rockford，IL(1984)描述。本发明还提供了修饰(即提高或降低)植物或其部分中本发明多肽的浓度或组成的方法。修饰可通过提高或降低植物中的浓度和/或组成(即本发明多肽的比例)实现。该方法包括向植物细胞中引入表达盒以获得转化的植物细胞或组织，并培养转化的植物细胞或组织，所述表达盒含有本发明的核酸分子，或编码如上所述SEQIDNO:l、3、5、7、9的序列的核酸。核酸分子可处于组成型或诱导性启动子的调节下。该方法还可括以足够修物中的表达。的植物或植物部分进行分析和选择，所述方法包括但不限于Southern印迹、DNA测序或4吏用该核酸分子特异引物的PCR分析，并检测由其产生的扩增子。77一般，相对于缺4^达盒的对照植物、植物部分或细胞，浓度或组成提高或降低至少50/。、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或卯％。对氮限制的适应性是植物的关键性状，并与作物产量正相关。消耗土壤中氮的大量生物因素和非生物因素频繁地产生氮限制生长条件。为了应付该问题，植物已进化出一套氮限制适应性应答。然而认识仅限于涉及这些适应性应答的生理学和生物化学改变，而操纵植物对氮限制的适应性的分子机制是之前完全未知的。本文公开的RING结构域蛋白质涉及调节植物对氮限制的适应性应答。该基因增加的表达可产生具有增加的产量的植物，尤其是对氮限制适应性的控制可导致增强的氮利用并改变种子、块茎、根和其他储存器官中的源-库关系。本发明会参考以下的详细实施例进一步描述。除非另有说明，这些实施例仅就说明的目的提供，而非旨在限制。实施例本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，并由J.Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，ColdSpringHarbor,NY:ColdSpringHarborLaboratory出版(2001);由T.丄Silhavy、M丄.Berman和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)和由Ausubd，F.M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,NewYork,JohnWiley和SonsInc.,(1988)，Reiter等，MethodsinArabidopsisResearch,WorldScientific出版(1992)和Schultz等，PlantMolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers(1998)描述。实施例1植物生长条件和lines突变体的分离从ABRC种子贮存物中鉴定拟南芥纯合T-DNA插入突变体林系(哥伦比亚背景中)的标本。在具有受控的环境条件("。C白天/18。C夜晚，l5078pmol/m、的白色荧光照明，16小时光/8小时暗，和75%相对湿度)的栽培室内，将这些T-DNA林系种植在无营养物的土壤LB2(SunGroHorticultureCanadaLtd.BC.加拿大)中，每周在营养物溶液(10mMKH2P04pH5.6，2mMMgS04，1mMCaCl2,0.1mMFe画EDTA，50一H3B04，12jtMMnS04，1|liMZnCl2，1,CuS04，0.2,Na2Mo04)中提供3或10mM硝酸钾，提供四周。根据低硝酸盐诱导的早衰表型，从这些T-DNA株系中分离lines突变体。生物化学分析收集在含3mM硝酸盐的LB2土壤中生长不同天数的lines和Col植物的第5-8片莲座叶，在液氮中冷冻并储存于-80。C用于以下的生物化学分析。从冷冻叶中提取硝酸盐并根据CIothern等，(1975)测定。连续用HEPES-KOH緩冲液(pH7.4)中80%、50%、0。/。乙醇提取总氨基酸，并将合并的上清液用于Rosen(1957)所述的总氨基酸测定。为了提取可溶蛋白质，将冷冻的叶粉末重悬于100mMHEPES-KOH(pH7.5)+0.1%TritonX-IO()緩冲液中并以14,000转/分钟离心10分钟。^f吏用商业蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules,CA)测定上清液中的总可溶蛋白质含量。为了测定氮含量，将冷冻叶粉末的等分式样真空干燥过夜，并使用NAI500C/H/N分析J义(CarloErbaStrumentazione,Milan,意大利)通过Micro-Dumas燃烧分析法测量1.5mg干粉中的总氮。如Geiger等(1998)所述提取可溶糖，并使用可商业获得的试剂盒(Megazyme，爱尔兰)测定葡萄糖、果糖和蔗糖含量。为了分析叶绿素，将冷冻叶粉末悬浮于80。/。丙酮中，并以13,000转/分钟离心。将提取重复两次，并根据Arnon(1949)测量合并的上清液中的叶绿素含量。如Noh和Spalding(1998)中所述从冷冻叶粉末中提取并测定花色素苷。通过RT-PCR的表达分析使用TriZol物质(Invitrogen)从多种拟南芥植物组织中提取总RNA。用试剂盒(Fermentas)从总RNA样品中合成第一链cDNA并用于PCR。通过半定量PCR检测涉及硝酸盐代谢(NR1，NR2，GS2，NRTl.l，NRT2.1)、79光合作用(RBCS和CAB1)、花色素苷合成(CHS)和衰老(SAG12)的拟南芥基因的表达，并使用遍在蛋白-10表达作为内标。需要时可获得这些基因的特异引物和PCR条件。LINES基因的图位克隆(map-basedcloning)将一林纯合的lines植物(Col背景中)与Landsbergerecta野生型植物杂交。在分离的F2后代中，选择518抹显示lines突变体表型的植物用于基于PCR的绘图，所述F2后代在含3mMKN03的LB2土壤中栽培。根据Lukowitz等(2000)进行第一轮绘图。