混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产饲料的方法

专利名称：混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产饲料的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产饲料的方法，特别是涉及混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生 产饲料的方法。
背景技术：
词料和食品霉变是全世界普遍存在的问题，据联合国粮农组织(FAO) 2002年资料，全 世界每年约有25%的农作物粮食被霉菌毒素污染，而我国平均每年由于霉变所引起的饲料损 失占总产量的10%以上，最主要的霉变来源于镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素——玉米 赤霉烯酮(zearalenone， ZEA)。从各地饲料厂抽样检测发现，玉米、蛋白质饲料和配合饲 料中ZEA检出率达100。/。，平均浓度为104.99 pg/kg，超标严重。
目前，霉菌毒素的脱毒技术主要采取物理脱毒法(加热、紫外线照射、有机粘土，活性 炭，甘露低聚糖等)和化学脱毒法(酸碱处理，氮化处理，有机溶剂等)。
中国发明专利CN99101577.0公开了一种菜籽饼发酵脱毒新方法，将菜籽饼同发酵剂(淀 粉类副产品或三七糠或玉米粉或麸皮等)按一定比例搅拌均匀，在常温2(TC以上，置于发酵 池(防漏防渗)内加水，水面溢出料面5厘米左右，发酵脱毒，从而得到优质词料。
物理脱毒法主要通过吸附剂吸附去除霉菌毒素，脱毒量有限，而且加入的吸附剂大部分 不能被动物消化吸收，存在吸附饲料中营养物质的不利影响。通过化学试剂的作用去除霉菌 毒素，适用于玉米等籽实类大颗粒霉变饲料的处理，但费时费工，不适合大量霉变饲料的脱 毒，而且对营养成分造成极大的破坏，导致处理后对健康危害的不确定性，并带来环境污染。
奥地利Biomin GmbH公司从一种念珠菌属微生物中筛选出来的毛孢子菌(嗜)霉菌毒素 (7Wc/w印ora"附少co/o;c/m'wram)通过生物学转化效应可降解赭曲霉素和ZEA。
许多微生物对真菌具有拮抗作用，例如食品级的枯草芽孢杆菌和乳酸菌可通过代谢产生 有机酸或产生一些蛋白质类似物如环肽、几丁质酶等抑制真菌生长。饲料中添加枯草芽孢杆 菌可发酵产淀粉酶和蛋白酶，有助于在动物肠道内直接分解、消化词料营养成分，改善消化 道食糜。而添加乳酸菌可赋予产品优良的感官性质，提升发酵饲料的安全性。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可去除玉米酒精残渣中ZEA毒素达 94%以上的混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产饲料的方法。本发明的技术方案如下
混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产饲料的方法，包括如下步骤
(1) 混合菌群的微生态制剂采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌，通过 高密度发酵、离心处理和添加复配后载体制成一种混合菌群的微生态制剂；其中产朊假丝酵 母活菌数为4.0xl08CFU/g以上，枯草芽孢杆菌活菌数为3.8xl()8CFU/g以上，鼠李糖乳杆菌 活菌数为3.0xl08 CFU/g以上；
(2) 伺料的制备将混合菌群的微生态制剂拌料到生产酒精后的玉米残渣中，每公斤生
产酒精后的玉米残渣添加5 10g混合菌群的微生态制剂，喷洒无菌水保持混合料的湿度在 40%以上，30 35。C反应5 10h， 45 50。C烘千2 h以上，使玉米酒精残渣脱毒成为安全的 饲料。
所述的高密度发酵包括如下步骤
a、 用平板活化酵母、枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌1 3天；
b、 挑取单菌落接种于液体种子培养基中，28 37°C, 220 250r/min振摇培养过夜，得 到种液；
c、 取种液按5 10。/。的接种量接入液体富集培养基中，28 37°C， 250 r/min振摇培养过 夜，得到富集培养液；
d、 将所制备的富集培养液按照5 10%的接种量接入发酵罐，产朊假丝酵母和枯草芽孢 杆菌采用连续发酵，发酵温度控制在28 37i:,鼠李糖乳杆菌采用补料分批发酵，发酵温度 控制30 37'C;发酵培养基初始葡萄糖浓度为30~60 g/L，预先配制葡萄糖溶液用于补料； 补料结束时，保证发酵过程总糖浓度为40~120g/L。
