专利名称：：一种昆虫病原线虫的繁殖方法
技术领域：
：本发明涉及一种线虫的繁殖方法，属于生物繁殖培养领域。
背景技术：
：昆虫病原线虫是一种专门寄生害虫的线虫，它具有寄主范围广、能主动寻找寄主、对人畜及环境安全无毒、并能人工大量培养等优点，能够有效防治农林、园艺植物的土栖和钻蛀性害虫，如桃小食心虫、各种蛴螬、天牛、地老虎等，因此被国内外专家称为高潜能生物防治武器。昆虫病原线虫繁殖主要分为活体繁殖和离体人工培养基繁殖，其中离体人工培养基繁殖又分为固体培养和液体培养，两方法均需要多种原料和大型的仪器设备，投资高，操作步骤多，生产周期长。而活体繁殖方法简便、所用仪器设备很少、生产周期短，繁殖的线虫致病力高于离体人工培养基繁殖的线虫。目前活体繁殖主要采用大蜡螟和黄粉虫幼虫，由于多年来大蜡螟和黄粉虫人工饲养成本较高，制约了活体繁殖线虫的发展，随着黄粉虫人工饲养新技术的研究与推广，年产量不断上升，其成本大幅度下降，使活体大量繁殖昆虫病原线虫成为可能。活体繁殖需要培养介质，据国外文献报道主要采用滤纸做介质，存在不容易控制湿度、单位面积产量较低的问题。申请号为"2006100165635"、名称为"工厂化昆虫病原线虫活体高倍繁殖方法"的专利申请，公开了昆虫病原线虫繁殖采用蛭石做介质，繁殖容器为布袋和尼绒袋，需要定期喷水来保持湿度，线虫繁殖进展情况不易观察，蛭石做介质虽然控制湿度方便，但成本较高。
发明内容为了解决昆虫病原线虫繁殖速度慢、成本高、产量低的问题，本发明提供了一种快速、环保、低成本的昆虫病原线虫的繁殖方法，其所采取的技术方案为该繁殖方法的具体步骤如下(1)对干植物碎屑进行高压湿热灭菌处理；(2)处理后的植物碎屑放凉，然后加入水搅拌均匀，所加水的重量与干植物碎屑的重量比为1.52.5:1;(3)加水后的植物碎屑装入透明培养容器内，该培养容器的容量为加水后植物碎屑体积量的1.52倍，然后在培养容器内依次加入黄粉虫活体和每毫升含1200015000条昆虫病原线虫的悬浮浓液，所加黄粉虫活体的重量与干植物碎屑的重量比为1:24，所加悬浮浓液的体积量为每10克黄粉虫活体配比1/3毫升悬浮浓液；(4)把培养容器封口，并使容器口留有空隙保持通气，然后放置在温度为252『C的培养室内进行繁殖培养，培养期的第2、3天各摇动培养容器一次；(5)当观察到培养容器内壁上爬满昆虫病原线虫时繁殖培养完成，即可进行水洗收获或者直接使用。上述植物碎屑包括树木锯末、枝条粉碎物以及作物秸杆粉碎物的任一种或者混合3物。上述培养容器为透明的玻璃瓶、塑料瓶、塑料袋和塑料盒的任一种。上述步骤(5)中的水洗收获是把培养容器内全部培养物倒入100200目的细筛内，然后浸泡在清水表层中，使昆虫病原线虫爬入清水内，待线虫沉淀后把上部清水倒掉，进而收集繁殖培养后的昆虫病原线虫。本发明采用透明玻璃瓶、塑料瓶、塑料袋和塑料盒中的一种作为繁殖容器，易于观察；采用黄粉虫活体作为寄主昆虫，成本低；采用晒干或者烘干的树木锯末或枝条粉碎物或棉花、玉米、小麦、水稻、大豆、花生等作物秸杆粉碎物作为培养介质，原料易得；采用灭菌设备进行灭菌，使用控温培养室进行培养，使用仪器设备少；所加悬浮浓液为少量的清水中加昆虫病原线虫活体混合而成，该悬浮浓液有利于昆虫病原线虫的存活，并便于昆虫病原线虫的加入。与现有技术相比，具有以下优点和效果1、原料易得、价格便宜，操作简便，使用仪器设备少，可进行大规模工业化生产，节约水电与人工，投资成本很低。2、以植物碎屑做培养介质，可以解决目前农林废弃物的处理问题，可不需经过专门清洗和冷链贮运直接施用防治害虫，培养介质还对植物具有一定的肥效，既对人类和植物有益，又不污染环境，符合农业可持续发展。3、通过该方法繁殖培养的昆虫病原线虫，产率和成活率高，侵染害虫具有很强的致病力，生产周期短，仅需715天，有利于昆虫病原线虫生物防治农业、林业、果树、蔬菜、草坪等害虫技术的实施与推广。具体实施例方式下面以树木锯末为实施例对本发明做进一步说明该昆虫病原线虫繁殖方法步骤具体如下(1)把树木锯末晒干或烘干，制成100克干锯末作为植物碎屑，然后使用灭菌设备对干锯末进行高压湿热灭菌；(2)处理后的锯末放凉，然后加入200克水搅拌均匀；(3)加水后的锯末装入作为培养容器的透明玻璃瓶内，其体积量占玻璃瓶容量的1/2;然后在玻璃瓶内依次加入30克黄粉虫活体和l毫升昆虫病原线虫悬浮浓液，该悬浮浓液每毫升含15000条昆虫病原线虫活体，既每加1克黄粉虫活体加入500条昆虫病原线虫；(4)把玻璃瓶封口，并使瓶口留有空隙保持通气，然后放置在温度为25t:的培养室内进行繁殖培养，培养期的第2、3天各摇动玻璃瓶一次；(5)当观察到玻璃瓶内壁上爬满昆虫病原线虫时繁殖培养完成，即可进行水洗收获或者直接使用。