用于以下精细绘图的SSLP和CAPS标记物得自拟南芥基因组序列数据库(www.arabidopsis.org)。产生转基因拟南芥植物为了确定Atlg02860是否是LINES基因，使用一对引物UNEScDNA-F5，ACAACCGGTTTGAGGGCTGAATTTGTTTG3，(SEQIDNO:ll)和L腿ScDNAR5，ACAGAATTCTATATCATATTCCAGTGAAGCT3'(SEQIDNO:12)通过RT-PCR扩增Atlg02860的编码序列。将PCR产物克隆进二元载体pEGAD(Cutler等，2000)的AgeI和EcoRI位点中，在该栽体中Atlg02860cDNA表达将由植物中的35S启动子驱动。如CloughandBent(1998)所迷将构建体转化进lines突变体植物中，并通过对Tl幼苗播洒除草剂BASTA(1:500稀释度，Aventis，Strasbourg,France)篩选转化体。将来自三林独立的Tl转基因林系的T2种子播种在含3mM硝酸盐的LB2土壤中用于表型测试。结果lines突变体显示低无机氮诱导的早衰表型在大部分土壤条件下作物植物可获得的主要无机氮化合物是硝酸盐(Crawford和Forde，2002)。为了研究拟南芥植物如何应答多变的硝酸盐供应，建立了一种生长体系，其中10mM硝酸盐为拟南芥植物提供足量的氮营养物，而3mM硝酸盐显著地限制拟南芥植物的生长(Bi等，2005)。观察到对不足氮供应的以下适应性应答。供应3mM硝酸盐的拟南芥植物与供应10mM硝酸盐的植物相比生长降低30%(Bi等，2005)，并显示莲座叶红色的增加，这指出花色素苷的累积(图1A到C)。另外，它们比在IOmM硝酸盐下生长的植物至少提前两周开始在莲座叶中的衰老过程(数据未显示)。为了篩选对氮限制生长条件具有改变的生长应答的突变体，从拟南芥生物资源中心(ABRC)种子贮存物中鉴定纯合T-DNA插入抹系的标本(Alonso等，2003),并在硝酸盐应用受控体系中生长以评价其生长表现。供应3mM硝酸盐时，一林T-DNA插入抹系不能适应氮限制生长条件，并比野生型早得多开始衰老而且衰老得更加迅速(图1)。因此，该T-DNA插入抹系被称作低无机氮诱导的早衰(lines)突变体。图1A到C中显示，供应10mM硝酸盐的lines突变体植物具有与野生型相似的生长和发育模式。将硝酸盐浓度降低至3mM时，lines植物在萌发后第24天(DAG)在第5片莲座叶中开始衰老，并且在该点后衰老快速发展，所有的莲座叶在第261)AG显示衰老症状，且整个莲座在第32DAG死亡。相反，野生型植物直到笫32DAG才在第5片莲座叶中显示衰老症状。在野生型植物中，衰老过程从第5片莲座叶到更年轻的莲座叶緩慢和逐步地进行，并且所有莲座叶显示衰老症状花费至少两周。lines植物中的茎生叶在第MDAG开始衰老，比野生型植物至少提前10天(图1D)。另外，发育中的lines长角果在第32DAG时在其尖端开始衰老，而野生型长角果在其整个发育中均不显示衰老症状，但是累积了丰富的花色素苷，这在lines长角果中未观察到(图1E)。随着硝酸盐浓度降低至lmM，lines植物莲座叶中衰老表型的发生加速至第20DAG，并且发育中的lines长角果的严重衰老导致其在30DAG左右死亡，而不生产有活力的种子。在与lmM硝酸盐相同的生长条件下，野生型植物直到第26DAG才在莲座叶中开始衰老，并产生生殖力旺盛的长角果(图1C)。为了进一步证实lines突变体中的早衰表型依赖于不足的硝酸盐供应，本发明人用1或3mM硝酸盐栽培lines植物。当衰老症状刚刚在第5片莲座叶中开始时，对这些植物提供15mM硝酸盐。结果，正在衰老的lines植物中的衰老过程停止，衰老的莲座叶恢复其生长，并且新的莲座叶没有衰老症状。另外，产生了新的侧枝，并且在茎生叶和长角果中未观察到衰老症状(图1F和G)。最后，这些lines植物中的长角果在供应15mM硝酸盐后成为生殖力旺盛的(图1F)。除了硝酸盐外，无机氮肥包括铵和硝酸铵。本发明人发现不足的铵和硝酸铵供应也诱导lines突变体的早衰表型。在20mM铵或10mM硝酸铵上生长的lines植物具有与野生型植物相似的生长和发育模式(数据未显示)。在5.0mM铵或2.5mM硝酸铵上生长时，lines植物在24DAG左右在莲座叶中开始衰老过程，并且随后在整个莲座、茎生叶和长角果中快速发生衰老。在相同的氮限制条件下，野生型植物直到32DAG才在第5莲座叶中显示明显的衰老症状(数据未显示)。另外，也可以通过对衰老中的lines突变体提供大量铵或硝酸铵来恢复不足的铵和硝酸铵在lines突变体中诱导的早衰表型(数据未显示)。因为三种无机氮形式对lines突变体具有相同的影响，所以本发明人在以下的实验中使用硝酸盐作为氮源。LINES基因的图位克隆为了测定低无机氮诱导的早衰表型在lines突变体中的遗传，本发明人将lines突变体与野生型回交。在3mM硝酸盐上生长时，Fl植物显示与野生型植物相同的表型。在F2世代中，野生型和lines突变体表型以3:1的比例分离(数据未显示)，这表明lines突变体表型是隐性的，并作为单个孟德尔性状遗传。Southern印迹分析揭示了lines突变体的基因组含有五个T-DNA插入，但是在遗传上与低氮诱导的早衰表型均无联系(数据未显示)，这表明lines突变体中的负责基因未被T-DNA插入标记。后来，lines突变体与野生型成功地回交四次，没有一个T-DNA插入纟皮留在lines突变体中。因为在lines突变体中LINES基因未被T-DNA标记，所以使用图位克隆方法分离LINES.通过将lines突变体与Landsbergerecta野生型杂交产生F2绘图种群。将来自50个F2lines突变体植物的基因组DNA混合，并用于使用来自Lukowitz等(2000)的22个简单序列长度多态性(SSLP)标记物的最初的绘图。在LINES和染色体1上臂上的SSLP标记的(market)F21M12之间检测到紧密连锁(数据未显示)。