专利名称：：一种通过体细胞胚及次生体细胞胚发生途径快繁龙牙楤木的方法
技术领域：
：本发明设及一种通过体细胞发生及其次生体细胞发生的方式，简单快速无性繁殖龙牙橡木的方法。主要是利用一种外源激素(IBA)，从幼苗的叶片、叶柄、根诱导产生体细胞胚、次生体细胞生成，获得大量再生苗的方法。本发明属于农业生物
技术领域：
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背景技术：
：龙牙機木e/afeSeem.)，属五加科檢木属的小乔木，是一种食药两用的植物。其嫩芽含有人体必需的各种氨基酸和微量元素，是一种很好的保健食品，也是我国主要出口创汇的野菜品种之一[赵恒田等，农业系统科学与综合研究，2004]。龙牙德木也是一种重要的药物资源。其提取物具有抗炎、镇静、利尿、强心、免疫和防癌等作用，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治疗和预防有重要意义。近年来，由于龙牙檢木国内外食、药市场需求的增长，掠夺性采挖严重，加上其Q然繁殖率低等原因，导致其野生资源数量非常有限。研究者们对龙牙機木有性和无性繁殖都进行了大量研究。龙牙橡木种子具有休眠的特性，自然发芽人约需6个月，其繁殖率较低。人工对其种子进行催熟处理，至少也需要3个月时间种子才能开夹成熟。且种子繁殖变异率较大，商品性降低。对无性繁殖方法一扦插法，其育苗成活率低，成本高[赵恒田等，中国农学通报，2008]。而且传统的种子繁殖与枝条扦插繁殖，往往造成资源的浪费与植被的破坏。W此，为了提供大量质龙牙檎木种苗，许多研究者对其组培快繁技术进行了研究。龙牙物,木已经从两个途径获得再生苗器官发生和体细胞胚发生。器官发生主要是以龙牙惚木的茎尖、幼叶、嫩#、休眠芽为外植体，附加不同种类和浓度的植物生长调节物质诱导愈伤组织、丛生芽、生根小苗而形成再生植株[曲芳谢等，中国蔬菜，2002;李建民等，青海师范大学学报，2004]。该植株再生方式过程相对繁琐，变异性:人。而体细胞胚发生再生途径相对简单，变异性低。姬惜珠等[中国农学通报，2005]利用龙牙橡木一年生幼茎和根为外植体，添加植物生长调节物质(2，4-D)诱导胚性愈伤组织，然后通过调整外源激素的种类和浓度诱导细胞分化、体细胞胚发生、发育，人约75天获得了体细胞胚再生植株。本发明中，我们通过体细胞胚发生途径获得再生植株的方法过程更简单，所需时间更短(35天)，而且次生体细胞胚能够持续地获得再生植株，极大地提高植物再生效率，为龙牙檢木育种和苗木规模化生产奠定了基础。
发明内容本发明的目的是提供一种更简单，效率更高的龙芽檎木无性繁殖方法-一体细胞胚发生和次生体细胞胚方式。该发明为龙芽惚木进一步的分子育种、规模化生产奠定基础。本发明主要是涉及诱导龙芽檢木体细胞胚发生和获得大量次生体细胞胚的组织培养方法，包括外植体种类、外源植物生长调节物、培养基组成等。具体的技术路线包括以下几个部分的内容]、龙牙檢木体细胞胚的诱导1)将龙牙物、木种子进行层积，使其中的合子胚成熟2)用常规方法消毒种子后，取出其成熟的合子胚接种于1/2MS培养基中进行萌发。一周后以萌发小苗的叶子、叶柄、根段为外植体，于SH+IBA(0.3-5.0mg/L)+蔗糖(2%)的培养基屮诱导体细胞胚发生。暗培3周后，产生不定根，再过两周体细胞胚很快形成。直接形成子叶胚。统计发现，适合不同外植体诱导体细胞胚的最佳IBA浓度分别为3.0mg/L，2.Omg/L,0.3mg/L3)体细胞胚的萌发将体细胞胚转移至无激素的WPM培养基，进行光培养，其迅速萌发生长4)体胚苗的移栽将生长约为5cm的健壮小苗，移栽至1:1的沙子和草炭土中。放置在温室中。4周后，其移栽成活率为89%2、次生体细胞胚的生成我们在进行体细胞胚萌发苗培养过程中，发现有少量的次生体细胞胚生成，闲此进行详细考察了蔗糖浓度(1-7%)和IBA(0.3-4.0mg/L)处理对次生体细胞胚生成的影响，目的是提高无性繁殖的效率。在次生体细胞胚诱导过程中，可观察到不同发育时期的体细胞胚。通过组织切片和电于显显微镜扫描，也证实了次生体细胞胚的形成。