专利名称：：除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法
技术领域：
：本发明涉及除草剂-抗性的芸苔属植物、和编码抑制AHAS的除草剂-抗性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的新颖的多核苷酸序列、这样的植物的种子、和使用这样的植物的方法。
背景技术：
：乙酰羟酸合酶(AHAS;EC4.1.3.18，也称作乙酰乳酸合酶或ALQ是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物化学合成的第一个酶(Singh(1999)"Biosynthesisofvaline,leucineandisoleucine，，，PlantAminoAcid,Singh,B.K.,编，MarcelDekkerInc.NewYork,NewYork,第227-247页)。AHAS是5个结构上不同的除草剂家族的作用位点，所述除草剂家族包括磺酰脲类(Tan#U(2005)PestManag.Sci.61:246—57;Mallory-Smith禾口Retzinger(2003)WeedTechnology17:620-626；~LaRossa和Falco(1984)TrendsBiotechnol.2:158-161)、咪唑啉酮类(Shaner藥乂(1984)PlantPhysiol.76:545-546)、三唑并嘧啶类(Subramanian和Gerwick(1989)“Inhibitionofacetolactatesynthasebytriazolopyrimidines,，，JALBiocatalysisinAgriculturalBiotechnology,ffhitaker,J.R.禾口Sonnet,P.E..编,ACSSymposiumSeries,AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.,第277-288页)；Tan^A(2005)PestManag.Sci.61:246-57;Mallory-Smith和Retzinger(2003)WeedTechnology17:620-626)；磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类(Tan^A(2005)PestManag.Sci.61:246-57;Mallory-Smith和Retzinger(2003)WeedTechnology17:620-626)；和N-磺酰基氨基羰基类。由于它们在非常低的施用率时的有效性和在动物中的相对无毒性，咪唑啉酮和磺酰脲除草剂被广泛地用于现代农业。通过抑制AHAS活性，这些除草剂家族阻止易感植物(包括许多杂草物种)的进一步生长和发育。为了使农夫对他们使用的咪唑啉酮和磺酰脲除草剂的类型和频率具有更大的灵活性，经常需要更强的除草剂耐受性。另外，开发除草剂耐受品种的植物育种者希望利用提供更大除草剂耐受性的突变，使他们在用于开发他们的品种的种质背景中具有更大的灵活性。为了生产这样的抑制AHAS的除草剂-抗性的品种，植物育种者需要开发额外的育种系，优选具有增加的抑制AHAS的除草剂抗性。因而，需要农作物植物的额外的抑制AHAS的除草剂-抗性的育种系和品种、以及用于生产和使用抑制AHAS的除草剂-抗性的育种系和品种的方法和组合物
发明内容本发明提供了编码乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的分离的核酸分子，所述蛋白包含在与SEQIDNO:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDNO:23的位置S653相对应的位置处的突变。在另一个实施方案中，本发明提供了表达载体，其包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的分离的核酸分子，所述蛋白包含在与SEQIDNO:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDNO:23的位置S653相对应的位置处的突变。在另一个实施方案中，本发明提供了芸苔属植物，其包含编码除草剂耐受性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白包含在与SEQIDNO:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDN0:23的位置S653相对应的位置处的突变。在另一个实施方案中，本发明提供了能生成芸苔属植物的芸苔属种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDN0:23的位置S653相对应的位置处的突变。在另一个实施方案中，本发明提供了芸苔属种子的容器，其中所述容器包含至少10%的能生成芸苔属植物的种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDN0:23的位置S653相对应的位置处的突变。在另一个实施方案中，本发明提供了控制在芸苔属植物附近的杂草的方法，所述方法包括，将有效量的抑制AHAS的除草剂施用给杂草和芸苔属植物，其中所述芸苔属植物在它的基因组中包含诱变过的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)的编码核酸分子的至少一个拷贝，所述核酸分子编码除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDN0:23的位置S653相对应的位置处的突变。本发明也提供了育种芸苔属植物的方法，其中所述方法包括使第一个芸苔属系与第二个芸苔属系杂交，其中所述第一个芸苔属系是通过栽培突变型芸苔属系的种子得到的芸苔属植物；并得到种子。