所述的离心处理的转速为3000 5000 r/min。
所述的载体为沸石粉和CaC03复配载体，沸石粉的重量百分比为25 75%， CaC03的重 量百分比为25 75%，采用滚筒式搅拌器混合均匀。
本发明采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌作为混合菌群的主要成分，通 过高密度发酵使酵母细胞浓度达到30g/L以上，当菌体添加量达到2.0xl(fCFU/mL时，可在 lh内完全降解1 mg/LZEA。本发明中产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌可从中国 工业微生物菌种保藏中心购买，通过高密度发酵培养，可制成混合菌群微生态制剂，将其处 理玉米酒精残渣，不但可高效降解玉米赤霉烯酮毒素，而且添加枯草芽孢杆菌有助于在动物 肠道内直接分解、消化饲料营养成分，改善消化道食糜；添加乳酸菌可赋予饲料优良的感官 性质，增强动物肠道抵抗力，预防和治疗腹泻，调节微生态平衡，提升发酵饲料的安全性。
本发明具有以下有益效果采用该混合菌群微生态制剂与玉米酒精残渣或其他有毒饲料直接拌料，可去除ZEA毒素 达94%以上。同时，由于添加了具有益生作用的乳杆菌和枯草芽孢杆菌，可促进动物对饲料 的消化，提高增强动物肠道抵抗力，预防和治疗腹泻，调节微生态平衡，使玉米酒精残渣或 其他有毒词料成为安全的词料，并实现了工业残渣的高值化利用。


图1是实施例2的混合菌群微生态制剂降解ZEA效率曲线图。
具体实施例方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保 护的范围并不局限于实施例表示的范围。 实施例1
1. 将保藏的产朊假丝酵母C朋J/ttoCLY01 (购于广东省微生物硏究所菌种保藏中心， GIM2.9)、枯草芽孢杆菌5^//^^&油5柳08 (购于广东省微生物研究所菌种保藏中心， GIM1.135 )和鼠李糖乳杆菌丄acto6fl"7/船core/ subsp. Aow"(wuy 6013 (购于中国工业微 生物菌种保藏中心，6013)分别用麦芽汁固体琼脂培养基(购于广州环凯微生物有限公 司)、LB固体培养基(胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L， NaCl 10 g/L，琼脂20 g/L， pH 7.0)和乳杆菌固体培养基(葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L, 乙酸钠2 g/L，柠檬酸铵2 g/L，吐温80 1 mL /L， MgS04 '71120 0.2 g/L， K2HP04 2 g/L， MnS04 '1120 0.05 g/L, pH 6.5)各自活化培养1天。
2. 挑取单菌落接种于试管中的10 mL种子培养基(种子培养基与活化培养基成份相同，不 含琼脂)中，产朊假丝酵母CLY01在28'C培养，枯草芽孢杆菌H008和鼠李糖乳杆菌6013 在37'C培养，220r/min振摇培养过夜，得到种子培养液。
3. 取种液5mL接入100mL液体富集培养基(富集培养基与活化培养基成份相同，不含琼 脂)中，28 37°C， 220r/min振摇培养过夜，得到富集培养液。
4. 将富集培养液按照约5%的接种量接入发酵罐，产朊假丝酵母CLY01和枯草芽孢杆菌 H008采用连续发酵，发酵温度分别控制在28'C和37°C ,鼠李糖乳杆菌6013采用补料分 批发酵，发酵温度控制37'C。发酵培养基初始葡萄糖浓度为30 g/L，预先配制500g/L葡 萄糖溶液用于补料。补料结束时，检测发酵过程总糖浓度为118.6 g/L。
5. 经高密度发酵后检测酵母细胞浓度和降解ZEA效率，当每升发酵液中干酵母量达到30g 以上，而且添加2.0x107 CFU/mL菌体可在lh内完全降解1 mg/L ZEA时停止发酵；枯草芽孢杆菌在菌体浓度达到8.08xl09 CFU/mL以上时停止发酵；鼠李糖乳杆菌在菌体浓度 达到6.50x108 CFU/mL以上时停止发酵，收菌。
6. 将产朊假丝酵母CLYOK枯草芽孢杆菌H008和鼠李糖乳杆菌6013三菌发酵液混合,4000 r/min离心处理5 min，最终菌泥中的活菌得率为84.6%，其中产朊假丝酵母的含量约 2.43xl09CFU/g，枯草芽孢杆菌约为2.29xl()9CFU/g，鼠李糖乳杆菌约为1.84x109 CFU/g。