使用其他可获得的SSLP标记物(www.arabidopsis.org)的进一步绘图将LINES定位在下述区域中，所述区域边界是两个SSLP标记物NF21B7和NT7I23并被七个BAC覆盖(图2A)。使用这两个SSLP标记物，在F2绘图种群中518林lines植物间鉴定了18个重组体。使用这18个重组体和更多SSLP和切割的扩增的多态序歹'J(cleavedamplifiedpolymorphicsequence,CAPS)标记物的精细绘图将LINES基因座的位置限制在BAC克隆F22D16上的SSLP标记物473993和CAPS标记物SNP247之间的基因组区域。该区域大约为62.3kb并含有21个有注解的基因(图2A)。十三个基因可以是LINES的候选者，并通过RT-PCR和PCR从lines突变体植物中分别扩增其编码区和相应的基因组序列。这些PCR产物与其来自野生型的复本进行比较，揭示了仅Atlg02860基因在lines突变体的基因组和编码序列中被缩短(图2C和D)。linesAtlg02860基因的完全测序显示在lines突变体中Atlg02860的第三个内含子和第四个外显子缺失(图2A),且剩余的外显子3和5框内融合(图2A)。这导致了lines突变体中检测到截短的Atlg02860cDNA(图21))。为了证实Atlg02860的确是LINES基因，将由35S启动子驱动的野生型Atlg02860cDNA转化进lines突变体中。PCR和RT-PCR分析揭示了三个独立的转化体，其基因组中含有截短的Atlg02860基因组序列(1.4kb)和转化的Atlg02860cDNA(1.0kb),并相应地含有截短的(0.9kb)和野生型(1.0kb)的Atlg02860mRNA(图2C和D)。与野生型植物类似，对这三个转化体供应3mM硝酸盐时其未显示早衰表型(图2B)。相反，用空的二元栽体pGEAD(Culter等，2000)转化的对照lines植物未表达野生型Atlg02860cDNA(图2D)，并显示低氮诱导的早衰表型(图2B)。所有的数据明确地将Atlg02860指定为LINES基因，且突变的Atlg02860基因负责lines突变体中低氮诱导的早衰表型。LINES编码RING-型遍在蛋白E3连接酶LINES基因由六个外显子和五个内含子组成，并编码335个氨基酸的蛋白质(图2A和3A)，该蛋白质具有38,110道尔顿的分子量和4.59的pl。该LINES蛋白质具有两个已知的结构域RING和SPX(图3A和B)。该RING结构域位于LINES蛋白质中的第230位-第282位氨基酸，是结合两个锌原子的C3HC4型锌指并参与介导蛋白质-蛋白质相互作用。在拟南芥中，一些含RING的蛋白质(如COP1和SINATA5)的功能表征提示RING结构域的生物学功能是参与遍在蛋白依赖型蛋白质降解(Moon等,2004)，并因此在真核生物细胞调节中起主要和关键的作用(Glickman和Ciechanover，2002)。Stone等(2005)才艮道了拟南芥基因组编码469个推定的含RING蛋白质，其可分为八类，且LINES属于RING-HCa型(Stone等，2005)。SPX结构域位于LINES的N端，从第1位氨基酸到第180位氨基酸(图3A和B)。该结构域根据酵母蛋白质SYG1和PH081和哺乳动物蛋白质XRP1命名，所有这些蛋白质在其N端均含有该180个氨基酸的结构域。尽管SPX结构域的精确生物学功能是未知的，但是酵母SYGl能够直接与G-蛋白P亚基结合并阻抑交配信息素信号转导的发现(Spahi等，1995)提示具有N端SPX结构域的蛋白质参与G-蛋白关联的信号转导。将来自突变和野生型LINES蛋白质的氨基酸序列进行比较，揭示了在突变的LINES蛋白质中缺失RING结构域(图3A和B)。尽管截短的LINES的包含SPX结构域的剩余氨基酸序列与野生型复本相同，但是截短的LINES不能执^f亍其野生型复本的生理功能，并因此导致低氮诱导的早衰表型。另外，为了确定野生型RING结构域是否能够恢复lines的表型，本发明人在lines才直物中表达了N-端截短的Atlg02860cDNA，其编码完整的RING结构域但是没有SPX。然而，所有的转化体维持了低氮依赖型早衰表型(数据未显示)。这些结果指出RING结构域是LINES中非常关键的部分，并且其生理学功能不能与SPX结构域分离。尽管拟南芥基因组含有约20个含SPX的蛋白质(Wang等，:20(M)和469个含RING的蛋白质，但是只有分别由Atlg02860和At:2g38920编码的LINES和NP—181426既包含SPX又包含RING结构域。这两种蛋白质具有41.2%的序列同一性和61.7。/。的相似性。这是At化38920(SALK—I29"8中的T-DNA插入突变体。然而，该基因中的纯合突变未显示低氮诱导的早衰表型(数据未显示)，这表明Atlg02860是拟南芥植物适应氮限制生长条件所特异需要的。将推导的LINES氨基酸序列与目前数据库中已存的进4亍比较，揭示LINES在稻(Oryzasativa)中具有两个、在裂殖酵母(Schizosascharomycespombe)中有一个、在真菌中有六个直向同源物(图)。系统进化分析指出LINES与稻中的XP—479476最紧密相关(图3C)。然而，所有这些LINES直向同源物的生物学功能仍然未知。lines突变体未改变其获得氮的能力，但是具有改变的氮限制介导的衰老过程。lines植物发生低无机氮诱导的早衰表型存在两种可能的原因。首先，当氮供应不足时lines植物获取比野生型更少的氮营养物。为了解决该问题，本发明人检查了野生型和lines植物中的总氮含量。供应高(10mM)或低(3mM)硝酸盐时，野生型和lines植物在18DAG时鲜重(数据未显示)和总氮百分比(图4A)彼此相似。因此，lines突变体关于总氮含量与野生型密切相似。