这样的突变型芸苔属系包括&1CL120C7，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9278下保藏；&1CL131A1，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9279下保藏；&1CL140B3，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9402下保藏；和&1CL140C7，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9403下保藏。也提供了命名为下述名称的突变型芸苔属植物系的种子BnCL120C7，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9278下保藏；&1CL131A1，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9279下保藏；&1CL140B3，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9402下保藏；和&1CL140C7，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9403下保藏；PM1PM2/&1CL131A1，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-10321下保藏。本发明也提供了编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的分离的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的位置122相对应的位置处的苏氨酸。本发明另外提供了包含突变的核酸分子的芸苔属植物，所述核酸分子编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的位置122相对应的位置处的苏氨酸。另外，本发明提供了能生成芸苔属植物的芸苔属种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQIDNO:23的位置122相对应的位置处的苏氨酸。本发明另外提供了育种芸苔属植物的方法，其中所述方法包括使第一个芸苔属系与第二个芸苔属系杂交，其中所述第一个芸苔属系是通过培养突变系&1CL131A1的种子(所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9279下保藏)得到的芸苔属植物；并得到种子。本发明也提供了非转基因的芸苔属植物，其包含编码AHAS蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQIDNO:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDNO:23的位置S653相对应的位置处的突变。也提供了用于生产耐受至少一种抑制AHAS的除草剂的非转基因的芸苔属植物的方法，所述方法包括(a)向芸苔属植物细胞中导入在AHAS基因中具有定向突变的基因修复寡核碱基(oligonuclecAase)，以生成具有突变型AHAS基因的植物细胞，所述突变型AHAS基因表达在一个或更多个氨基酸位置处被突变的AHAS蛋白，所述位置与选自SEQIDN0:23的A122、R199、T203、S653和G654的位置相对应；(b)在有抑制AHAS的除草剂存在下，鉴别与对应的野生型植物细胞相比具有基本上正常生长的植物细胞；和(c)从所述植物细胞再生非转基因的除草剂耐受性的具有突变的AHAS基因的芸苔属植物。另外提供了用于生产F1杂种芸苔属种子的方法，所述方法包括，使第一种芸苔属植物与第二种芸苔属植物杂交，所述第一种芸苔属植物具有编码除草剂耐受性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDN0:23的位置S653相对应的位置处的突变；并得到种子。也提供了植物细胞，其包含编码AHAS蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDN0:23的位置S653相对应的位置处的突变。也提供了用于增加植物的除草剂-抗性的方法，所述方法包括，使第一种芸苔属植物与第二种芸苔属植物杂交，其中所述第一种芸苔属植物在它的基因组中包含诱变过的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)的编码核酸分子的至少一个拷贝，所述核酸分子编码除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDN0:23的位置S653相对应的位置处的突变；并得到由杂交产生的种子。另外，提供了包含诱变过的核酸分子和至少一种编码目标蛋白的其它核酸分子的芸苔属植物，所述诱变过的核酸分子编码除草剂耐受性的芸苔属AHASL蛋白，所述除草剂耐受性的芸苔属AHASL蛋白包含在与SEQIDN0:23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQIDN0:23的位置S653相对应的位置处的突变。另外提供了控制在芸苔属植物附近的杂草的方法，所述方法包括，将有效量的至少一种抑制AHAS的除草剂施用给杂草和芸苔属植物，其中所述芸苔属植物在它的基因组中包含第一种AHASL核酸分子的至少一个拷贝和至少一个第二种AHASL核酸分子，所述第一种AHASL核酸分子编码除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQIDN0:23的A122和S653相对应的氨基酸位置处的突变，所述第二种AHASL核酸分子编码第二种除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有选自下述的突变A122T、P197S、A205V、W574L、S653N及其组合。