7. 将载体(沸石粉和CaC03的质量百分比例为2:1)复配后，与湿菌体以2:1的比例混合， 产品经55。C干燥2h，含水量为1.96%，得到混合菌群微生态制剂，其中三菌的活菌数检 测如下产朊假丝酵母约为4.05xl()8CFU/g,枯草芽孢杆菌约为3.82xl()SCFU/g，鼠李糖 乳杆菌约为3.05x108 CFU/g。
8. 取玉米酒精残渣样品1 kg粉碎，取样用10 mL无菌水浸泡2 h，离心取上清液，用ELISA 检测ZEA含量，计算玉米残渣样品的ZEA含量为83.96 ng/kg。
9. 取混合菌群微生态制剂5 g与粉碎的玉米酒精残渣拌料并混合均匀，喷洒无菌水保持混合 残渣的湿度在40%，用搅拌机30 r/min均速搅拌，30'C反应5h， 45'C烘干2 h，取样检 测其残留ZEA含量为2.96 pg/kg，脱毒率为96.5°/。，使玉米酒精残渣成为安全的动物词料。
实施例2
检测混合菌群微生态制剂在液体样品中降解ZEA的效率。取标准品ZEA配制成含量为 5.23昭/mL的溶液10 mL,取0.5 g实施例1步骤7所制成的混合菌群微生态制剂加入使反应 体系中酵母菌浓度约为2.0x107 CFU/mL，同时取未加入微生态制剂的ZEA溶液作为对照。 反应条件30°C, 200r/min，振荡5 h，分别在0.5 h， 1 h， 1.5 h， 3 h， 5h取样，经5000r/min 条件下离心20 min,取上清液用ELISA检测其ZEA含量，将不同时间所测的实验组和对照 组的ZEA含量作图，如图1所示，可清楚的看到在加入混合菌群微生态制剂反应0 1 h时， 体系中大部分的ZEA被高效降解，反应l 5h时，ZEA降解速率减缓。在反应Ih后，实验 组ZEA含量为0.26吗/mL，脱毒率为95.1%。
实施例3
取玉米酒精残渣样品lkg粉碎，取样用10mL无菌水浸泡2h,离心取上清液，用ELISA 检测ZEA含量，计算配合饲料样品的ZEA含量约为107.15 n^kg，将粉碎的饲料样品与10g 实施例1步骤7所制成的混合菌群微生态制剂拌料并混合均匀，喷洒无菌水保持混合物的湿 度在40%以上，用搅拌机30r/min均速搅拌，30'C反应10 h， 5(TC烘干，取样品检测其残留 ZEA含量为6.43 pg/kg，脱毒率为94.0%。实施例4
取霉菌污染的蛋白质饲料样品lkg粉碎，取样用10mL无菌水浸泡2h，离心取上清液， 用ELISA检测ZEA含量，计算蛋白质饲料样品的ZEA含量约为110.0 ng/kg,将粉碎的饲料 样品与10 g实施例1步骤7所制成的混合菌群微生态制剂拌料并混合均匀，喷洒无菌水保持 混合物的湿度在40%以上，用搅拌机30r/min均速搅拌，30'C反应7h， 5(TC烘干，取样品检 测其残留ZEA含量为5.67 ng/kg，脱毒率为94.8%。
实施例5
1. 将保藏的产朊假丝酵母OmcfetoCLY01 (购于广东省微生物研究所菌种保藏中心， GIM2.9)、枯草芽孢杆菌5a"7/"5 H008 (购于广东省微生物研究所菌种保藏中心， GIM1.135 )和鼠李糖乳杆菌Za"o6a" /船owe/subsp. A"/7awwKM附6013 (购于中国工业微 生物菌种保藏中心，6013)分别用麦芽汁固体琼脂培养基(购于广州环凯微生物有限公 司)、LB固体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L, NaC110g/L，琼脂20 g/L， pH 7.0)和乳杆菌固体培养基(葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L， 乙酸钠2g/L,拧檬酸铵2g/L，吐温80 1mL/L， MgS04 .7H20 0.2 g/L， K2HP04 2 g/L， MnS04'H20 0.05 g/L， pH6.5)各自活化培养2天。
2. 挑取单菌落接种于试管中的IO mL种子培养基(种子培养基与活化培养基成份相同，不 含琼脂)中，产朊假丝酵母CLY01在28。C培养，枯草芽孢杆菌H008和鼠李糖乳杆菌6013 在35'C培养，230r/min振摇培养过夜，得到种子培养液。
3. 取种液7mL接入100mL液体富集培养基(富集培养基与活化培养基成份相同，不含琼 脂)中，28 35°C， 230r/min振摇培养过夜，得到富集培养液。