另外，两种主要的硝酸盐转运蛋白NRT1.1(低硝酸盐亲和力转运蛋白)和NRT2.1(高硝酸盐转运蛋白)在提供3或10mM硝酸盐的野生型和lines植物的根中具有非常相似的表达水平(图4B)这些结果提示lines和野生型植物具有相似的获取氮营养物的能力，无论氮供应是高是低。lines植物仅在氮供应受限时产生早衰表型的第二种可能的原因可能是该lines植物适应性应答的发育受损，所述适应性应答4吏得拟南芥植物能够适应氮限制生长条件。一种这样的适应性应答是氮限制介导的衰老，这对于将氮营养物从老的、成熟的莲座叶中再移动至年轻和处于活性生长的器官(例如年轻的叶和未成熟的种子)中是关键性的(Thimann，1980;MeiandThimann，1984)。因此，详细地检查了野生型和lines莲座叶中氮限制介导的衰老过程(图4C)。用3mM硝酸盐栽培时，直到第32DAG野生型植物在第5片和更年轻的莲座叶中未显示衰老症状。衰老緩慢进行并且是很有组织的，这由下述事实指出莲座叶的颜色从绿色逐步改变为深绿85和红色，并在整个衰老过程中维持其膨胀度。在供应3mM硝酸盐的lines植物中，衰老不仅比野生型中开始得早很多，而且也*得更迅速，因为所有的莲座叶在26DAG就显示衰老症状，并且显示突然的叶颜色改变和快速的叶膨胀度消失。正在衰老的叶的较低叶边缘仍然是绿色和膨胀的，而较高部分已经死亡(图4C)。另外，衰老中的叶未从绿色转为红色，且死亡的叶是带有一些红色的棕色，指出在lines植物的衰老过程中合成较少的花色素苷。拟南芥SAG12是一个衰老相关的基因，并被定义为真实衰老分子标记物(NohandAmasino，1999)。为了更便利和精确地跟踪衰老的发生和取样莲座叶用于该研究中的生物化学实验，本发明人在用3mM硝酸盐栽培的野生型和lines植物的第5-8片莲座叶中测定了SAG12的表达。如图2D中所示，SAG12表达在第24天DAG的lines植物中被检测到，并随着衰老的进行在28DAG时提高。另一方面，野生型植物中SAG12直到第32I)AG时才表达，并在莲座中发生严重衰老的第36DAG时显著提高。SAG12基因的表达谱与两种基因型中视觉衰老症状的出现一致(图4C)，这表明SAG12表达水平的确反应了莲座叶中的衰老过程。lines突变体含有高水平的氮代谢产物，但是在正在衰老的莲座叶中不能累积可溶的糖。为了在限制生长的条件下充分利用所有能获得的氮，植物可从衰老的叶和器官中向年轻和正在发育的叶和器官中输出氮。因此，测试的第二种氮限制适应性应答是氮从衰老叶的再移动。lines植物中快速的莲座叶衰老和死亡可损伤氮从这些正在衰老的叶向年轻叶、花和正在发育的长角果的再移动，并因此可导致lines莲座叶中的高氮代谢物含量。为了检验该假说，在野生型和lines植物的第5-8片莲座叶中测定了硝酸盐、氨基酸、可溶蛋白质和总氮含量水平，所述植物在整个衰老过程中于受限氮条件下生长。在第18DAG，在开始衰老前，野生型和lines植物含有非常相似的三种含N化合物含量(图5A到C)，并且总氮含量无显著差异(图5D)。在野生型莲座叶中发生衰老的第32DAG时，与未观察到衰老症状的l8DAG相86比，硝酸盐、总氨基酸、可溶蛋白质和总氮的含量分别被降低75%、80%、75"/。和70%。随着衰老的进展，第36DAG时野生型莲座叶中硝酸盐、总氨基酸、可溶蛋白质和总氮的含量分别被降低90%、90%、90%和80%(图5A到1))。相反，lines莲座叶中衰老的发生(第24DAG)和发展(第28DAG)不伴随硝酸盐、总氨基酸、可溶蛋白质和总氮含量的显著降低(图5A到D)。例如，当第28DAG在lines莲座叶中发生严重的衰老时，硝酸盐、总氨基酸、可溶蛋白质和总氮含量与第18DAG相比进分别降低33。/。、5%、20%和6%(图5A到D)。这些结果提示氮从正在衰老的野生型莲座叶中再移动，但是氮留在lines的正在衰老的叶中。在生物化学分析后，本发明人通过RT-PCR测定了涉及氮代谢的基因的表达。如图6所示，NR1、NR2和GS2的表达随着野生型莲座叶中衰老的发生和#而降低。然而，这未在lines植物中发生，其中在衰老发生之前或之后收获的莲座叶之间，这些基因的表达未改变。已发现可溶性糖(包括葡萄糖、果糖和蔗糖)在叶中的累积与叶衰老和氮缺乏的发生有力关联(Paul和Driscoll,1997;Wingler等，2006)。对可溶性糖的实验显示在野生型植物中葡萄糖、果糖和蔗糖随着叶衰老的开始和*而显著累积，但是在lines植物中，当衰老在其莲座叶中发生时，三种可溶性糖的含量仅具有轻微的提高(图5E到G)。例如，在叶衰老尚未开始的第18I)AG,野生型和lines植物具有类似的葡萄糖、果糖和蔗糖含量。当叶衰老发生时，野生型植物中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量分别提高卯％、84%和46%(第36DAG),而在lines植物中仅分别提高5%、8%和20%(第28DAG)。衰老期间lines突变体在花色素苷累积和光合作用能力的降低中受损累积的花色素苷和降低的光合作用是两种重要的氮限制适应性应答，并被拟南芥中多重QTL控制(Diaz等，2006)。为了确定lines植物是否能够产生这类适应性应答，在野生型和lines植物中测量了花色素苷含量和光合作用能力。在有限的氮下生长的野生型^t物在其生长和衰老期间显著提高花色素苷含量(图5H)。在18DAG,野生型的第5-8片莲座叶含有4.8单位/g鲜重(FW)的花色素苷，这在第28DAG提高至31单位/gFW，此时莲座叶仍然未显示任何衰老症状。随着第32DAG野生型植物的第5-8片莲座叶中衰老的发生，它们的花色素苷含量提高至>40单位/gFW。相反，正在衰老的lines莲座叶中未发生花色素苷累积(图5H)。在lines植物未显示分子和形态学衰老症状的第18DAG，所述lines植物含有4.0单位/gFW花色素苷。在第5-8片莲座叶中发生衰老的第24DAG，它们仍然含有3.5单位/gFW花色素苷。在第28DAG当lines植物中所有莲座叶均显示严重的衰老症状时，未观察到花色素苷含量的提高(图5H)。