图1提供了芸苔属幼苗提取物中的AHAS活性的图示。图2提供了野生型芸苔属植物和含有本发明的突变的核酸分子的芸苔属植物的一个实例的除草剂喷雾分析的结果。图3提供了本发明的核酸分子(分别是SEQIDNO11_16，按照出现的次序)之间的核酸序列比对。图4提供了本发明的AHAS蛋白(分别是SEQIDNO17_21，按照出现的次序)之间的氨基酸序列比对。图5提供了具有图5所述氨基酸序列的拟南芥AHASL蛋白的核酸和氨基酸序列。DNA序列公开为SEQIDNO:22，氨基酸序列公开为SEQIDNO:23。具体实施例方式本公开内容涉及来自抑制AHAS的除草剂-抗性的植物的编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAQ蛋白的分离的核苷酸和与其有关的方法。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子编码这样的AHAS蛋白，其相对于野生型(即未突变的)欧洲油菜AHAS序列具有一个或更多个氨基酸置换。本公开内容也提供了包含这样的核酸分子的重组载体、以及含有这样的载体和核酸分子的转基因植物。本公开内容也提供了非转基因植物，其包含突变的AHAS编码序列，例如，诱变过的AHASIII编码序列，所述序列相对于野生型序列具有2个或更多个氨基酸置换。突变的AHAS编码序列可以具有在与拟南芥属AHAS蛋白序列(图5;SEQIDNO:23)的位置122相对应的位置处和与位置653相对应的位置处的氨基酸置换。也提供了制备这样的植物的方法和使用这样的植物的育种方法。在有些实施方案中，本发明的植物、种子、方法和组合物使用编码具有突变的AHAS蛋白的核酸分子，所述突变导致具有在与位置122相对应的位置处的丙氨酸-至-苏氨酸置换和在与位置653相对应的位置处的丝氨酸-至-天冬酰胺置换的AHAS蛋白(在本文中有时也称作CLB-1)的表达。在其它实施方案中，本发明的植物、种子、方法和组合物使用编码具有突变的AHAS蛋白的核酸分子，所述突变导致具有在与位置122相对应的位置处被置换的选自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸和在与位置653相对应的位置处被置换的选自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸的AHAS蛋白的表达。也提供了控制杂草的方法，其中使用含有本文提供的突变的AHAS序列的转基因植物和非转基因植物。另外，本申请提供了在本文中称作BnCL120C7、BnCL131Al、BnCL140B3、BnCL140C7的除草剂-抗性的芸苔属系，以及使用下面详细描述的诱变方法生产的其种子、后代和衍生物。本发明也提供了增强的除草剂耐受性和用于得到增强的除草剂耐受性的方法，这通过在单个AHAS编码序列中组合AHAS突变来实现。在一个实施例中，组合与拟南芥属AHAS蛋白序列(图5;SEQIDNO:23)的位置A122和S653相对应的突变的植物表现出这样的增强的除草剂耐受性。得到的除草剂耐受性显著增强，例如，具有协同效应，超过了当将在单独地含有与位置A122或S653相对应的任一个突变的植物中获得的耐受性水平加到一起时观察到的耐受性水平。在更详细地描述本发明之前，首先定义下面的术语。定义“除草剂-耐受的”或“除草剂-抗性的”植物是指这样的植物，其能耐受或抵抗至少一种抑制AHAS的除草剂，所述除草剂的水平通常会杀死或抑制缺少突变的AHAS核酸分子的正常的或野生型植物的生长。“除草剂-抗性的AHAS核酸分子”是指包含一个或更多个突变的核酸分子，所述突变导致相对于未突变的AHAS蛋白的一个或更多个氨基酸置换，其中所述突变导致除草剂-抗性的AHAS蛋白的表达。“除草剂-耐受的AHAS蛋白”或“除草剂-抗性的AHAS蛋白”是指，当存在已知会干扰AHAS活性的至少一种除草剂、且在已知会抑制野生型AHAS蛋白的AHAS活性的除草剂浓度或水平时，与野生型AHAS蛋白的AHAS活性相比，这样的AHAS蛋白表现出更高的AHAS活性。此外，这样的除草剂_耐受的或除草剂-抗性的AHAS蛋白的AHAS活性在本文中可以称作“除草剂_耐受的”或“除草剂_抗性的”AHAS活性。对于本发明，术语“除草剂-耐受的”和“除草剂-抗性的”互换使用，且意在具有等效的含义和等效的范围。类似地，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”互换使用，且意在具有等效的含义和等效的范围。同样地，术语“咪唑啉酮-抗性的”和“咪唑啉酮-抗性”可互换使用，且意在分别具有与术语“咪唑啉酮-耐受的”和“咪唑啉酮-耐受性”等效的含义和等效的范围。使用在Singh,等kAnal.Biochem.,(1988)，171:173-179中公开的方法，通过在有诸如甲氧咪草烟(imazamox)等AHAS抑制剂存在下，对比从来自含有诱变过的AHAS序列的植物和来自缺少诱变过的AHAS序列的植物的细胞提取物的AHAS活性，可以测量“除草剂抗性”或“除草剂耐受性”。在一个实施方案中，当使用100μΜ甲氧咪草烟测定时，使用在Singh等人(1988)中公开的方法，抗性的或耐受性的植物表现出大于25%未抑制。“分离的，，或“纯化的，，核酸分子或蛋白或其生物活性部分大体上或基本上不含这样的组分，所述组分通常与核酸分子或蛋白相伴随或相互作用(当在它的天然存在环境中发现时)。因此，分离的或纯化的核酸分子或蛋白，基本上不含其它细胞材料或培养基(当通过重组技术生产时)，或基本上不含化学前体或其它化学物质(当化学合成时)。