专利名称：农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法
技术领域：
本发明涉及麻风树的组织培养技术领域及基因工程领域，尤其是指农杆菌介导对 麻风树进行基因转化的方法，从而获得转基因植株。
背景技术：
麻风树(Jatopha curcas)，又名小桐子、柴油树，为大戟科麻风树属，多年生落叶 灌木或小乔木，分布于热带和亚热带地区。它为喜光阳性植物，根系粗壮发达，具有较强的 耐干旱瘠薄能力，可以种植在其他植物不易生长的土地上，是干旱地区理想的造林树种。麻 风树种仁含油量高达50% 60%，可以提炼出不含硫、无污染、符合欧四排放标准的生物 柴油，是世界公认的生物能源树；也可作药用，常用于清热解毒，消肿散瘀等；近年来的研 究发现，该植物还具有显著的抗癌活性。因此麻风树具有广泛的开发利用价值。目前，我国在麻风树育种方面的工作才刚刚开始。由于麻风树多为野生状态，又为 木本植物，采用常规育种来改变其遗传性状十分困难。因此，采用现代生物技术手段，如转 基因技术进行辅助育种成为首选。植物转基因技术的前提是高效的离体再生系统。近些年 来，麻疯树组织培养技术也获得成功，采用的外植体有种胚、子叶、上胚轴、下胚轴、叶柄、叶 片，胚乳，花药，甚至老龄树(20年以上)长出的幼嫩茎段，然而再生频率有待进一步提高。植物转基因技术因能主动导入外源基因，定向改造植物性状日益受到人们的重 视。植物遗传转化技术可分为两大类一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体 法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表； 另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法。以根癌农杆 菌介导的植物遗传转化是目前最有效的途径之一。然而，由于麻风树的遗传转化研究起步 较晚，因此，对麻风树进行遗传改良，通过导入外源基因，对其进行定向性状改造，具有十分 重要的经济价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方 法，解决现有育种技术无法遗传改良的问题。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案农杆菌介导对麻风树进行基因转 化的方法，包括以下步骤(1)制备麻风树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养；(2)共培养后的外植体接入筛选培养基C13PC进行培养，从而获得抗性愈伤组织， 所述筛选培养基C13PC是含有l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素；(3)分化出不定芽；以及(4)生根培养，从而获得转基因植株。所述第(1)步骤中，共培养优选采用C13A培养基含有50-200 u M乙酰丁酰酮。所述第(1)步骤中，共培养采用优选采用C13A固体培养基，其含有1. 0-3. Omg/L6_苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，以及50-200 y M乙酰丁酰酮的MS培养基；麻风树 外植体的制备经由以下工艺挑选麻风树种子经消毒后，取出完整的胚和子叶，于MS培养 基培养，获得子叶，切制成外植体；农杆菌菌液是优选采用C13A液体培养基重悬浮离心收 集的农杆菌体制得。所述第(1)步骤中，获得麻风树外植体工艺中，接种于MS培养基萌发，是将接好的 材料先暗培养2-4天，然后光照培养10-12天，种子萌发的培养条件是，温度23-26°C，光照 12-16小时/天，光照强度1800-20001x。所述第(1)步骤中，农杆菌菌液的准备、浸染及共培养，进一步包括以下工艺步 骤(a)挑取农杆菌的单克隆于含有抗生素的YEP液体培养基中，28°C，200rpm震荡培 养20-24小时，然后按照1 100转接，震荡培养至对数生长期，0D600 = 0.8-1.0，将菌液 转入50ml离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，用C13A液体培养基重新悬浮农杆 菌，调至0D600 = 0. 3-0.6，28°C震荡培养1-2个小时，备用；(b)将切好的叶片放入容器中，加入准备好的菌液，置于摇床慢速震荡5-15分钟； 以及(c)取出浸染过的材料，倒掉菌液，将叶片放在滤纸上，吸去多余的菌液，接入 C13A固体培养基，置于23-26°C黑暗共培养2_4天。所述第(2)步骤的筛选培养基C13PC是优选采用含有1. 0-3. Omg/L 6_苄基嘌呤， 0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，l_3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠
的MS培养基。所述第(2)步骤进一步包括以下工艺步骤(a)取出共培养后的外植体，放入容器中，加入无菌水洗后，用含250_500mg/L头 孢霉素的无菌水洗；(b)洗过的愈伤组织放在滤纸上，吸去多余的水，接入筛选培养基C13PC，所述筛 选培养基C13PC较佳采用MS培养基含1. 0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁 酸，l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠，2-3%蔗糖，0. 7%琼脂， 以及pH5. 8-6.0)；以及(c)置于23_26°C暗培养14_21天，获得抗性愈伤组织。所述第(3)步骤，是将获得的抗性愈伤组织，转入分化培养基SR13PC进行培养，该 分化培养基SR13PC优选含l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素。所述第(3)步骤的分化培养基SR13PC较佳采用MS培养基含0. 25-2. 0mg/L6-苄 基嘌呤，0. 1-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L赤霉素，l_3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉 素，250-500mg/L头孢霉素，20_30g/L蔗糖，7g/L琼脂，以及pH5. 8-6. 0 ；接好的抗性愈伤组 织在23-26°C，光照培养10-60天即可得到不定芽，培养条件为，光照12-16小时/天，光照 强度 1800-20001x。所述第(4)步骤进一步包括以下工艺步骤将分化出的不定芽优选在0. 1-1. Omg/ L的3-吲哚丁酸溶液中浸泡2-10分钟后，接种到1/2MS培养基进行生根培养，10-60天即 可生根，生根培养条件为，23-26°C，光照12-16小时/天，光照强度1800-20001X，从而获得
转基因植株。
上述农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，农杆菌携带有目的基因。本发明的有益效果如下本发明利用农杆菌浸染和共培养，在有效的抗性愈伤组 织筛选和分化体系基础上，对麻风树进行转基因，使采用转基因方法导入功能基因对麻风 树进行遗传改良成为可能，转化效率可达10%左右甚至10%以上。因农杆菌介导的转化方 法具转化的基因多为单拷贝，且有明确的边界序列，遗传稳定，多数符合孟德尔遗传规律， 成本低廉，且麻风树离体再生系统稳定性好，操作简便，再生效率高，从愈伤组织的诱导到 再生植株的获得只需要80-90天。本发明选择了合适的筛选剂浓度，建立了有效的抗性愈伤组织筛选体系，既避免 了非转化愈伤的大量逃逸，又获得了抗性愈伤组织。与其他部位相比，利用麻风树的成熟种子萌发后的子叶作为外植体不仅愈伤得出 率和愈伤分化率较高，且不受季节的限制，为大批量进行农杆菌转化奠定了良好的基础。本发明在抗性愈伤组织分化阶段采用了合适的筛选剂浓度，既对非转化植株进行 了抑制，避免了后期大量的分子检测工作，又保证了抗性植株的正常生长和分化。本发明在抗性植株生根阶段选用吲哚丁酸溶液浸泡，获得了较高的生根率。
图1是本发明转基因植株的PCR检测图。
具体实施例方式本发明农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法主要涉及以下个步骤步骤一种子的消毒及萌发；步骤二 农杆菌转化和共培养；步骤三农杆菌的去除及抗性愈伤组织的诱导；步骤四分化出不定芽；步骤五生根培养；步骤六再生植株的移栽；以及步骤七转基因植株的PCR检测。下面对各步骤进一步描述。其中步骤一，采集中国本土野生麻风树种子。挑取饱满的种子，剥去外壳，经消毒 处理后剥去胚乳，将完整的胚和子叶接种在MS培养基上萌发，得到无菌苗。MS 培养基含 20_30g/L 蔗糖，7g/L 琼脂，以及 pH5. 8-6. 0。种子的消毒方法包括以下工艺步骤(1)75% (体积比)乙醇浸泡30秒；(2)无菌水洗2-3次；(3) 0. 1 % g/mL 升汞浸泡 3-5 分钟；(4)倒出升汞，用无菌水洗4-6次，每次5分钟；(5)加入无菌水，浸泡2-4小时；(6)剥去胚乳，取完整的胚和子叶，接种于MS培养基(20_30g/L蔗糖，7g/L琼脂， PH5. 8-6. 0)中，每瓶培养基接2-3颗；
(7)接好的材料先在暗培养2-4天，然后光照培养10-12天。种子萌发的培养条件是，温度23-26 V，光照12_16小时/天，光照强度 1800-20001x。步骤二中还主要包括以下工艺步骤1、农杆菌菌液的准备，具体为 挑取农杆菌的单克隆，如EHA105，LBA4404, GV3101等，分别含有表达载体如 PEV-GUS, pBI-GUS-hyg, pBI-GUS-bar等，或其它携带目的基因的载体，于含有相应抗生素 的YEP液体培养基中，28°C，200rpm震荡培养20-24小时，然后按照体积比为1 100转接 YEP液体培养基中，震荡培养至对数生长期，农杆菌的浓度为0D600 = 0. 8-1. 0。将菌液转 入50mL离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，用C13A液体培养基重新悬浮农杆菌， 调至0D600 = 0. 3-0. 6，28°C培养1-2个小时，备用。其中，所用YEP液体培养基配方及PH值为10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，IOg/ L氯化钠，pH7. 0。C13A液体培养基是指MS培养基中含1.0-3.0mg/L 6_苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/ L3-吲哚丁酸，50-200 μ M 乙酰丁酰酮，20-30g/L 蔗糖，pH5. 