对应于野生型和lines植物中不同的花色素苷累积模式，编码花色素苷合成途径中限速酶的查耳酮合酶基因(CHS)在lines植物的整个衰老过程中未提高其转录水平，但是在野生型植物中CHS基因的表达随着衰老的开始和发展而显著提高(图6)。植物光合作用能力可以通过叶绿素含量和两种光合作用标记物基因RBCS和CAB在叶中的表达水平来指示，所述基因RBCS和CAB分别编码核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)的小亚基和叶绿素a/b结合蛋白(Martin等，2002)。在提供有限氮的野生型和lines植物中测定叶绿素含量。如图51中所示，野生型和lines植物在第18DAG分别含有0.99和0"5mg叶绿素/gFW。随着野生型植物中衰老的开始(32DAG)和进展。6DAG)，叶绿素含量分别降低50%和70%。然而，当lines植物中严重地发生衰老时，第28DAG叶绿素含量仅降低15%。RT-PCR分析揭示当第32DAG在野生型莲座叶中发生低氮介导的衰老时，RBCS和CAB的表达猛烈降低(图6)。相反，lines植物中RBCS和CAB的表达在其莲座叶中发生衰老之前和之后始终较高(图6)。这些数据表明与野生型植物不同，用有限氮营养物栽培的lines植物在花色素苷累积和光合作用能力的降低中受损，所述花色素苷累积和光合作用能力降低是关键的氮限制适应性应答。lines突变体在磷限制和高蔗糖胁迫诱导的花色素苷合成途径中没有缺陷除了氮限制外，磷限制和高蔗糖胁迫也诱导植物中的花色素苷合成。为了确定lines突变体在磷限制引起的花色素苷累积中是否有缺陷，在含0.5mM磷的土壤中栽培lines突变体和野生型植物。已发现该磷应用显著地限制拟南芥植物生长。在用3mM硝酸盐栽培的lines突变体植物已经显示早衰表型和花色素苷累积受损的第28DAG，供应0.5mM磷的lines突变体和野生型均剧烈地增加花色素苷合成，并产生约24单位/gFW的花色素苷。另外，用受限的硝酸盐(3mM)和磷(0.5mM)栽培的lines突变体植物在第28DAG不仅累积了高花色素苷含量(20单位/gFW)，而且未显示氮限制诱导的早衰表型。为了研究高蔗糖是否能够在lines突变体中诱导花色素苷累积，用1mM硝酸盐和3%或5%蔗糖体外栽培lines突变体和野生型植物。在第21DAG,供应3%蔗糖的lines突变体产生比野生型少得多的花色素苷，并显示早衰表型。相反，用5%蔗糖栽培时，该lines植物累积与野生型类似量的花色素苷，并且不显示早衰表型。所有的数据表明磷限制和高蔗糖胁迫诱导的花色素苷合成途径不受lines突变影响，并且lines突变体特异地在氮限制诱导的花色素苷途径中有缺陷。这些结果还证明花色素苷在lines突变体中的累积可有效地防止氮限制诱导的早衰表型。lines突变将氮限制增加的花色素苷合成转换为木质素生产植物中的苯基丙酸类化合物途径在第四步分为两条分支一条用于黄酮类化合物生物合成，另一条用于木质素生物合成。在用3mM硝酸盐栽培的lines突变体植物中，许多涉4质素合成的结构基因在第22到28DAG被显著上调。该结果和lines突变体植物中氮限制诱导的花色素苷累积的显著下降提示lines突变可将氮限制增加的花色素苷合成转换为木质素生产。为了证实该假说，用3mM硝酸盐栽培lines突变体和野生型植物，并在第22到28DAG(此时lines突变体和野生型植物均具有1-2cm的花序)分析初级花序中的木质素含量，野生型植物几乎不含有木质素，而在lines突变体中明显地观察到木质素。在第24DAG在氮限制诱导的早期衰老发生前，lines突变体仍具有比野生型多得多的木质素。随着衰老的开始和发展，lines突变体植物降低其生长，并在第28DAG具有与野生型相似的木质素含量。为了维持lines突变体在氮限制生长条件下的生长，对它们供应高二氧化碳(C02)。在该生长条件下，尽管lines植物在第28DAG显示早衰表型并产生极少的花色素苷，但是它们维持其生长并在茎干中累积木质素，这导致lines植物植物含有比野生型多得多的木质素和长得多的statute。所有这些结果指出LINES基因参与木质素生物合成的控制，并且lines突变将氮限制增加的花色素苷合成转换为木质素生产。讨论氮和磷均为植物生长和发育的必需常量营养物(Marschner，1995)。与植物对氮限制的应答相反，植物中磷限制的感知、信号传导和相关的基因调控已经被充分研究和理解。在拟南芥中，PH03、PSR1、PDR2和PHR1基因中的突变破坏了磷限制信号传导(Zakhleniuk等，2001;Chen等，2000，Ticconi等，2004;Rubio等，2001)。AtSIZl调节PHR1的活性，并可在磷限制感知途径的下游发挥作用(Miura等，2005)。活生物中氮限制感知和信号传导途径存在的证据来自于酵母和细菌。在酵母中，铵通透酶Mep2p能够感知环境中的氮可利用度并产生氮限制信号供酵母调节其生长和发育，以适应不利的生长条件(Lorenz和Heitman，1998;Gagiano等,2002;Biswas和MorschMuser，2005)。在细菌中，已发现PII-型信号转导蛋白质在氮限制信号转导途径中起主要作用，其功能和与其他蛋白质的相互作用被响应细胞内氮状态(不足或充足)的磷酸化、尿苷酰化或腺苷酰化修饰(Arc()ndeguy等，2001;Schwarz和Forchhammer,2005)。尽管植物具有酵母Mep2p和细菌PII的同源物，但是它们在植物的氮限制适应性中不具有相似的功能(Crawford和Forde，2002;Moorhead和Smith,2003)。在该研究中，发明人展示生理学、生物化学和分子遗传数据，清楚地证明LINES是氮限制适应性应答的发生所必需的，并且是支配植物氮限制适应性的分子机制中的关键组件。已知氮限制胁迫显著地影响植物生长和发育，同时关于植物对氮限制适应性的认知是模糊的。