在一个实施方案中，“分离的”核酸基本上不含这样的序列(优选地，蛋白编码序列)，其在该核酸所来源的生物体的基因组DNA中天然地侧接该核酸(即，位于该核酸的5’和3’末端的序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的核酸分子可包含小于约5kb,4kb,3kb,2kbUkb,0.51Λ或0.11Λ的核苷酸序列，所述核苷酸序列在该核酸所来源的细胞的基因组DNA中天然地侧接该核酸分子。在有些实施方案中，分离的核酸分子侧接它的天然基因组序列，它们控制它在细胞中的表达，例如，天然的启动子或天然的3’非翻译区。基本上不含细胞材料的蛋13白包括具有低于大约30%、20%、10%、5%或1%(按干重计算)的污染性蛋白的蛋白制剂。当重组生产本发明的蛋白或其生物活性部分时，优选地，培养基具有低于大约30%、20%、10%、5%或1%(按干重计算)的化学前体或非目标蛋白的化学物质。术语“野生型”用于表示可以在自然界中发现的核酸分子或蛋白，其不同于由人类人工地生产的或突变的。在一个实施方案中，“野生型”AHAS核酸序列是指图3中的BN-02的核酸序列。类似地，野生型芸苔属植物是指具有图3中的BN-02的核酸序列的芸苔属植物。该术语也用于表示含有图3中的BN-02的AHAS核酸序列的植物。术语“野生型”的使用无意必然地暗示，该植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在它的基因组中缺少重组DNAdP/或不具有不同于本文公开的那些的除草剂-抗性的特征。“突变的”分子或“突变型分子”或“诱变过的”分子，诸如核酸分子或氨基酸分子，是指与未突变的或野生型分子的等效位置处的核酸或氨基酸相比，具有一个或更多个核酸或氨基酸置换、缺失或颠换的核酸分子或多肽。该术语表示从它的天然的或野生型形式修饰而成的核酸分子或多肽分子(作为故意人操作的结果)，且不包括天然序列。本文使用的术语“协同”、“协同的，，和其衍生词(诸如在“协同效应，，中)表示这样的情况，其中2个或更多个突变的AHAS多肽的组合和/或单个编码序列中的突变的组合(诸如编码具有在与位置A122和S653相对应的位置处的突变的AHAS多肽的AHAS核酸分子)的生物活性，比具有单个突变的AHAS多肽的生物活性的总和大至少10%。通过在用诸如甲氧咪草烟等抑制AHAS的除草剂处理之后15天，对比含有本发明的诱变过的分子的植物的损伤率和含有各个突变的植物的复合损伤率，可以测量AHAS多肽的生物活性。“等效位置”或“对应位置”表示在与参照氨基酸位置相同的保守区域中的位置。例如，关于AHAS蛋白序列，本文公开的氨基酸位置对应着在具有图5所示的氨基酸序列(图5；SEQIDNO:23)的拟南芥AHASL蛋白中的氨基酸位置。除非本文中另外指出，特定氨基酸位置表示在图5所示的全长拟南芥AHASL氨基酸序列(SEQIDNO:23)中的该氨基酸的对应位置。此外，实际氨基酸位置可以随是否添加或删除氨基酸(例如，从氨基酸序列的N-端)而异，但是，通过与诸如图5(SEQIDNO:23)等参照序列的比对，仍然可以确定等效位置。因而，本发明包括在所述位置或等效位置(例如，“氨基酸位置653或等效位置”)处的氨基酸置换。“片段”是指编码AHASL蛋白的核苷酸序列的一部分或本发明的AHAS蛋白的氨基酸序列的一部分。本发明的AHASL核苷酸序列的片段可以编码AHASL蛋白的生物活性部分，或它可以是使用下述方法用作杂交探针或PCR引物的片段。AHAS多肽的片段可以包括AHAS蛋白的生物活性片段。术语“生物活性片段和变体”是指包含或编码AHAS活性的例证的核酸分子和多肽的片段和变体。本文使用的术语“调节元件”是指能调节可操作地连接的核酸的转录和/或翻译的核酸。调节元件包括、但不限于启动子、增强子、内含子、5’UTR和3’UTR0术语“可操作地连接的”是指调节元件和第二种核酸之间的功能连接，其中所述调节元件序列参与控制第二种核酸序列的表达，例如启动和/或介导与第二个序列相对应的DNA序列的转录和/或翻译。通常，可操作地连接的是指，被连接的核酸序列是连续的，且在必要时，连接邻近的且在相同读码框中的两个蛋白编码区。14本文使用的术语“转基因的”是指含有至少一个重组核酸分子的全部或一部分的任意细胞、组织、植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。核酸分子在一个方面，本发明涉及与乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)序列有关的分离的核酸分子，所述AHASL序列包含相对于它来源的野生型(即天然的)核酸序列具有突变的核酸序列，以及包含这样的突变的这种序列的片段。这样的分离的核酸序列包括图3和4的那些。在另一个方面，本公开内容涉及包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码相对于野生型蛋白具有突变的AHASL蛋白，其能提供对抑制AHAS的除草剂的耐受性或增强的抗性水平，还涉及这样的突变型AHASL蛋白。在一个实施方案中，所述AHASL编码序列是突变的芸苔属AHASL编码序列，例如相对于野生型序列含有2个突变的欧洲油菜AHASIII编码序列。在另一个实施方案中，本发明提供了编码除草剂-抗性的芸苔属AHASLIII蛋白的核酸分子的分离和其核苷酸序列，其来自通过诱变野生型芸苔属植物生产的除草剂-抗性的芸苔属植物。所述核酸分子可以源自任意来源，诸如植物或细菌来源。在一个实施方案中，所述核酸分子源自植物来源，诸如芸苔属植物。从芸苔属植物衍生出的核酸分子可以源自任意芸苔属物种，包括欧洲油菜该naPUS)、宪菁(β.rapa)或芥菜(5.Jffi^m)。这样的核酸分子可以源自任意的AHAS编码序列，诸如AHASI,AHASII或AHASIII。在一个实施方案中，所述核酸分子在核酸序列中包含突变，所述突变是在与从AHASL编码序列的ATG起始密码子算起的氨基酸位置122(例如GCT—ACT)和/或653(例如AGT—AAT)处的密码子序列相对应的位置。