8-6. 0。2、农杆菌转化和共培养，进一步包括以下工艺(1)取灭菌的盘，中间垫上两层滤纸；(2)取出无菌苗，用剪刀剪下长势较好的子叶，放入盘中；(3)然后加入少量水，用刀将其切成0. 5X0. 5cm大小；(4)将切好的叶片放入50或IOOmL三角瓶中，加入准备好的菌液，置于摇床慢速摇 5-15分钟；(5)取出浸染过的材料，倒掉菌液，将叶片放在滤纸上，吸去多余的菌液，接 入C13A固体培养基；其中C13A固体培养基是指MS培养基含1. 0-3. Omg/L 6-苄基 嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚 丁酸，50-200 μ M 乙酰丁 酰酮，20_30g/L 蔗糖，7g/L 琼脂， ρΗ5· 8-6. 0 ；(6)接好的材料在23-26 °C暗培养2-4天。所述步骤三进一步包括以下工艺(1)取出共培养后的材料，放入50或IOOmL三角瓶中；(2)加入无菌水洗2-3次；(3)加入含500mg/L头孢霉素的无菌水洗2_3次，每次5分钟；(4)洗过的材料放在滤纸上，吸去多余的水，接入筛选培养基C13PC ；该筛选培 养基C13PC是指MS培养基含1.0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸， l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠，20_30g/L蔗糖，7g/L琼脂， ρΗ5· 8-6. 0 ；(5)接好的材料在23-26°C暗培养14-21天，获得抗性愈伤组织。步骤四进一步包括以下工艺步骤(1)将获得的抗性愈伤组织，转入分化培养基SR13PC ；该分化培养基SR13PC是指 MS培养基含 0. 25-2. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 1-1. 0mg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L赤霉素， l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢霉素，20_30g/L蔗糖，7g/L琼脂，以及 ρΗ5· 8-6. O ；(2)接好的材料在23-26°C，光照培养10_60天即可得到不定芽。培养条件为，光 照12-16小时/天，光照强度1800-20001x。步骤五中，将分化出的不定芽在0. 1-1. Omg/L的3_吲哚丁酸溶液中浸泡2_10分 钟后，接种到生根培养基上10-60天即可生根。生根培养基为，1/2MS培养基。生根培养条件为，23_26°C，光照12-16小时/天，光照强度1800_20001X。步骤六中，待再生苗根长到2 3cm时进行炼苗移栽。步骤七中，用CTAB法提取再生植株的基因组DNA，以目的基因序列设计引物，进行 PCR扩增，检测获得转基因植株。通过以上的方法可以实现麻风树进行基因转化，其以根癌农杆菌对植物释放的化 学物质产生趋化反应，向植物受伤组织集中。经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆 菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。Vir基因产物使Ti质粒上的T-DNA进入植物细 胞，并整合到植物核基因组中。而目的基因插入在T-DNA左右边界区内，因此插入在T-DNA 左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因(如植物抗病抗逆 相关CN基因和ERFs基因)在植物细胞中得到表达。携带各种不同目的基因的农杆菌，按 上述方法均可实现介导，这样根据插入的目的基因不同，就可以实现对麻风树进行定向改 造，从而实现对麻风树的遗传改良，以提高其各种特性，如提高油含量、产量，抗寒，抗病，抗
圼绝 千寸。下面结合实例详述描述本发明的实施方案。需要说明的是，下述实例是说明性的， 不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。实例1本实例以农杆菌介导将⑶S基因转入云南元谋野生麻风树，具体阐述本发明创造 的方法，样品的总数量以及经各处理步骤后的存活数量请参考表1。各工艺步骤具体如下步骤一采集云南元谋野生麻风树种子。挑取饱满的种子，剥去外壳，75%乙醇中 浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，然后在0. 1 %氯化汞中消毒3-5分钟，无菌水冲洗5-7次， 然后用无菌水浸泡2-4小时后剥去胚乳。取完整的胚和子叶，接种于MS培养基中，每瓶接 2-3颗，23-26°C暗培养2-4天后转入光照培养10-12天，得到实验用的无菌苗。步骤二 挑取农杆菌EHA105(含有表达载体PEV-GUS)的单克隆于含有抗生素利福 平(20mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP培养基中，28°C，200rpm震荡培养20-24小时，然后 按照1 100体积比转接至300mLYEP培养基中，震荡培养对数生长期，农杆菌浓度为0D600 =0. 8-1. O。