在该研究中，发明人证明拟南芥植物能够通itil生一组氮限制适应性应答适应氮限制生长条件(图4和5)。首先，光合作用能力被降低。该应答不仅能够显著地降低植物对氮营养物的需求，而且限制了合成含N分子(如氨基酸、蛋白质和核酸)时对光合产物的利用。其次，花色素苷的合成被显著提高。该光防护色素的提高允许缺氮植物避免由氮限制引起的光抑制损伤(Bongue-Bartelsman和Phillops，1995;Chalker-Scott，1999)。第三，可作为叶衰老和氮缺乏的信号作用的可溶性糖净皮累积(Paul和Driscoll，1997;Wingler等，2006)。已知叶衰老对于拟南芥中的氮再循环是重要的，因为成熟莲座叶中多于80%的总氮通过衰老过程输出(Himelblau和Amasino，2001)。在氮限制生长条件下，对拟南芥植物有效地使用有限的氮营养物而言，该衰老介导的氮再循环变得更加重要，并且因此是关键的氮限制适应性应答。在该研究中，用有限的氮供应时栽培的拟南芥植物在进入抽莒阶段后在老的成熟莲座叶中开始衰老，并且衰老从较老的成熟莲座叶逐步*至较年轻的莲座叶(图4)。同时，正在衰老的莲座叶中总氮含量和含N化合物如蛋白质、氨基酸和叶绿素的量显著地降低，这表明这些叶中的氮被输出至年轻的、正在发育的器官，如花芽和长角果(图5)。因此，随着拟南芥植物中氮限制引起的衰老的产生和发展，涉及光合作用和氮同化作用的基因的表达水平降低，并且花色素苷合成中的限速基因CHS的转录被增加(图6)。拟南芥植物中涉及氮限制适应应答的这些大量的生理学、生物化学和分子改变提示氮限制的感知或信号转导途径;陂激活，以开启对低氮的这种复杂的代谢应答。在有限的氮下生长时，lines突变体仅发生早衰表型，并且该表型以三种方式被证实。首先，在有限的氮(3mM硝酸盐)下生长的lines植物比野生型植物至少提前一周开始在莲座叶中衰老，而供应了充足氮营养物(10mM硝酸盐)的lines植物在其整个生命周期中的每个生长和发育方面都与野生型类似(图1A到C)。其次，对正在衰老的lines植物提供充足的氮营养物(15mM硝酸盐)能终止衰老程序(图1F和G)。第三，lines突变体被暴露于与低氮组合的低磷或高蔗糖条件下时不显示早衰表型。氮限制下lines植物中早衰表型的出现可通过氮获取的缺陷或者通过对氮限制生长条件适应性的丧失来解释。因为提供3mM或10mM硝酸盐时lines和野生型植物具有非常类似的总氮含量(图4A)，所以排除了第一种可能性。另一方面，lines突变体的详细分析清楚地证明，在供应了有限氮的lines植物中，氮限制适应性应答关键性的所有生理学、生物化学和分子改变均未发生(图4到6)。从晚期营养阶段到生殖期，在有限的氮供应下生长的lines植物未累积花色素苷，并且进具有光合作用的轻微降低和可溶糖含量的少量提高(图5)。有趣的是，不能累积花色素苷伴随着提高的木质素累积，这提示LINES调节木质素生产和花色素苷生产之间的苯基丙酸类化合物生物合成分支点。这些lines植物最突出的特征是它们经历了与野生型中显著不同的由氮限制引起的衰老途径。首先，供应有限氮的lines植物中，所有莲座叶中的衰老不仅比野生型中开始得早得多而且*得更迅速，但是这也在年轻的、处于活性生长的器官如茎生叶和不成熟的长角果中发生(图4)。其次，随着lines莲座叶中衰老的开始和*,正在衰老的lines叶中总氮含量和含N化合物如蛋白质和总氨基酸仅轻微地降低(图5)，这表明正在衰老的lines莲座叶中未发生衰老介导的氮再移动。这也通过lines的年轻莲座叶和茎生叶和正在发育的长角果中的快速衰老得到证明，所述衰老最可能归因于较低的氮输入。另外，在lines植物中，涉及光合作用、氮同化作用和花色素苷合成的基因在衰老期间不具有改变的表达水平。这与在野生型植物中观察到的显著不同(图6)。lines突变体不能发生这些关键的氮限制适应性应答强烈地提示LINES基因中的突变破坏了氮限制感知或信号传导途径，使得lines突变体不能对氮限制生长条件进行感知或信号传导。相反，lines突变体维持生理学、生物化学和分子状态，仿佛氮供应没有受限制一样。通过图位克隆方法鉴定了该LINES基因，并且其显示编码与SPX结构域连接的RING-型遍在蛋白连接酶(图2和3)。在lines突变体中，RING结构域从LINES蛋白质中缺失，且LINES的截短引起低氮诱导的早衰表型(图2B)。对在At2g38920(其为拟南芥基因组中LINES的唯一)中具有T-DNA插入的突变体提供不足量的氮时，其不显示lines表型，进一步指出LINES对拟南芥中氮限制适应性应答的发生是有特别重要性的。然而，该表型的缺乏可反映LINES赋予的冗余。已知蛋白质遍在蛋白化在真核生物中大量细胞过程的调节中起主要作用。首先，蛋白质遍在蛋白化途径靶向用于被26S蛋白酶体降解的多种底物，如核转录因子、异常细胞质蛋白和短寿命的调节蛋白质(Glickman和Ciechanover，2002)。其次，用遍在蛋白修饰蛋白质也以非蛋白酶体依赖性的方式调节蛋白质定位、活性、相互作用配偶体和功能(SchnelI和Hicke,2003;Sun和Chen,2004)。在该研究中lines突变体的表征证明拟南芥中氮限制适应性应答的发生涉及大量生理学、生物化学和分子改变(图4到6),对这些改变而言，负责的分子过程如氮限制感知和信号传导应当^皮激活。根据本文的发现(LINES编码遍在蛋白连接酶，并且lines突变体中LINES的敲除导致不能发生所有关键的氮限制应答)可以假设LINES可通过蛋白质遍在蛋白化途径参与一种或多种底物蛋白质的降解或修饰，且该一种或多种底物蛋白质可以是氮限制感知或信号传导途径中的关键负调节物。在lines突变体中因为从LINES中缺失了RING结构域，所以该负调节物不会为了降解或修饰而适当地遍在蛋白化。对氮限制具有强适应性的作物如玉米在拉丁美洲、非洲和亚洲的发展中国家中是最想要的，在这些国家中农民负担不起巨大的氮^，同时食物需求非常高(Loomis，1997;Duvick,1997)。