但是，在本公开内容的范围内，在与氨基酸位置122和653相对应的位置处，可以产生任意突变。此外，在AHAS序列的位置122和653处的突变可以导致AHAS蛋白的表达，所述AHAS蛋白具有在与位置122相对应的位置处的非丙氨酸的任意氨基酸或在与位置653相对应的位置处的非丝氨酸的任意氨基酸。在一个实施方案中，在与位置122和653相对应的位置处的突变可以是保守氨基酸置换，而在其它实施方案中，所述置换可以分别是在位置122和653处的苏氨酸或天冬酰胺的保守置换。在另一个实施方案中，在与位置122相对应的位置处的突变导致选自苏氨酸和缬氨酸的氨基酸在该位置处的表达。在另一个实施方案中，在与位置653相对应的位置处的突变导致天冬酰胺氨基酸的表达。在一个实施方案中，由本发明的核酸分子编码的AHAS蛋白包含在与AHASL基因的位置653(基于拟南芥编号)相对应的位置处的丝氨酸-至-天冬酰胺置换(例如S653N)和在与位置122相对应的位置处的丙氨酸-至-苏氨酸置换(例如A122T)。但是，在本公开内容的范围内，可以在这些位置产生任意氨基酸置换，包括保守氨基酸置换。本发明另外公开了编码野生型芸苔属AHASL蛋白的核酸分子的分离和其核苷酸序列。在有些实施方案中，本发明的核酸分子编码具有突变的AHAS蛋白，所述突变导致具有在与位置122相对应的位置处的丙氨酸-至-苏氨酸置换和在与位置653相对应的位置处的丝氨酸-至-天冬酰胺置换的AHAS蛋白的表达。在其它实施方案中，所述核酸分子编码具有突变的AHAS蛋白，所述突变导致具有在与位置122相对应的位置处被置换的选自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸和在与位置653相对应的位置处被置换的选自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸的AHAS蛋白的表达。本发明的诱变过的AHAS多肽序列可以表现出对任意抑制AHAS的除草剂的抗性或耐受性。这样的诱变过的AHAS多肽序列可以是对至少一种抑制AHAS的除草剂抗性的或耐受性的。在一个实施方案中，本发明的诱变过的AHAS多肽序列表现出对选自咪唑啉酮除草剂和磺酰脲除草剂的抑制AHAS的除草剂的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，本发明的诱变过的AHAS多肽序列表现出对咪唑啉酮除草剂的抗性或耐受性。在有些实施方案中，具有在与位置A122和S653相对应的位置处的突变的诱变过的AHAS序列会提供协同的除草剂耐受性水平。在一个实施方案中，与在含有具有各个单个突变的AHAS序列的植物中观察到的耐受性累加水平相比，在含有本发明的双突变型AHAS序列的植物中得到的除草剂耐受性水平高了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。在具有在与位置A122和S653相对应的氨基酸位置处的突变的诱变过的AHAS序列与一个或更多个额外的编码AHAS-抑制剂耐受性AHAS蛋白的诱变过的或重组的AHAS序列的组合的植物中，也可以得到这样的协同的除草剂耐受性水平。还公开了编码欧洲油菜AHASIII蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与位置122相对应的位置处的丙氨酸-至-苏氨酸置换(A122T)。在一个实施方案中，这样的核酸分子也在核酸序列中含有第二种突变，例如在编码在与位置653相对应的位置处的丝氨酸-至-天冬酰胺置换(S653N)的核酸分子中。本公开内容也提供了具有在图3和4中所述的BN02-120或BN02-131的核酸序列的分离的核酸分子、及其片段和变体。本公开内容也提供了编码来自芸苔属的AHASL蛋白的分离的核酸分子，其具有一个或更多个核酸置换，所述核酸置换导致具有一个或更多个氨基酸置换的AHAS蛋白的表达。例如，本发明提供了分离的核酸分子，其包含在图3和4中所述的BN02-120或BN02-131的核苷酸序列，编码包含由图4所述的BN02-102或BN02-131鉴别出的氨基酸序列的AHASL蛋白的核苷酸序列，图3所述的核苷酸序列，编码包含由图4中的BN02-120或BN02-131所述的氨基酸序列的AHASL蛋白的核苷酸序列，和编码功能性AHASL蛋白的这样的核苷酸序列的片段和变体。除了与位置122和/或653相对应的那些突变以外，本发明的诱变过的AHAS序列包括具有任意数目的突变的那些。例如，所述诱变过的AHAS序列可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个额外的突变，它们可以是沉默突变，或提供对相同或其它种类的抑制AHAS的除草剂的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码图3和4所示的氨基酸序列的核苷酸序列的分离的核酸分子，以及它们的编码具有AHAS活性的多肽的片段和变体。另外提供了具有由本文所述的核酸分子(例如在图3和4中所述的核苷酸序列(鉴别为BN02-120或BN02-131))编码的氨基酸序列的多肽，和它们的编码包含AHAS活性的多肽的片段和变体。本发明也提供了AHASL蛋白，其具有在本文公开的芸苔属AHASL蛋白的保守区域内的鉴别的氨基酸位置处的氨基酸置换。本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白组合物。本发明提供了包含突变的AHAS蛋白的分离的多肽。所述分离的多肽包含选自下述的氨基酸序列图4所述的BN02-120或BN02-131的氨基酸序列，由图3所述的核苷酸序列BN02-120或BN02-131编码的氨基酸序列，氨基酸序列，和编码包含AHAS活性的AHAS多肽的所述氨基酸序列的功能片段和变体。