当需要水洗收获时，把玻璃瓶内全部培养物倒入100目的细筛内，然后浸泡在清水表层中，使昆虫病原线虫爬入清水内，待线虫沉淀后把上部清水倒掉，形成悬浮浓液，进而收集繁殖培养后的昆虫病原线虫。也可以直接带碎屑或兑水施入土壤防治土栖害虫，或把培养容器转移到冷藏条件下储存备用。以下为采用锯末作为培养介质和采用蛭石作为培养介质繁殖昆虫病原线虫的对比试验，结果报告如下1试验材料与方法1.1试验材料培养介质选用白皮松锯末，取自泰安市木材加工场新锯下的锯末。对照材料为蛭石，从山东农业大学购买。两种试验材料均经过干燥、灭菌消毒处理。供试昆虫黄粉虫老龄幼虫，从泰安花鸟市场购买。供试线虫嗜菌异小杆线虫HeterorhabditisbacteriophoraH06培养容器无色透明广口塑料瓶，直径8厘米，高度15厘米。1.2试验设计处理1:锯末70克+自来水130毫升+黄粉虫20克处理2:蛭石180克+自来水100毫升+黄粉虫20克每处理重复3次。1.3操作方法在培养介质内加入自来水搅拌均匀，把介质装入塑料瓶(占容器的1/2)，同时加入黄粉虫活体，然后加入昆虫病原线虫悬浮液1毫升，其中黄粉虫与昆虫病原线虫的比例是1克黄粉虫加500条线虫。封上容器口，并保持一定的通气性，放置到温度25-26t:的培养室内，培养期间，第2天、3天各摇动一次，待发现容器壁上爬满线虫时进行收获。1.4结果调查与统计培养5天时，调查线虫对黄粉虫的侵染致死率。观察出线虫时间，收获后调查每瓶繁殖的线虫数量。然后用繁殖出的线虫侵染大蜡螟幼虫，调查其致病力，测定方法为培养皿滤纸法。2、试验结果与分析2.1不同培养介质下昆虫病原线虫繁殖效果表1试验结果表明，处理后5天白松锯末处理的黄粉虫被线虫的平均寄生率为85.96%，显著高于蛭石处理的寄生率34.37%，说明在锯末中线虫容易侵染黄粉虫，而在蛭石中较难，这可能与两介质的松散度对透气性影响有关。白松锯末加水后蓬松性好，因此透气性好，有利于线虫、黄粉虫的呼吸与活动，增加了二者接触机会。蛭石加水后蓬松性差，容易沉积，因此透气性差。培养12天，两介质处理同时繁殖出线虫。经过连续清洗后调查繁殖线虫的数量，发现白松锯末处理的线虫产量显著高于蛭石处理的产量，与前面的寄生率有关。由于蛭石在水中容易粉化，清洗时线虫液中杂质多，不方便观察线虫。2.1两钟繁殖方法的成本与特点比较表1两种培养介质下昆虫病原线虫繁殖结果5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种昆虫病原线虫的繁殖方法，其特征在于具体步骤如下(1)对干植物碎屑进行高压湿热灭菌处理；(2)处理后的植物碎屑放凉，然后加入水搅拌均匀，所加水的重量与干植物碎屑的重量比为1.5～2.5∶1；(3)加水后的植物碎屑装入透明培养容器内，该培养容器的容量为加水后植物碎屑体积量的1.5～2倍，然后在培养容器内依次加入黄粉虫活体和每毫升含12000～15000条昆虫病原线虫的悬浮浓液，所加黄粉虫活体的重量与干植物碎屑的重量比为1∶2～4，所加线虫悬浮浓液的体积量为每10克黄粉虫活体配比1/3毫升悬浮浓液；(4)把培养容器封口，并使容器口留有空隙保持通气，然后放置在温度为25～28℃的培养室内进行繁殖培养，培养期的第2、3天各摇动培养容器一次；(5)当观察到培养容器内壁上爬满昆虫病原线虫时繁殖培养完成，即可进行水洗收获或者直接使用。2.根据权利要求1所述的一种昆虫病原线虫的繁殖方法，其特征在于植物碎屑包括树木锯末、枝条粉碎物以及作物秸杆粉碎物的任一种或者混合物。3.根据权利要求1所述的一种昆虫病原线虫的繁殖方法，其特征在于培养容器为透明的玻璃瓶、塑料瓶、塑料袋和塑料盒的任一种。4.根据权利要求l所述的一种昆虫病原线虫的繁殖方法，其特征在于步骤(5)中的水洗收获是把培养容器内全部培养物倒入100200目的细筛内，然后浸泡在清水表层中，使昆虫病原线虫爬入清水内，待线虫沉淀后把上部清水倒掉，进而收集繁殖培养后的昆虫病原线虫。全文摘要本发明公开了一种昆虫病原线虫的繁殖方法，采用透明培养容器作为繁殖容器，采用黄粉虫活体作为寄主昆虫，采用植物碎屑作为培养介质，采用灭菌设备进行灭菌，使用控温培养室进行培养，不仅明显解决了植物秸秆、木材的废弃污染问题，同时大大降低了生产原料成本、简化了生产和使用步骤，繁殖培养出的昆虫病原线虫成本低、质量好、防治效果高，可广泛应用于防治农、林、园艺等植物的地下害虫和隐蔽性害虫。文档编号A01K67/033GK101779611SQ20101011212公开日2010年7月21日申请日期2010年2月10日优先权日2010年2月10日发明者孙瑞红,张勇,李晓军,李爱华,王涛,辛力申请人:山东省果树研究所