理解控制植物对氮限制的适应性的分子机制会有希望加速这类作物栽培种的开发。该研究中LINES的克隆和功能表4正不仅证明植物装配有适应氮限制的分子机制，而且也是鉴定下述分子组件的第一步，所述分子组件涉及控制植物氮限制传感、信号传导和相关基因调控。通过之前的实施例(其不旨在用于限制)描述了本发明的具体实施方案后，接下来在以下的权利要求书中进一步公开本发明。本领域技术人员会明白该权利要求书也允许包括在权利要求书文字范围以外的等价物。参考文献93Alonso,J.M.等,(2003)Genome-wideinsertionalmutagenesisofArabidopsisthaliana.Science301，653-657.Arcondeguy，T.、Jack,R.和Merrick,M.(2001).PHsignaltransductionproteins,pivotalplayersinmicrobialnitrogencontrol.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65，80—105.Arnon，D.I.(1949)Copperenzymesinisolatedchloroplasts.PolyphenoloxidaseinBetavulgaris.PlantPhysiol.24:1-15.Bi,Y.M.、Zhang,Y.、Signorelli,T.、Zhao,R.、Zhu，T.,和Rothstdn,S丄(2005)GeneticanalysisofArabidopsisGATAtranscriptionfactorgenefamilyrevealsanitrate-induciblememberimportantforchlorophyllsynthesisandglucosesensitivity.PlantJ.44:680-92.■Biswas,K.和Morschhauser，J.(2005)TheMep2pammoniumpermeasecontrolsnitrogenstarvation-inducedfilamentousgrowthinCandidaalbicans.Mol.Microbiol.56:3,649-669.B(mguc画Bartelsman,M.和Phillips,D.A.(1995)Nitrogenstressregulatesgeneexpressionofenzymesintheflavonoidbiosyntheticpathwayoftomato.PlantPhysiol.Biochem.33:539-546.Castleberry,R.M.、Crum，C.W.和Krull,R(1984)GeneticyieldimprovementofU.S.maizecultivarsundervaryingfertilityandclimaticenvironments.CropSci.24:33—36.Cataldo，D.A.、Haroon,M.、Schrader,T.E,和Youngs,V丄.(1975)Rapidcolorimetricdeterminationofnitrateinplanttissuebynitrationofsalicylicacid.Commun.SoilSci.andPlantAnal.6:71—80.Chalker誦Scott,L.(1999)Environmentalsignificanceofanthocyaninsinplantstressresponses.Photochem.Photobiol.70:1—9.Chen,D.L.、Ddatorre,C.A.、Bakker,A.和Abel,S.(2000)Conditionalidentificationofphosphate-starvation-responsemutantsinArabidopsisthaliana.Planta211:13—22.Clough，S丄和Bent,A.F.(1998)Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.16:735-743.Crawford,N.M.(1995)Nitrate:nutrientandsignalforplantgrowth.PlantCell7:859-68.Crawford,N.M.和Forde，B.G.(2002)Molecularanddevelopmentalbiologyofinorganicnitrogennutrition.In:Meyerowitz，E.andSomerville，C.eds，TheArabidopsisBook.AmericanSocietyofPlantBiologists,Rockville,MD，doi/10.1199/tab.0011，http:〃www.aspb.org/i3ublicatioiis/arabidopsisCutler,S.R.、Ehrhardt，D.W.、Griffitts，J.S.和Somerville,C.R.(2000)RandomGFP::cDNAfusionsenablevisualizationofsubcellularstructuresincellsofArabidopsisatahighfrequency.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:3718-3723.Diaz,C.、Purdy,S,、Christ,A.、Morot-Gaudry,J.-R、Wingler，A.和Masclaux-Daubresse,C.(2005)CharacterizationofmarkerstodeterminetheextentandvariabilityofleafsenescenceinArabidopsis.Ametabolicprofilingapproach.PlantPhysiol.138:898—卯8.Diaz,G,、Saliba-Colombani，V.