公开的核酸分子可以用于核酸构建体中，所述核酸构建体用于转化植物，例如，农作物植物，诸如芸苔属植物。在一个实施方案中，含有本公开内容的核酸分子的这种核酸构建体可以用于生产转基因植物，以提供对除草剂的抗性，所述除草剂例如已知会抑制AHAS活性的除草剂，诸如咪唑啉酮除草剂。所述核酸构建体可以用于表达盒、表达载体、转化载体、质粒等中。用这样的构建体转化后得到的转基因植物表现出增加的对抑制AHAS的除草剂(例如，咪唑啉酮和磺酰脲除草剂)的抗性。因而，本发明包括AHASL核酸分子和其片段和变体。本发明也包括作为这些核苷酸序列的片段的核酸分子。在一个实施方案中，与来自野生型序列的对应序列相比，所述片段包含至少一个突变的序列。可以如下制备AHAS蛋白的生物活性部分分离本发明的AHAS核苷酸序列之一的一部分，表达编码的AHAS蛋白的部分(例如，通过在体外重组表达)，并评估编码的AHAS蛋白的部分的活性。作为AHAS核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900个核苷酸，或高达在本文公开的全长核苷酸序列中存在的核苷酸的数目，这取决于预期用途。编码本发明的AHAS蛋白的生物活性部分的AHAS核苷酸序列片段至少编码约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225或250个连续氨基酸，或高达在本发明的全长AHAS蛋白中存在的氨基酸总数。可用作PCR引物的杂交探针的AHAS核苷酸序列片段通常不需要编码AHAS蛋白的生物活性部分。在一个实施方案中，AHAS序列的片段包括一个或更多个本文公开的突变。本发明还包括作为本文公开的核苷酸序列的变体的核酸分子。本发明的AHAS核苷酸序列的“变体”包括这样的序列，其编码本文公开的AHAS蛋白，但由于遗传密码的简并性而保守地不同。使用熟知的分子生物学技术，例如下面概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，可以鉴定这些天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括合成地衍生出的核苷酸序列，其如下所述已经通过例如使用定点诱变而产生，但仍编码在本发明中公开的AHAS蛋白。一般地，本发明的核苷酸序列变体会与本文公开的特定核苷酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。变体AHAS核苷酸序列分别编码具有这样的氨基酸序列的AHAS蛋白，所述氨基酸序列与本文公开的AHAS蛋白的氨基酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。此外，技术人员还会认识到，可通过突变向本发明的核苷酸序列中引入变化，从而导致所编码的AHAS蛋白的氨基酸序列的变化，而不改变AHAS蛋白的生物活性。因此，通过向本文公开的对应核苷酸序列中引入一个或更多个核苷酸置换、添加或缺失，从而将一个或更多个氨基酸置换、添加或缺失引入所编码的蛋白中，可以产生编码AHAS蛋白的分离的核酸分子，所述核酸分子具有不同于图3所述的BN02-120或BN02-131的序列的序列。通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变和本文所述的那些，可以导入突变。本发明还包括这样的变体核苷酸序列。例如，在一个实施方案中，可在一个或更多个预测的非必需的氨基酸残基处进行保守氨基酸置换。“非必需的”氨基酸残基是可从AHAS蛋白的野生型序列k例如，图5的序列(SEQIDNO:23))进行改变而不改变生物活性的残基，而“必需的”氨基酸残基是生物活性所必需的。“保守氨基酸置换”是这样的置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。在本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，门冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。不对保守氨基酸残基或存在于保守基序中的氨基酸残基进行这样的置换。可以以许多途径来改变本发明的蛋白，包括氨基酸置换、缺失和插入。用于这样的操作的方法在本领域中是普遍已知的。例如，通过DNA中的突变，可以制备AHAS蛋白的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488—492;Kunkel^A(1987)MethodsinEnzymo1.154:367-382;美国专利号4，873，192;Walker和Gaastrgi,编(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillanPublishingCompany,NewYork)和其中引用的参考文献。关于不影响目标蛋白的生物活性的合适氨基酸置换的指南，可以参见Dayhoff等人，(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型，所述参考文献通过引用并入本文。保守置换，例如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸互换，可以是优选的。或者，通过沿着AHAS编码序列的全部或一部分随机地引入突变(例如通过饱和诱变)，可以制得变体AHAS核苷酸序列，并可以就AHAS活性对所得的突变体进行筛选，以鉴定保留了AHAS活性(包括除草剂-抗性的AHAS活性)的突变体。诱变后，可重组地表达所编码的蛋白，并可使用标准测定技术来确定蛋白的活性。因此，本发明的核苷酸序列包括本文公开的序列及其片段和变体。本发明的AHASL核苷酸序列及其片段和变体可用作探针和/或引物。这样的探针可用于检测编码相同或同一蛋白的转录物或基因组序列。以该方式，可使用诸如PCR、杂交等方法来鉴定具有与本发明的序列相当大同一性的此类序列。