将菌液转入50mL离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，用C13A液体 培养基(MS培养基含1. 0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，50-200 μ M乙 酰丁酰酮，20-30g/L蔗糖，以及pH5. 8-6. 0)重新悬浮农杆菌，调至0D600 = 0. 3-0. 6，28 V 培养1-2个小时，备用。取灭菌的盘，中间垫上两层滤纸。选取生长健壮，叶面平整均勻的无菌苗子叶，力口 入少量水，切成0. 5X0. 5cm(但不限于)大小。将切好的叶片放入50或IOOmL三角瓶中， 加 入准备好的菌液，置于摇床慢速摇10分钟。然后取出浸染过的材料，倒掉菌液，将叶片 放在滤纸上，吸去多余的菌液，接入C13A固体培养基(MS培养基含1. 0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，50-200 μ M乙酰丁酰酮，20_30g/L蔗糖，7g/L琼脂，以及 ρΗ5· 8-6. 0)，置于 23-26°C 暗培养 2-4 天。
步骤三取出共培养后的材料(外植体部数为580块)，放入50或IOOmL三角瓶 中，加入无菌水洗2-3次，再用含500mg/L头孢霉素的无菌水洗2_3次，每次5分钟。洗过 的材料放在滤纸上，吸去多余的水，接入筛选培养基C13PC (MS培养基含1. 0-3. Omg/L 6-苄 基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，l_3mg/L 草胺磷，250_500mg/L 头孢噻肟钠，20_30g/L 蔗糖，7g/L琼脂，以及pH5. 8-6. 0)，23_26°C暗培养14-21天，获得抗性愈伤组织320块，抗 性愈伤组织率为55. 2%左右，见表1。步骤四将获得的抗性愈伤组织，转入分化培养基SR13PC(MS培养基含 0. 25-2. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 1-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L 赤霉素，l_3mg/L 草 胺磷，250-500mg/L 头孢霉素，20-30g/L 蔗糖，7g/L 琼脂，以及 pH5. 8-6. 0)，23-26°C，光照培 养30天即可得到不定芽。培养条件为，光照12-16小时/天，光照强度1800-20001X。分化 愈伤存活70块，抗性愈伤组织分化率为18%。步骤五将分化出的不定芽在0. 5mg/L的3_吲哚丁酸溶液中浸泡5分钟后，接种 到生根培养基1/2MS上光照培养30天即可生根，待再生苗根长到2 3cm时进行炼苗移栽 至温室。获得再生植株数为55株。
最后，用CTAB法提取再生植株的基因组总DNA，以⑶S基因序列设计一对引物P 1 5' GTGAGCGTCGCAGAAC ATTAC 3'P4 5' ACGCCATTTGAAGCCGATGT 3‘进行PCR扩增，检测获得转基因植株，参照图1，其中7为负对照(未转化植株)， 1-5为转基因样品(其它样品因无信号而从视图上省略)，8为负对照(水)，6为正对照(质 粒)，9为DNA分子标量(DNA Ladder)。经PCR扩增结果显示，有5株样品扩出与质粒正对 照大小一致的条带(约IOOObp)，呈阳性，为转基因植株。其转化效率为9. 1%。表1本发明实例中的抗性愈伤组织得出率及分化率
权利要求
农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，包括以下步骤(1)制备麻风树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养；(2)共培养后的外植体接入筛选培养基进行培养，从而获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基含有1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素；(3)分化出不定芽；以及(4)生根培养，从而获得转基因植株。
2.如权利要求1所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于所述 第(1)步骤中，共培养所用培养基含有50-200 yM乙酰丁酰酮。
3.如权利要求2所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于所述 第⑴步骤中，共培养采用C13A固体培养基，其含有1. 0-3. Omg/L6-苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，以及50-200 u M乙酰丁酰酮的MS培养基；麻 风树外植体的制备经由以下工艺挑选麻风树种子经消毒后，取出完整的胚和子叶，于MS 培养基萌发，获得子叶，切制成外植体；农杆菌菌液是用C 13A液体培养基重悬浮离心收集 的农杆菌体制得。