、Loudet,O.、Belluomo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、3、5、7或9任一的核酸分子或其片段或变体。34.植物细胞，其由根据SEQIDNO:l、3、5、7或9任一的核酸或其片段或变体转化。35.制备转基因植物的方法，其包括(1)提供根据SEQIDNO:l、3、5、7或9任一的分离的核酸，或其片段或变体；和(2)将所述核酸分子引入植物，其中所述核酸分子在植物中表达。36.根据权利要求35的方法，其中所述核酸为SEQIDNO:l且植物展示以下一种或多种的提高或改进氮利用、产量、细胞生长、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、花色素苷生物合成、信号转导、基因调控、非生物胁迫耐受和营养组成。37.权利要求35或36的方法，其中使用选自以下的方法将核酸引入植物中微粒轰击、农杆菌介导的转化和颈须介导的转化。38.植物，其使用权利要求35-37中任一项的方法制备。39.权利要求38的植物的种子。40.斥又利要求39的植物的植物细胞。41.包含至少IO个碱基的核苷酸序列的核酸分子的用途，所述序列与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9的任一区域或其功能性片段相同、互补或基本相似，且其中所述用途选自苷酸定位的用途；(ii)作为RFLP分析标记物的用途；(m)作为定量性状关联育种的标记物的用途;(iv)作为标记物-辅助育种的标记物的用途；(V)作为钓饵序列在双杂交体系中用于鉴定编码多肽的序列的用途，所述多肽与钓饰序列编码的多肽相互作用；(vi)作为对个体或个体群进行基因分型或鉴定的诊断指示物的用途；和(vii)用于鉴定基因或外显子边界的遗传分析的用途。42.包含至少IO个碱基的核苷酸序列的核酸分子的用途，所述序列与SEQIDNO:3的区域或其功能性片段相同、互补或基本相似，且其中所述用途选自(i)作为低氮限制适应性标记物的用途；(ii)作为提高的木质素生物合成标记物的用途；或(m)作为低产量标记物的用途。43.针对分离的多肽产生的抗体，其包含(a)多肽序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10，或其片段、结构域、重复或嵌合体；(b)与(a)具有基本相似性的多肽序列；(c)由下述核苷酸序列编码的多肽序列，所述核苷酸序列与SEQIDN():l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9所示核苷酸序列或其片段或结构域或与之互补的序列相同或具有基本的相似性；(d)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在中等严格条件下能够与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9所示核苷酸序列或与之互补的序列杂交；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的功能性片段。44.根据权利要求43的抗体，其中所述多肽包含序列SEQIDNO:2、SEQII)NO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10,或序列SEQIl)NO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQII)N():IO具有保守M酸修饰的变体。45.免疫测定试剂盒，其包含权利要求43或44的抗体及其使用说明。46.根据SEQIDNO:l、3、5、7或9中任一个的核酸分子、其片段或变体用于调节植物细胞中特征的用途。47.根据权利要求46的用途，其中所述特征选自以下一种或多种氮利用、产量、细胞生长、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、信号转导、木质素生物合成、花色素苷生物合成、基因调控、非生物胁迫耐受和营养组成。48.根据权利要求47的用途，其中所述特征是氮利用。49.根据权利要求47的用途，其中所述特征是木质素生物合成。50.根据权利要求47的用途，其中所述特征是花色素苷生物合成。51.根据权利要求47的用途，其中所述特征是产量。52.根据权利要求46-51中任一项的用途，其中所述植物细胞是双子叶植物、棵子植物或单子叶植物。53.根据权利要求52的用途，其中所述植物细胞是双子叶植物。54.根据权利要求52的用途，其中所述单子叶植物选自玉米、小麦、大麦、燕麦、棵麦、粟、高粱、黑小麦、黑麦、单粒小麦、斯佩耳特小麦、双粒小麦、画眉草、蜀黍、亚麻、格兰马草、磨擦草属物种和类蜀栗。55.根据权利要求52或53的用途，其中所述双子叶植物选自大豆、烟草或棉花。56.根据权利要求46-55中任一项的用途，其中所述核酸是SEQIDN():l或其片段，且被调节的特征是以下一种或多种的提高或改进氮利用、产量、细月包生长、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、信号转导、基因调控、花色素苷生物合成、非生物胁迫耐受和营养组成。全文摘要本发明涉及糖感应所需的由氮调节的RING样遍在蛋白E3连接酶基因，和调节该基因的表达以调节植物的特征。本发明的RING样遍在蛋白E3连接酶参与介导植物中的氮限制适应性应答，且其表达受氮状态的影响。该基因或基本类似的基因提高的表达能够产生下述植物，其具有改进的氮利用和提高的产量。文档编号A01H5/10GK101501195SQ200780030037公开日2009年8月5日申请日期2007年6月13日优先权日2006年6月13日发明者M·彭,S·罗斯坦,Y-m·毕申请人:圭尔夫大学