参见，例如，Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:LaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY),禾口Innis等人，(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NY)。本发明包括基于其与本文所示的AHAS核苷酸序列或其片段和变体的序列同一性而分离的AHASZ核苷酸序列。在杂交方法中，已知的AHAS核苷酸序列的全部或一部分可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建这样的cDNA和基因组文库的方法在本领域中是普遍已知的，并公开于Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY)中。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并可以用可检测的基团(例如或任何其它可检测的标记物(例如其它放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)进行标记。通过标记基于本文公开的已知AHAS核苷酸序列的合成的寡核苷酸，可以制备用于杂交的探针。另外可以使用简并引物，所述简并引物是基于在已知的AHAS核苷酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计。探针通常包含这样的核苷酸序列区域，其在严格条件下与本发明的AHAS核苷酸序列或其片段或变体的至少约12、优选约25、更优选约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800或900个连续核苷酸杂交。用于杂交的探针的制备在本领域中是普遍已知的，并公开于Sambrook(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork),该文献通过弓丨用并入本文。例如，本文公开的完整的突变的AHAS核酸序列或者其一个或更多个部分可用作能够特异性地与对应AHAS序列和信使RNA杂交的探针。杂交技术包括涂板的DNA文库的杂交筛选(斑或集落；参见，例如，Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。可在严格条件下进行此类序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件，，意指这样的条件，在该条件下，探针与其靶序列的杂交程度将会比与其它序列的杂交程度可检测地更高(例如，为背景的至少2倍高)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下是不同的。在一个实施方案中，严格条件是这样的，其中，在pH7.O至8.3时，盐浓度是小于约1.5MNa离子，通常为约0.01至1.0MNa离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)，温度为至少约30°C，且对于长探针(例如，大于50个核苷酸)，温度为至少约60°C。还可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来获得严格条件。示例性的低严格条件包括，在37°C使用30-35%的甲酰胺、1MNaCl,1%SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，和在50-55°C在IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中进行洗涤。示例性的中等严格条件包括，在37°C在40-45%的甲酰胺、1.0MNaCl,1%SDS中进行杂交，和在55-60°C在0.5X至IXSSC中进行洗涤。示例性的高严格条件包括，在37°C在50%的甲酰胺、1MNaCl,1%SDS中进行杂交，和在60_65°C在0.1XSSC中进行洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1%至约1%SDS0杂交的持续时间通常小于约M小时，通常为约4至约12小时。特异性通常随杂交后洗涤而变化，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，可根据Meinkoth和Wahl,(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式:Tm=81.5°C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)—0.61(%form)—500/L，估算出Tm；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，且L是以碱基对表示的杂交物的长度。Tm是这样的温度(在确定的离子强度和PH下)，即在该温度下，50%的互补靶序列与完美匹配的探针杂交。对于每1%的错配，Tm下降约1°C；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以与具有所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有>90%的同一性的序列，那么可将Tm下降10°C。一般地，选择严格条件，以使其比在确定的离子强度和PH下特定序列与其互补序列的热解链点(Tm)低约5°C。然而，非常严格条件可在比热解链点(Tm)低1、2、3或4°C下进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可在比热解链点(Tm)低6、7、8、9或10°C下进行杂交和/或洗涤；低严格条件可在比热解链点(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下进行杂交和/或洗涤。