专利名称：通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法
技术领域：
本发明属于生物技术育种或作物遗传育种领域，涉及一种玉米遗传转化的方法。
背景技术：
玉米属于高产作物，是世界三大粮食作物之一，既是粮食，也是饲料和工业原料，在我国乃至世界粮食生产中占有重要的战略地位。目前，玉米新品种的培育主要靠常规育种方法，依据表型进行人工选择，实现优良基因重组。但由于作物的表型性状易受外界环境条件干扰和季节的影响，育种周期长，规模大，但相对效率较低，预见性也差；另外，有性杂交受到种间隔离的限制，大大限制了玉米外源基因资源的利用。 随着植物转基因技术的迅猛发展，使得转基因工程技术育种成为可能。转基因技术打破了物种之间的生殖隔离障碍，可定向改造植物的遗传性状，外源基因的导入丰富了植物基因资源，弥补了常规育种方法的不足，使作物育种得到了前所未有的发展。作物转基因技术已经成为农业生物技术的核心领域，正在成为作物遗传改良的极为重要的辅助手段。目前，世界各国纷纷将作物基因工程育种技术作为国家发展战略，特别是玉米转基因工程育种技术。在国外，以美国孟山都公司为代表的很多生物技术公司的玉米转基因技术体系目前非常成熟，已经达到大规模转化的程度，而我国在玉米转基因技术研究方面相对滞后。 尽管国玉米转基因技术相对成熟，但在实际应用中多依赖于以未成熟胚作为外植体诱导胚性愈伤组织，再进行转化，而玉米愈伤组织的诱导及培养受其基因型的影响较大，具有重要经济价值的玉米骨干自交系的未成熟幼胚为外植体诱导愈伤组织再分化的难度很大，只有少数骨干自交系基因型材料能通过组织和细胞培养再生出大批植株，并且会带来细胞无性系、再生植株生活力减弱、结实率较低等一系列问题。因此，玉米转基因技术的规模化应用很大程度上仍然受到制约。 目前，用于玉米遗传转化方法有很多，可分为两大类载体介导法和DNA直接导入法。载体介导法包括农杆菌介导法和病毒介导法。迄今为止，所获得的转基因植物中约80%是利用根癌农杆菌介导法转化而来的；DNA直接导入法主要包括基因枪法、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、电击法、阳离子转化法、微注射法等。这些方法基本上都依赖于转化细胞的脱分化和再分化的组织培养过程，即需要建立高频率的玉米植株再生体系，才能实现外源基因的转移，获得转基因植株。 玉米高效组织培养与再生体系的建立依赖于基因型，大多数基因型材料的组织培养特性差，胚性愈伤组织和植株再生率低，很难用于遗传转化，这直接影响了遗传转化技术的应用。目前为止，只有少数玉米基因型易于组织培养，如A188、H99等，可用于遗传转化。虽然玉米转基因研究已有大量报导，转基因玉米已经大面积推广，但以自交系为材料产生大量转基因植株仍然是玉米基因工程育种的主要制约因素。当前用于玉米生产的骨干自交系组织培养特性差，很难用于转基因工作。因此，玉米基因工程育种就必须克服基因型障碍，建立经济、有效的转基因技术体系。
随着全球转基因玉米产业化进程的迅速推进，包括中国在内的世界各国对具有重要经济价值的玉米骨干自交系的转基因研究及规模化转基因技术的需求日益增大。就转基因玉米产业化的核心技术而言，研发高效的外源基因转化技术，特别是不依赖于受体材料基因型、操作简单、廉价的转基因新技术及其技术集成将是本领域未来的发展趋势。近年来，科研工作者开始致力于不依赖于组织培养的遗传转化方法，取得了一定的进展，如超声波处理的花粉管通道法、农杆菌介导的玉米芽尖侵染法、农杆菌介导的合子胚侵染法、农杆菌介导的花絮浸蘸法、子房滴注法等。但也都存在转化效率相对较低等缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法。 本发明建立玉米转基因的方法技术方案是玉米开始拔节后(约出现10个叶片，第一节高出地面约10cm，幼穗长约lcm)，用微型注射器在玉米幼穗生长部位顶端注入农杆菌，同时将幼穗轻微划伤，使农杆菌浸染幼穗，收获玉米成熟种子后进行种植，后代植株经过除草剂筛选与分子鉴定，获得转基因植株。