形成的次生体细胞胚转移至无激素的1/2WPM培养基中，次生体细胞胚迅速萌发，形成小苗。经过土壤移栽，其成活率与初生体细胞胚苗无显著差异。本发明中所川的培养基都是按常规处理(调整pH值为5.8,经过高温高压灭菌(121°C、1.5个大气压、15分钟))后使用的。本发明的培养环境是在常规组织培养室(温度2426"C，光照强度10001500Lx,光/暗周期16h/8h，湿度60%70%)中进行的。本发明的技术特征1)适合叶子、叶柄和根段的诱导体细胞胚的最佳IBA浓度分别为3.Omg/L，2.Omg/L，0.3mg/L2)次生体细胞胚形成较高的处理是3.Orag/LIBA3)获得体细胞胚和次生体细胞胚的操作更简单4)可以持续不断的获得次生体细胞胚，持续地形成再生植株附图1叶于、叶柄、根段为外植体诱导体细胞胞胚(比例尺为lcm)。Al、A2、A3:分别为叶子、叶柄、根段培养2周后产生的不定根；Bl、B2、B3:分别为三种外植体继续培养3周后产生的体细胞胚；C:根段诱导的体细胞胚放大图；D:C中体细胞胚的分离图附图2从体细胞胚上生成的次生体细胞胚(比例尺为lmm)附图3通过电子显微镜扫描观察到的次生体细胞胚(A)和由组织切片观察到的球形胚(B)附图4体细胞胚萌发生长为小苗(A)(比例尺为lcm)、移栽前长成的小苗(B)(比例尺为lcm)和移栽4周后的小苗(C)(比例尺为5cm)具体实施例方式实例1龙芽檢、木体细胞胚发生的诱导及其植株的再生1)材料来源及层积处理龙芽物木种子采自黑龙江省林业多种经营研究所(牡丹江市)种子园。由于龙芽檢木成熟的果实中，合子胚没有发倉成熟，所以种子发芽存在休眠，要打破休眠，必须进行合子胚后熟处理。我们用的处理方法是层积处理，即将种子先经过简单的消毒处理后与湿沙混合，置于4'C冰箱中。2)无菌实生苗的获得种子层积4个月后，选择开荚的、合子胚发育成熟的种子，在超净工作台中利用常规消毒处理后取出合子胚，接种于事先准备好的V2MS培养基中，使胚萌发长成无菌小苗。3)体细胞胚的诱导'4小苗萌发一周后，切割1Xlcm叶盘、lcm叶柄和lcm根段作为外植体，接种于含有IBA(O.3-5.0mg/L)和蔗糖(2%)的SH培养基中暗培养。每个处理重复培养5个培养皿，每个培养皿放置7个外植体。3周后，外植体出现了不定根。再过2周，体细胞胚由根部直接形成子叶胚，观察不到中间发育过程。利用统计学软件spss分析统计的结果(见下表)发现，IBA能有效的从叶子、叶柄和根段上诱导体细胞胚，诱导率达到100%,但不同的外植体适合的IBA浓度不同，分别为3.0mg/L，2.Omg/L，0.3mg/L。IBA对不同外植体体细胞胚诱导的影响外植体IBA浓度(mg/L)体细胞胚平均诱导率(％)体细胞胚个数(个数)000e0.343.3g5.0c1.062.5e4.3dc叶子2.0100a6.7cb3.0100a11.3a5.030.2h2.0d0000.329.4h5.0c1.086.3c5.0c叶柄2.0100a10.0a3.0100a7.0b5.022.5i4.Odc0000.3100a8.6ba1.097.3b3.7dc根段2.068.6d4.Odc3.057.5f5.0c5.018.5j2.Od注Turkey多重比较。相同字母为相差不显著。5)体细胞胚的萌发、成苗和移栽上述形成的成熟子叶胚，转到不加任何生长调节剂的1/2WPM培养基中进行光培养。体细胞胚迅速萌发成小苗。2周后长成约5cra的小苗，经过5-7天的练苗，移入草炭土与沙子之比为1:l的土壤中，放入温室。4周后的它们的成活率为89%实例3次生体细胞胚发生的诱导及其植株再生1)次生体细胞胚的诱导选取长度约lcm的体细胞胚，接种于含有不同浓度的蔗糖(1-7W的SH培养基中，和含有不同浓度(0.2-3.0mg/L)的IBA及2%蔗糖的SH培养基中诱导次生体细胞胚。每个处理包含5个培养皿，每个培养皿接种12个外植体。暗培养条件。4周后，由统计结果(见下表)显示，IBA比蔗糖更能促进次生体细胞胚的形成，其最佳浓度为3.0mg/L。