4. 将富集培养液按照约7%的接种量接入发酵罐，产朊假丝酵母CLY01和枯草芽孢杆菌 H008采用连续发酵，发酵温度分别控制在28'C和35°C，鼠李糖乳杆菌6013采用补料分 批发酵，发酵温度控制35'C。发酵培养基初始葡萄糖浓度为30g/L,预先配制500g/L葡 萄糖溶液用于补料。补料结束时，检测发酵过程总糖浓度为111.4 g/L。
5. 经高密度发酵后检测酵母细胞浓度和降解ZEA效率，当每升发酵液中千酵母量达到30g 以上，而且添加2.0x107 CFU/mL菌体可在lh内完全降解1 mg/L ZEA时停止发酵；枯草 芽孢杆菌在菌体浓度达到8.08x109 CFU/mL以上时停止发酵；鼠李糖乳杆菌在菌体浓度 达到6.50x108 CFU/mL以上时停止发酵，收菌。
6. 将产朊假丝酵母CLY01、枯草芽孢杆菌H008和鼠李糖乳杆菌6013三菌发酵液混合，3000 r/min离心处理5 min，最终菌泥中的活菌得率为89.3%，其中产朊假丝酵母的含量约2.47xl09CFU/g，枯草芽孢杆菌约为2.29xl()9CFU/g，鼠李糖乳杆菌约为1.97><109 CFU/g。
7. 将载体(沸石粉和CaC03的质量百分比例为2:l)复配后，与湿菌体以2:1的比例混合， 产品经55'C干燥2h，含水量为1.92%，得到混合菌群微生态制剂，其中三菌的活菌数检 测如下产朊假丝酵母约为4.12x10s CFU/g，枯草芽孢杆菌约为3.81xl()SCFU/g，鼠李糖 乳杆菌约为3.28x10s CFU/g。
8. 取玉米酒精残渣样品1 kg粉碎，取样用10 mL无菌水浸泡2 h，离心取上清液，用ELISA 检测ZEA含量，计算玉米残渣样品的ZEA含量为101.53 ng/kg。
9. 取混合菌群微生态制剂7 g与粉碎的玉米酒精残渣拌料并混合均匀，喷洒无菌水保持混合 残渣的湿度在40%，用搅拌机30 r/min均速搅拌，35'C反应7h， 48。C烘干2h，取样检 测其残留ZEA含量为4.55 ^g/kg，脱毒率为95.52%，使玉米酒精残渣成为安全的动物饲 料。
实施例6
1. 将保藏的产朊假丝酵母Ca"&VtoCLY01 (购于广东省微生物研究所菌种保藏中心， GIM2.9)、枯草芽孢杆菌5^///^> ^脂^)08 (购于广东省微生物研究所菌种保藏中心， GIM1.135 )和鼠李糖乳杆菌丄fl"o&fld〃j^ owez'subsp. r/2flw"on 6013 (购于中国工业微 生物菌种保藏中心，6013)分别用麦芽汁固体琼脂培养基(购于广州环凯微生物有限公 司)、LB固体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L, NaC110g/L，琼脂20g/L， pH 7.0)和乳杆菌固体培养基(葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L， 乙酸钠2g/L，柠檬酸铵2g/L，吐温80 1mL/L， MgS04'71120 0.2 g/L, K2HP04 2 g/L， MnS04 .H20 0.05 g/L, pH 6.5)各自活化培养3天。
2. 挑取单菌落接种于试管中的IO mL种子培养基(种子培养基与活化培养基成份相同，不 含琼脂)中，产朊假丝酵母CLY01在3(TC培养，枯草芽孢杆菌H008和鼠李糖乳杆菌6013 在35'C培养，250r/min振摇培养过夜，得到种子培养液。
3. 取种液10mL接入100mL液体富集培养基(富集培养基与活化培养基成份相同，不含琼 月旨)中，30 35°C， 250r/min振摇培养过夜，得到富集培养液。
4. 将富集培养液按照约10%的接种量接入发酵罐，产朊假丝酵母CLY01和枯草芽孢杆菌 H008采用连续发酵，发酵温度分别控制在30'C和35°C，鼠李糖乳杆菌6013采用补料分 批发酵，发酵温度控制35'C。发酵培养基初始葡萄糖浓度为30g/L，预先配制500g/L葡 萄糖溶液用于补料。补料结束时，检测发酵过程总糖浓度为107.3 g/L。
5. 经高密度发酵后检测酵母细胞浓度和降解ZEA效率，当每升发酵液中干酵母量达到30g以上，而且添加2.0x107 CFU/mL菌体可在lh内完全降解1 mg/L ZEA时停止发酵；枯草 芽孢杆菌在菌体浓度达到8.08x109 CFU/mL以上时停止发酵；鼠李糖乳杆菌在菌体浓度 达到6.50x108 CFU/mL以上时停止发酵，收菌。
6. 将产朊假丝酵母CLY01 、枯草芽孢杆菌H008和鼠李糖乳杆菌6013三菌发酵液混合，5000 r/min离心处理5 min，最终菌泥中的活菌得率为86.8%,其中产朊假丝酵母的含量约 2.53xl09CFU/g，枯草芽孢杆菌约为2.32xl09CFU/g，鼠李糖乳杆菌约为2.04x109 CFU/g。