使用公式、杂交和洗涤组合物、以及想要的Tm，普通技术人员将会理解，内在地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格度的变化。如果想要的错配程度导致低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)的Tm，则优选地增加SSC浓度，以可以使用更高的温度。关于核酸的杂交的详尽指导，可以参见Tijssen,(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第1部分,第2章(Elsevier,NewYork)；禾口Ausubel等人编(1995)CurrentProtocoIsinMolecularBiology,第2章(GreenePublishingandffiley-Interscience,NewYork)。参见Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。本发明的核酸分子和蛋白包括，包含与图3和4所述的BN02-120或BN02-131的核苷酸序列充分同一的核苷酸或氨基酸序列的核酸分子和蛋白。术语“充分同一的”在本文中用于表示这样的第一氨基酸或核苷酸序列，其相对于第二氨基酸或核苷酸序列而言包含足够或最少数目的相同的或等同的(例如，具有相似的侧链)氨基酸残基或核苷酸，这样第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含具有至少约45%、55%或65%同一性、优选75%的同一性、更优选85%、95%或98%的同一性的共同结构域的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定义为充分同一的。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比随这些序列共有的相同位置的数目而变化(即，同一性百分比=相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)χιοο)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。使用与下面描述的技术相似的技术，可以确定两个序列之间的同一性百分比，其中允许或不允许缺口。在计算同一性百分比时，一般计算准确匹配的数目。可使用数学算法来确定两个序列之间的同一性百分比。用于两个序列的比较的数学算法的优选的非限定性实例是Karlin和Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法，在Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中改进的算法。将此类算法整合入Altschul等人，(1990)J.Mol.BioL215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可使用NBLAST程序，得分=100，字长=12，来进行BLAST核苷酸搜寻，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可使用XBLAST程序，得分=50，字长=3，来进行BLAST蛋白搜寻，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对(gappedalignment)，可以如Altschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389中所述使用GappedBLAST。或者，可使用PSI-Blast来进行可检测分子之间远缘关系的迭代搜寻。参见Altschul等人，(1997)，同上。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。用于序列比较的数学算法的另一个优选并且非限定性实例是Myers和Miller，(1988)CABIOS4:11-17的算法。将此类算法整合入ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表(PAM120weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。也可通过目检而人工地进行比对。20除非另外指出，本文提供的序列同一性/相似性值是指使用本发明的全长序列和使用多重比对而获得的值，所述多重比对使用软件包VectorNTIAdvance10(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中包含的程序AlignX(使用缺省参数)或其任何等同的程序，通过算法ClustalW(NucleicAcidResearch,22(22):4673-4680,1994)来进行。“等同的程序”意指任何序列比较程序，其对于所研究的任何两个序列，当与由软件包VectorNTIAdvance10中的AlignX产生的对应比对进行比较时，产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。本发明的突变型AHASL蛋白包括公开的蛋白以及其变异和经修饰的形式。这样的变体将继续拥有希望的AHAS突变型活性。在一个实施方案中，在编码变体蛋白的核酸分子中的这种突变必须不能将序列置于读码框之外，且优选地将不形成可产生二级mRNA结构的互补区。参见，欧洲专利申请发明者B·辛赫,C·肖普克,D·卡尔森,G·戈卡尔,J·皮尔斯,J·麦克埃尔弗,K·沃克,P·比萨姆申请人:巴斯夫农化产品有限公司