蔗糖和IBA对次生体细胞胚发生的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2)次生体细胞胚形成及其观察在次生体细胞胚形成过程中，可观察到处于不同发育时期的体细胞胚，通过组织切片和电子显微镜进一步确认了次生体细胞胚的形成。。3)体细胞胚的萌发、成苗和移栽将形成的次生体细胞胚移入无激素的1/2SH培养基中，未发育成熟的体细胞胚都能发育成熟，达到子叶胚时期。将成熟的子叶次生体细胞胚转接于无激素的WPM培养基中，次生体细胞胚迅速萌发，形成小苗。移栽土壤和生长条件与初生体细胞胚苗相同，其成活率与初生体细胞胚苗无显著差异。权利要求1、一种通过体细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙楤木的方法，其特征在于1)龙牙楤木无菌合子胚苗的获得；2)以叶片、叶柄、根段为外植体诱导体细胞胚发生；3)诱导次生体细胞胚发生；4)体细胞胚和次生体细胞胚的萌发、生长和土壤移栽。2、根据权利要求1所述的通过体细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙橡木的方法，其特征在于层积好的开夹种子，经过常规消毒后，取其合子胚接种的培养基为1/2MS培养基(含2%蔗糖)。3、根据权利耍求1所述的通过体细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙橡木的方法，其特征在于以萌发一周的无菌合子胚苗的叶片、叶柄、根段为诱导体细胞胚的外植体。4、根据权利要求1所述的通过体细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙惚木的方法，其特征在于以叶片、叶柄、根段为外植体诱导体细胞胚的培养条件分别为3.0mg/LIAB+SH培养基+2%蔗糖，2.Orag/L丄AB+311培养基+2%蓆糖，0.3mg/LIAB+SH培养基+2%蔗糖。5、根据权利要求1所述的通过休细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙檢木的方法，其特征在于约lcm长的成熟体细胞胚在3.0mg/LIAB+SH培养基+2%蔗糖培养条件下，诱导次生体细胞胚。6、根据权利要求1所述的通过体细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙橡木的方法，其特征在于获得的成熟体细胞胚和次生体细胞胚萌发生长的培养条件是WPM培养基添加2%蔗糖。7、根据权利要求1所述的通过体细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙橡木的方法，其特征在于约5cm的健壮体细胞胚苗，移栽的土壤条件为草炭土与砂子的比例为1比1。全文摘要本发明提供了一种通过体细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙楤木的方法。本发明以龙牙楤木幼苗的叶子、叶柄和根段为外植体，在IBA浓度分别为3.0mg/L、2.0mg/L、0.3mg/L和2％蔗糖的SH培养中暗培养35天，三种外植体的体细胞胚诱导率都可达到100％，且平均每个外植体都产生较多的体细胞胚数(8.6-11.3个)。蔗糖浓度和IBA都可以影响次生体细胞胚的产生，在3.0mg/LIBA+2％蔗糖+SH培养基的培养条件下，中暗培养4周后，100％的体细胞胚上都有次生体细胞胚生成。将获得的成熟初生体细胞胚和次生体细胞胚转入无激素的WPM培养基中，都可迅速萌发生长为小苗。约5cm的健壮小苗移栽土壤中，成活率可达89％。本发明提供的培养简单、再生周期短、可持续获得再生植株的方法，可用于龙牙楤木苗木产业化生产。文档编号A01H4/00GK101548646SQ20091007210公开日2009年10月7日申请日期2009年5月25日优先权日2009年5月25日发明者代金玲,静尹,曾凡锁,由香玲,范桂枝,詹亚光,啸谭,齐凤慧申请人:东北林业大学;由香玲