具体步骤为 1.种植欲转化的玉米自交系，直至玉米生长到开始拔节后(约出现IO个叶片，第一节高出地面约10cm，幼穗长约lcm)。 2.将含有目的基因的农杆菌用LB培养基过夜培养，用转化培养液悬浮(0D6。。=0. 5-1. 0)。所述转化液以MS培养基为基本成分，附加表面活性剂Silwet-77、TritonX-100、乙酰丁香酮(AS) 、6-BA、 IAA、水解酪蛋白、L-脯氨酸和甘露醇。 3.用微型注射器在玉米幼穗生长部位顶端注入农杆菌，同时将植株内部幼穗轻微
划伤，使农杆菌浸染幼穗，伤口部位用纸巾和保鲜膜封合，3天后在伤口处喷洒多菌灵，重新
用纸巾和保鲜膜封合伤口部位，以防伤口被杂菌侵染，影响植株生长。 4.开花时植株按正常玉米自交系自交授粉，成熟后收获种子。 5.后代种子种植后经过除草剂抗性筛选，分子鉴定后(PCR、Southern杂交)获得
转基因植株。 本发明提供的玉米转基因方法，是在玉米开始拔节后(约出现10个叶片，第一节高出地面约10cm，幼穗长约lcm)。 本发明提供的玉米转基因方法，转化部位为活体植株内lcm长度(约在高出地面约10cm高度的第一节上部)的生长锥(幼穗)。 本发明中，转化培养液中的Silwet-77的用量为100ul/L，TritonX-100为100u1/L， AS为20mg/L，6-BA为0. 5ug/L， IAA为0. 5mg/L，水解酪蛋白为200mg/L， L-脯氨酸为500mg/L，甘露醇为20mg/L。 Silwet-77为表面活化剂。TritonX-100为非离子表面活化剂，具有湿润作用，也为细胞破膜剂/细胞通透剂，即在细胞膜上形成穿孔，有助于农杆菌进入细胞体内，提高转化率。AS(乙酰丁香酮)利于外源基因的转化。6-BA、 IAA等植物激素利于植物细胞的生长，主要用于修复农杆菌侵染形成的伤口 。 本发明中所用农杆菌为EHA105，载体为pG4A-TCH，带有目的基因TCH(木霉几丁质酶基因，1. 3kb，抗真菌相关基因)、35S启动子、Bar基因筛选标记。
本发明在玉米营养生长阶段用农杆菌感染幼穗，不需要经过原生质体培养、细胞培养、组织培养以及植株再生等遗传转化过程。操作简单、方便、经济适用且转化效率较高，植株感染后多数生长发育正常，能自交结实，具有重要的应用价值。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明 实施例1 :农杆菌浸染幼穗获得转抗病基因(TCH)玉米 1试验材料 1)东北玉米骨干自交系铁7922作为供试植物材料。
2)菌株农杆菌菌株为EHA105， 3)载体为pG4A，带有目的基因TCH (木霉几丁质酶基因，1. 3kb，抗真菌相关基因)、35S启动子、Bar筛选标记基因。
2转化方法 1)农杆菌的培养取-7(TC低温冰箱保存的农杆菌EHA105(含有pG4A-TCH质粒)，接种于含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，28t:过夜培养。挑取单菌落，接种于5ml含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，28°C 、200rpm培养24小时。取lml菌液接种于100ml含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，28°C 、200rpm培养14小时。菌液于4t:、4000rpm离心5分钟，收集菌体，用转化培养液重悬，稀释至0D6。。值为0. 8。