7. 将载体(沸石粉和CaC03的质量百分比例为2:l)复配后，与湿菌体以2:1的比例混合， 产品经55"干燥2h,含水量为1.91%，得到混合菌群微生态制剂，其中三菌的活菌数检 测如下产朊假丝酵母约为4.22xl()8CFU/g，枯草芽孢杆菌约为3.87xl()8CFU/g，鼠李糖 乳杆菌约为3.40x108 CFU/g。
8. 取玉米酒精残渣样品1 kg粉碎，取样用10 mL无菌水浸泡2 h,离心取上清液，用ELISA 检测ZEA含量，计算玉米残渣样品的ZEA含量为104.28吗/kg。
9. 取混合菌群微生态制剂10g与粉碎的玉米酒精残渣拌料并混合均匀，喷洒无菌水保持混 合残渣的湿度在40%，用搅拌机30r/min均速搅拌，35'C反应10h， 50'C烘干2h，取样 检测其残留ZEA含量为3.07 Mg/kg，脱毒率为97.01%，使玉米酒精残渣成为安全的动物 饲料。
权利要求
1、混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产饲料的方法，其特征在于包括如下步骤(1)混合菌群的微生态制剂采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌，通过高密度发酵、离心处理和添加复配后载体制成一种混合菌群的微生态制剂；其中产朊假丝酵母活菌数为4.0×108CFU/g以上，枯草芽孢杆菌活菌数为3.8×108CFU/g以上，鼠李糖乳杆菌活菌数为3.0×108CFU/g以上；(2)饲料的制备将混合菌群的微生态制剂拌料到生产酒精后的玉米残渣中，每公斤生产酒精后的玉米残渣添加5～10g混合菌群的微生态制剂，喷洒无菌水保持混合料的湿度在40％以上，30～35℃反应5～10h，45～50℃烘干2h以上，使玉米酒精残渣脱毒成为安全的饲料。
2、 根据权利要求1所述的混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产饲料的方法，其特征在于所述的高密度发酵包括如下步骤a、 用平板活化酵母、枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌1 3天；b、 挑取单菌落接种于液体种子培养基中，28 37°C, 220 250r/min振摇培养过夜，得 到种液；c、 取种液按5 10%的接种量接入液体富集培养基中，28 37°C， 250r/min振摇培养过 夜，得到富集培养液；d、 将所制备的富集培养液按照5 10%的接种量接入发酵罐，产朊假丝酵母和枯草芽孢 杆菌采用连续发酵，发酵温度控制在28 37'C，鼠李糖乳杆菌采用补料分批发酵，发酵温度 控制30 37'C;发酵培养基初始葡萄糖浓度为30~60 g/L，预先配制葡萄糖溶液用于补料； 补料结束时，保证发酵过程总糖浓度为40 120g/L。
3、 根据权利要求1所述的混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产词料的方法，其特 征在于所述的离心处理的转速为3000 5000r/min。
4、 根据权利要求1所述的混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产饲料的方法，其特 征在于所述的载体为沸石粉和CaC03复配载体，沸石粉的重量百分比为25 75%， CaC03 的重量百分比为25 75%。
全文摘要
本发明公开了混合菌群微生态制剂脱毒玉米酒精残渣生产饲料的方法。采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌通过高密度发酵，使产朊假丝酵母活菌数为4.0×10⁸CFU/g以上，枯草芽孢杆菌活菌数为3.8×10⁸CFU/g以上，鼠李糖乳杆菌活菌数为3.0×10⁸CFU/g以上；该制剂直接与生产酒精后的玉米残渣或其他霉菌污染的有毒饲料按5～10g/kg比例拌料，喷洒无菌水保持混合料的湿度40％以上，30～35℃反应2～10h，45～50℃烘干后，可降解玉米酒精残渣或其他有毒饲料中的ZEA，脱毒率达到94％以上，使玉米酒精残渣或其他有毒饲料成为安全的动物饲料。
文档编号A23K1/06GK101411389SQ200810219499
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者余以刚, 刘冬梅, 晖 吴, 唐语谦, 李晓凤 申请人:华南理工大学