4.如权利要求3所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于所述 第(1)步骤中，获得麻风树外植体工艺中，接种于MS培养基萌发，是将接好的材料先暗培养 2-4天，然后光照培养10-12天，种子萌发的培养条件是，温度23-26°C，光照12-16小时/ 天，光照强度1800-20001X ；所述第(1)步骤中，农杆菌菌液的准备、浸染及共培养，进一步 包括以下工艺步骤(a)挑取农杆菌的单克隆于含有抗生素的YEP液体培养基中，28°C，200rpm震荡培养 20-24小时，然后按照1 100转接，震荡培养至对数生长期，0D600 = 0. 8-1. 0，将菌液转 入50ml离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，用C13A液体培养基重新悬浮农杆菌， 调至0D600 = 0. 3-0. 6，28°C震荡培养1-2个小时，备用；(b)将切好的叶片放入容器中，加入准备好的菌液，置于摇床慢速震荡5-15分钟；以及(c)取出浸染过的材料，倒掉菌液，将叶片放在滤纸上，吸去多余的菌液，接入C13A固 体培养基，置于23-26°C黑暗共培养2-4天。
5.如权利要求1所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于所述 第(2)步骤的筛选培养基为C13PC培养基，其含有1. 0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/ L 3-吲哚丁酸，l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠的MS培养基。
6.如权利要求5所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于所述 第(2)步骤进一步包括以下工艺步骤(a)取出共培养后的外植体，放入容器中，加入无菌水洗后，用含250-500mg/L头孢霉 素的无菌水洗；(b)洗过的外植体放在滤纸上，吸去多余的水，接入筛选培养基C13PC，所述筛选培养 基C 13PC是指MS培养基含1. 0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. 0mg/L3-吲哚丁酸，l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠，2-3%蔗 糖，0.7%琼脂，以及pH5. 8-6.0)；以及(c)置于23-26°C暗培养14-21天，获得抗性愈伤组织。
7.如权利要求1所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于所述第(3)步骤，是将获得的抗性愈伤组织，转入分化培养基SR13PC进行培养，该分化培养基含 l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素。
8.如权利要求7所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于所述 第(3)步骤的分化培养基为SR13PC培养基，是MS培养基含0. 25-2. Omg/L 6-苄基嘌呤， 0. 1-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L 赤霉素，l_3mg/L 草胺磷或 l-10mg/L 潮霉素， 250-500mg/L头孢霉素，20-30g/L蔗糖，7g/L琼脂，以及pH5. 8-6. 0 ；接好的抗性愈伤组织在 23-26°C，光照培养10-60天即可得到不定芽，培养条件为，光照12-16小时/天，光照强度 1800-20001x。
9.如权利要求1所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于所述 第(4)步骤进一步包括以下工艺步骤将分化出的不定芽在0. 1-1. Omg/L的3-吲哚丁酸溶 液中浸泡2-10分钟后，接种到1/2MS培养基进行生根培养，生根培养条件为，23-26°C，光照 12-16小时/天，光照强度1800-20001X，从而获得转基因植株。
10.如权利要求1-9中任一项所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特 征在于所述农杆菌携带有目的基因。
全文摘要
本发明涉及农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，包括以下步骤制备麻风树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养；共培养后的外植体接入筛选培养基C13PC进行培养，从而获得抗性愈伤组织，该筛选培养基C13PC含有1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素；将得到的抗性愈伤组织转入分化培养基，分化出不定芽；经生根培养，获得转基因植株。利用本发明转基因方法成功导入功能基因，对野生麻风树进行遗传改良。转化效率可达10％左右甚至10％以上，转基因性遗传稳定，成本低廉，且麻风树离体再生系统稳定性好，操作简便，再生效率高，从愈伤组织的诱导到再生植株的获得只需要80-90天。
文档编号A01H5/00GK101857875SQ20101019371
公开日2010年10月13日 申请日期2010年6月7日 优先权日2010年6月7日
发明者孙怀娟, 李凝, 李耿光, 王梅珍 申请人:普罗米绿色能源(深圳)有限公司