转化培养液以MS培养基为基本成分，附加表面活性剂Silwet-77(100ul/L)、TritonX-100(100ul/L)、乙酰丁香酮(AS) (20mg/L) 、6_BA(0. 5ug/L) 、IAA(0. 5mg/L)、水解酪蛋白(200mg/L) 、 L-脯氨酸(500mg/L)和甘露醇(20mg/L)。 2)遗传转化与筛选在田间玉米自交系"铁7922"开始拔节后，约出现10个叶片，第一节高出地面约10cm，此时植株幼穗长约lcm左右，用10ml注射器在植株第一节上部约lcm高度慢慢注入，同时将植株内部幼穗轻微划伤，使农杆菌浸染幼穗，伤口部位用纸巾和保鲜膜封住，3天后在伤口处喷洒多菌灵，重新用纸巾和保鲜膜封合伤口部位，以防伤口被杂菌侵染，影响植株生长。 3)植株生长至开花期正常自交授粉，玉米成熟后收获种子。 4)将所收获种子下一年播种于小塑料营养钵内，待小苗长出2-3片叶时喷洒200卯m除草剂(Basta)，将成活苗移栽于田间。
3转基因植株分子检测 田间移栽苗成活后，取幼嫩叶片，用CTAB法提取转基因植株的基因组DNA， PCR引物为上游引物5' CAG TTG AGA AGA GAG CCA GC3'下游引物5' ACT GAT ACG ACC AAGCTC 3' PCR反应程序为首先94t:变性5min ;然后30个循环循环步骤为94"C变性lm，57t:退火lm，72t:延伸lm30s ;最后72。C补充延伸10min。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪分析，PCR产物片段大小为648bp。经过PCR筛选的转基因植株进一步经过Southern杂交验证，说明目的基因已经转入玉米中。
权利要求
一种通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法，其特征是采用以下步骤完成(1)种植欲转化的玉米自交系，直至玉米生长到开始拔节后；(2)将含有目的基因的农杆菌用LB培养基过夜培养，用转化培养液悬浮；(3)用微型注射器在玉米幼穗生长部位顶端注入农杆菌，同时将植株内部幼穗轻微划伤，使农杆菌浸染幼穗，伤口部位用纸巾和保鲜膜封合，3天后在伤口处喷洒多菌灵，重新用纸巾和保鲜膜封合伤口部位；(4)开花时植株按正常玉米自交系自交授粉，成熟后收获种子；(5)后代种子种植后经过除草剂抗性筛选，分子鉴定后获得转基因植株；其中步骤(2)中所述转化液以MS培养基为基本成分，附加表面活性剂Silwet-77、TritonX-100、乙酰丁香酮(AS)、6-BA、IAA、水解酪蛋白、L-脯氨酸和甘露醇。
2. 根据权利要求1所述的通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法，其特征在于转化部位为活体植株内lcm长度的生长锥。
3. 根据权利要求1所述的通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法，其特征在于转化培养液中的Silwet-77的用量为100ul/L，TritonX-100为100ul/L，AS为20mg/L，6_BA为0. 5ug/L， IAA为0. 5mg/L，水解酪蛋白为200mg/L， L_脯氨酸为500mg/L，甘露醇为20mg/L。
4. 根据权利要求1所述的通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法，其特征在于农杆菌为EHA105，其载体为pG4A-TCH，并带有目的基因TCH、35S启动子和Bar基因筛选标记。
全文摘要
一种通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法，属于生物技术育种及作物遗传育种领域，是在玉米开始拔节后，用微型注射器在玉米幼穗上部注入农杆菌，同时将幼穗轻微划伤，使农杆菌浸染幼穗，收获玉米成熟种子后进行种植，后代植株经过除草剂筛选与分子鉴定，获得转基因植株。本方法不依赖于组织培养，突破了遗传转化中基因型的限制，操作简便且转化效率高，具有很强的实用性。
文档编号A01H5/00GK101775409SQ20101012555
公开日2010年7月14日 申请日期2010年3月17日 优先权日2010年3月17日
发明者于志晶, 李淑芳, 林秀峰, 马瑞 申请人:吉林省农业科学院